股骨頭壞死愈膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究 *

馬依林 于紅 孫實(shí) 吳曉龍

(河南省洛陽正骨醫(yī)院/河南省骨科醫(yī)院，河南 洛陽 471002)

股骨頭壞死是臨床常見的骨科疑難疾病。由于該病中后期造成的髖關(guān)節(jié)功能障礙較為嚴(yán)重，不宜采取手術(shù)治療的患者較多，且手術(shù)治療的遠(yuǎn)期效果不盡如人意[1-2]。在股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制尚不明確的情況下，中醫(yī)藥防治股骨頭壞死研究受到廣泛關(guān)注[3]。中醫(yī)藥典籍中雖無股骨頭壞死這一病名的直接記載，但根據(jù)各醫(yī)家[4-10]對該病發(fā)病原因的認(rèn)識，股骨頭壞死發(fā)病機(jī)制可以歸納為：肝腎虧虛為其本，血瘀痰阻為其標(biāo),為本虛標(biāo)實(shí)之證。血行脈中，主濡潤，亦靠腎精之補(bǔ)充，賴腎氣之推動，若腎虛精虧氣化失常，則充髓生骨能力不足,推動血行能力降低，以致髓枯骨痿，血行遲緩而瘀滯，股骨頭失去氣血溫煦與濡養(yǎng)而壞死，成為股骨頭壞死的內(nèi)在根源。

股骨頭壞死愈膠囊是非物質(zhì)文化遺產(chǎn)“平樂郭氏正骨”的傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)方，后經(jīng)開發(fā)研制成為河南省洛陽正骨醫(yī)院(河南省骨科醫(yī)院)的醫(yī)院制劑(制劑批準(zhǔn)文號：豫藥制字Z20120237)。該制劑主要由丹參、續(xù)斷、當(dāng)歸、血竭、雞血藤等十六味中藥組成，功效為補(bǔ)益肝腎，益氣活血，溫通經(jīng)絡(luò)，對肝腎兩虛、氣虛血瘀型股骨頭壞死有極好的療效[11]。該藥也可通過抑制BMSCs的凋亡、增加VEGF表達(dá)、提高BGP與CT水平、降低全血及血漿黏度、提高壞死骨的力學(xué)強(qiáng)度等機(jī)制防止股骨頭壞死的發(fā)生和發(fā)展[12]。

為提高股骨頭壞死愈膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜(TLC)對復(fù)方制劑中丹參、桂枝、補(bǔ)骨脂進(jìn)行定性鑒別；血竭資源稀缺且價格昂貴，血竭素為血竭的代表性成分，具有抗炎、抗血小板聚集等多種生物活性，但隨著溫度的升高會導(dǎo)致血竭素降解[13-14]，因此用高效液相色譜(HPLC)對血竭素進(jìn)行含量測定。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters Alliance型高效液相色譜儀，配備e2695型四元低壓分離單元、2998型PDA檢測器及Empower 3工作站(美國Waters公司)；BSA2202S電子分析天平(德國Sartorius公司)；AB135-S和MS204S電子分析天平(德國Mettler Toledo公司)；KH-600DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；薄層色譜硅膠預(yù)制板G板；暗箱式紫外分析儀(ZF-7N上海嘉鵬科技有限公司)。

1.2試藥 丹參對照藥材(批號：120923-201615)、丹參酮ⅡA對照品(批號：110766-201721)、血竭對照藥材(批號：120906-201611)、血竭素高氯酸鹽對照品(批號：110811-201707)、桂枝對照藥材(批號：121191-201605)、補(bǔ)骨脂對照藥材(批號：121056-201605)、異補(bǔ)骨脂素對照品(批號：110738-201313)。均購自中國食品藥品檢定研究院。股骨頭壞死愈膠囊(豫藥制字Z20120237，河南省洛陽正骨醫(yī)院配制)，批號為20200209、20200407、20200507共3個批次；甲醇、乙腈為色譜純(美國TEDIA公司)，磷酸、磷酸氫二鈉為分析純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1TLC鑒別

2.1.1丹參的TLC鑒別 取股骨頭壞死愈膠囊4 g，研細(xì)，加醋酸乙酯30 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)訜o水乙醇1 mL使溶解，取上清液作為供試品溶液。取丹參對照藥材0.5 g，同法制得對照藥材溶液。另取丹參酮ⅡA對照品，加無水乙醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作為對照品溶液。再按處方比例稱取缺丹參的陰性制劑4 g，照供試品溶液的制備方法制備，作為丹參陰性對照溶液，照TLC法吸取上述四種溶液各4 μL分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯—氯仿—醋酸乙酯(10∶2∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干。供試品色譜中，在與對照藥材、對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。見圖1。

圖1 丹參的薄層色譜圖

2.1.2桂枝的TLC鑒別 取股骨頭壞死愈膠囊10 g，研細(xì)，置燒瓶中，加水適量，連接揮發(fā)油測定器，照《中國藥典》2020年版四部通則2204(揮發(fā)油測定法甲法)[15]，自上端加水至刻度，再加石油醚(60～90℃)1 mL，連接冷凝器，加熱，保持微沸0.5 h，放冷，取出石油醚層作為供試品溶液。另取桂枝對照藥材0.5 g，加乙醚10 mL浸泡0.5 h，時時振搖，濾過，濾液揮干，殘?jiān)哟姿嵋阴? mL使溶解，作為對照藥材溶液。再按處方比例稱取缺桂枝的陰性制劑10 g，照供試品溶液的制備方法制備，作為桂枝陰性對照溶液，照TLC法吸取上述三種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)—醋酸乙酯(8.5∶1.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以二硝基苯肼試液。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙紅色斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。見圖2。

圖2 桂枝的薄層色譜圖

2.1.3補(bǔ)骨脂的TLC鑒別 取股骨頭壞死愈膠囊4 g，研細(xì)，加乙醚30 mL，浸泡過液，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液。取補(bǔ)骨脂藥材1 g,同法制得對照藥材溶液。另取異補(bǔ)骨脂素對照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對照品溶液。再按處方比例稱取缺補(bǔ)骨脂的陰性制劑4 g，同供試品溶液的制備方法，制得補(bǔ)骨脂陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2020年版四部，通則0502)試驗(yàn)，吸取上述四種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯(4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%氫氧化鉀甲醇溶液，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，與對照藥材色譜、對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的淡藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。見圖3。

圖3 補(bǔ)骨脂的薄層色譜圖

2.2血竭素的含量測定

2.2.1色譜條件 Kromosail 100-5-C18色譜柱，乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液(35∶65)為流動相，檢測波長440 nm，柱溫40℃，流速1 mL·min-1。進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2對照品溶液制備 精密稱取血竭素對照品適量，分別加入甲醇和3%磷酸甲醇配制成質(zhì)量濃度為10.38及41.68μg·mL-1的對照品儲備溶液,置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3供試品溶液及陰性對照溶液的制備 取股骨頭壞死愈膠囊樣品約0.5 g，精密稱定，精密加入3%磷酸甲醇溶液10 mL，稱定重量，振搖5 min后再稱定，以3%磷酸甲醇溶液補(bǔ)足減失重量，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。同時依現(xiàn)有工藝制備缺血竭的陰性樣品，同法提取得缺血竭陰性樣品供試品溶液。

2.2.4專屬性考察 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，按照色譜條件進(jìn)行測定，典型色譜圖見圖4。由圖4可看出，供試品中各成分分離度良好，陰性樣品中各色譜峰的存在對目標(biāo)成分的測定無干擾。

圖4 血竭素HPLC色譜圖

2.2.5線性關(guān)系考察 將血竭素對照品儲備溶液稀釋為系列濃度對照品溶液，各吸取10μL注入液相色譜儀，按照色譜條件進(jìn)行測定，并以對照品濃度為橫坐標(biāo)(X)，對照品峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到回歸方程結(jié)果顯示兩種組分峰面積積分值與進(jìn)樣濃度之間線性關(guān)系良好，見表1。

表1 血竭素線性關(guān)系考察表

2.2.7精密度試驗(yàn) 精密吸取血竭素對照品儲備溶液10 μL，并按照色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測定色譜峰面積RSD分別為1.26%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.8穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別各取同一血竭素供試品溶液，并按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測定。結(jié)果顯示16 h內(nèi)，供試品溶液中血竭素峰面積穩(wěn)定，RSD為1.34%，結(jié)果表明供試品溶液在16 h之內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次股骨頭壞死愈膠囊樣品6份，按“2.2.3”項(xiàng)下所示方法制備血竭素供試品溶液，并按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算樣品含量。測得血竭素的平均含量為165.50 mg·g-1，RSD為1.47%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.10回收率試驗(yàn) 分別精密稱取同一批已知含量股骨頭壞死愈膠囊各6份，測定血竭素樣品每份0.25 g，并隨機(jī)分為3組，每組分別精密加入低、中、高濃度的對照品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下所示方法分別制備血竭素供試品溶液，并按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，依據(jù)所得結(jié)果計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示血竭素平均回收率為99.46%，RSD=1.38%，結(jié)果表明建立的方法準(zhǔn)確度良好。見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.11樣品含量測定 取三批樣品按照上述樣品制備方法處理，按“2.2.1”色譜條件測定，樣品含量按干燥品計(jì)算。結(jié)果見表3。

表3 血竭素含量測定結(jié)果

3 討論

3.1薄層色譜鑒別 本處方中補(bǔ)骨脂入肝腎，補(bǔ)肝益腎、強(qiáng)筋骨，與杜仲、續(xù)斷、黃芪共為君藥；丹參，活血祛瘀止痛，為臣藥；桂枝溫經(jīng)通脈、助陽化氣，為佐藥[16]。本次實(shí)驗(yàn)選取君臣佐各一味藥，由于該三味藥材均為方中可直接影響療效的重要藥味，因此采用薄層色譜鑒別法進(jìn)行定性鑒別。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所選條件能夠使方中丹參、桂枝、補(bǔ)骨脂三味藥材的色譜斑點(diǎn)清晰，附近無雜質(zhì)斑點(diǎn)干擾，專屬性較強(qiáng)，其方法簡便、快捷、準(zhǔn)確。因此采用該方法能較好地控制全方的質(zhì)量，確保療效，可作為股骨頭壞死愈膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的定性方法。

3.2高效液相色譜條件 本處方中血竭能夠活血化瘀止痛，止血斂創(chuàng)生肌，雖用量較少但是作用十分重要。血竭作為進(jìn)口貴重藥材，由于進(jìn)口藥材來源有限，中藥材市場常有偽劣品出現(xiàn)[17]。血竭素為血竭中主要化學(xué)成分，可作為定量指標(biāo)，采用高效液相色譜法來檢測處方中的血竭素含量，以此來保障制劑工藝及質(zhì)量。

3.2.1檢測波長的選擇 采用PDA檢測器對血竭素對照品溶液在200～450 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果在440 nm有最大吸收，故采用該波長分別作為檢測波長。

3.2.2供試品前處理方法的選擇 針對血竭素，通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[18-20]，選擇以3%磷酸甲醇為提取溶劑，首先考察了振搖提取和超聲提取的差別，發(fā)現(xiàn)超聲提取時干擾化合物較多，而且提取效率較振搖提取并沒有顯著性差異，因此最終選擇以振搖提取的方式制備供試品溶液。隨后對不同振搖時間(3 min、5 min、10 min)進(jìn)行了考察，最終選定了振搖5 min為最優(yōu)提取條件。

3.3.3流動相的選擇 分別對不同比例的有機(jī)相(甲醇、乙腈)以及水相(水、0.02%～0.3%磷酸溶液、0.05 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液)進(jìn)行了考察，最終確定血竭素以乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鈉(35∶65)為流動相，待測成分能夠達(dá)到極限分離且峰形良好，陰性無干擾。