miR-27調(diào)控SOD2對乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響

楊鋼 郭爽黎 錦楊桂（武漢大學(xué)中南醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，武漢430071）

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率較高，嚴(yán)重威脅女性身體和生命健康。近年新出現(xiàn)的靶向治療特異性強(qiáng)、毒副作用小，在腫瘤治療中取得了突破性進(jìn)展，新特異性治療靶點(diǎn)是其研究重點(diǎn)［1-2］。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼RNA，可作為腫瘤原癌基因或抑制基因調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移［3］。如miR-34a過表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力［4］；上調(diào)miR-155-5p表達(dá)，乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲與遷移能力增強(qiáng)［5］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-27在乳腺癌組織中高表達(dá)，與乳腺癌惡性程度及預(yù)后有關(guān)，可作為乳腺癌新的預(yù)后指標(biāo)及治療靶點(diǎn)［6-7］。但miR-27對乳腺癌進(jìn)展的影響及其機(jī)制尚未闡明。

超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）是一種抗氧化基因，是SOD家族成員，具有抗腫瘤作用，其高表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞清除活性氧的能力，抑制腫瘤生長及惡性表型［8］。研究發(fā)現(xiàn)，SOD2在乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)［9］。但SOD2對乳腺癌的影響尚未闡明。本文旨在研究miR-27對乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響及機(jī)制是否與SOD2相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料乳腺癌MCF-7細(xì)胞系購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；乳腺癌組織和癌旁組織取自我院腫瘤科患者標(biāo)本；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰 蛋 白 酶（美 國Hyclone公 司）；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒、Trizol試劑、SYBR green試劑盒（美國Invitrogen公司）；BCA試劑盒、RIPA蛋白裂解液（美國Thermo scientific公司）；CyclinD1抗體、p21抗體、MMP-2抗體、E-cadherin抗體、SOD2抗體、GAPDH抗體、羊抗兔IgG-HRP購自北京博奧森生物科技有限公司；MTT試劑盒（上海碧云天公司）；Transwell小室、Matrigel膠（美國BD公司）；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒（北京Solarbio公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)DMEM培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清和抗生素進(jìn)行乳腺癌MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)，37℃、5%CO2，每1～2 d換液1次，待細(xì)胞80%融和時(shí)，加入0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組250μl無血清Opti-MEM培養(yǎng)基中加入10μl LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑，混勻，室溫孵育5 min；100μl Opti-MEM無血清培養(yǎng)基分別加入miR-27陰性對照質(zhì)粒、miR-27抑制表達(dá)載體質(zhì)粒、miR-27陽性對照質(zhì)粒、miR-27模擬物、SOD2陽性對照質(zhì)粒、SOD2過表達(dá)載體質(zhì)粒、miR-27抑制表達(dá)載體質(zhì)粒與SOD2陰性對照質(zhì)粒miR-27抑制表達(dá)載體質(zhì)粒與SOD2抑制表達(dá)載體質(zhì)粒，混勻，室溫孵育5 min，分別命名為anti-miR-NC組、antimiR-27組、miR-NC組、miR-27組、pcDNA3.1組、pcDNA3.1-SOD2組、anti-miR-27+si-NC組、anti-miR-27+si-SOD2組。將上述轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒的液體充分混合，室溫孵育20 min，分別加入含有目的細(xì)胞的6孔板，37℃、5%CO2、95%相對濕度培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染6 h后將培養(yǎng)液更換為新鮮完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞備用。

1.2.3 qRT-PCR檢 測miR-27表 達(dá)Trizol法 提 取乳腺癌組織、癌旁組織及anti-miR-NC組、anti-miR-27組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度發(fā)測定RNA純度和濃度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按熒光定量試劑盒說明進(jìn)行操作，各樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)條件為95℃30 s，60℃30 s；72℃30 s，共40個(gè)循環(huán)；60℃延長5 min。2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.2.4 Western blot檢測CyclinD1、P21、MMP-2、Ecadherin、SOD2蛋白表達(dá)提取細(xì)胞總蛋白，測量濃度，電泳90 min，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉90 min，加入兔抗人CyclinD1抗體、兔抗人p21抗體、兔抗人MMP-2抗體、兔抗人E-cadherin抗體、兔抗人SOD抗體、兔抗人GAPDH抗體，所有抗體按1：800稀釋，4℃孵育過夜；TBST洗膜，加入羊抗兔IgGHRP（1：1 000）二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次5～10 min，顯影，定影，Quantity One凝膠分析軟件處理，測量各條帶吸光度，蛋白相對表達(dá)水平以目的條帶和GAPDH條帶比值表示，各樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.5 MTT檢測細(xì)胞增殖活性anti-miR-NC組、anti-miR-27組、pcDNA3.1組、pcDNA3.1-SOD2組、anti-miR-27+si-NC組、anti-miR-27+si-SOD2組 細(xì) 胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，分別加入20 μl MTT溶液（5 g/L），37℃、5%CO2孵育4 h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)上清，150 μl/孔加入DMSO，振蕩10 min，充分融解，酶標(biāo)儀檢測波長490 nm處吸光度。細(xì)胞活性（%）=OD實(shí)驗(yàn)組/OD空白對照組×100%。

1.2.6 Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲胰酶消化anti-miR-NC組、anti-miR-27組、pcDNA3.1組、pcDNA3.1-SOD2組、anti-miR-27+si-NC組、anti-miR-27+si-SOD2組細(xì)胞，無血清DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度為5×105個(gè)/ml。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：取100μl細(xì)胞懸液接種于Transwell上室，下室加入含10%FBS的培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，取出小室，去除培養(yǎng)液，PBS清洗2次，棉簽輕輕擦去上層細(xì)胞，PBS清洗2次，風(fēng)干，加入4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡觀察并拍照，染色細(xì)胞數(shù)即為遷移細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：將60μl Matrigel膠加入300 μl無血清DMEM培養(yǎng)液中混勻，取100 μl鋪于Transwell小室上室，37℃成膠，按照細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)步驟操作。顯微鏡下觀察染色細(xì)胞數(shù)即為侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.7 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測miR-27和SOD2的靶向關(guān)系TargetScan數(shù)據(jù)庫顯示，SOD2 3′UTR區(qū)與miR-27存在結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體WT-SOD2和MUT-SOD2，LipofectamineTM2000將WT-SOD2和MUT-SOD2分 別 與miR-NC和miR-27共轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞。按照說明書檢測熒光活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-27在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)與癌旁組織（0.25±0.02）相比，乳腺癌組織中miR-27表達(dá)顯著升高（0.86±0.08，P＜0.05），提示乳腺癌組織中miR-27呈高表達(dá)。

2.2 抑制miR-27表達(dá)對MCF-7細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響與anti-miR-NC組相比，anti-miR-27組miR-27表達(dá)顯著降低，CyclinD1、MMP-2蛋白表達(dá)顯著降低，P21、E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高，細(xì)胞活性顯著降低，遷移和侵襲數(shù)顯著減少（P＜0.05，表1、圖1），提示抑制miR-27表達(dá)可抑制MCF-7細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

圖1 抑制miR-27表達(dá)對MCF-7細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（×200）Fig.1 Effect of inhibition expression of miR-27 on proliferation，migration，invasion and expression of related proteins of MCF-7 cel（l×200）

表1 抑制miR-27表達(dá)對MCF-7細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響（±s，n=9）Tab.1 Effect of inhibition of miR-27 expression on proliferation，migration and invasion of MCF-7 cell（±s，n=9）

表1 抑制miR-27表達(dá)對MCF-7細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響（±s，n=9）Tab.1 Effect of inhibition of miR-27 expression on proliferation，migration and invasion of MCF-7 cell（±s，n=9）

Note：Compared with anti-miR-NC group，1）P＜0.05.

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2.3 miR-27靶向調(diào)控SOD2 TargetScan預(yù)測顯示，SOD2和miR-27存在結(jié)合位點(diǎn)（圖2A）。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-27組轉(zhuǎn)染野生型SOD2表達(dá)載體WT-SOD2后，乳腺癌細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；而突變型SOD2表達(dá)載體MUT-SOD2后，乳腺癌細(xì)胞的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。Western blot結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-27組SOD2表達(dá)顯著降低；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-27組SOD2表達(dá)顯著升高（P＜0.05，圖2B、表3）。提示miR-27可靶向調(diào)控SOD2表達(dá)。

表2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（±s，n=9）Tab.2 Dual luciferase reporter experiment（±s，n=9）

表2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（±s，n=9）Tab.2 Dual luciferase reporter experiment（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

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表3 miR-27調(diào)控SOD2表達(dá)（±s，n=9）Tab.3 miR-27 regulates expression of SOD2（±s，n=9）

表3 miR-27調(diào)控SOD2表達(dá)（±s，n=9）Tab.3 miR-27 regulates expression of SOD2（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05；compared with antimiR-NC group，2）P＜0.05.

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圖2 miR-27靶向調(diào)控SOD2Fig.2 miR-27 targeting regulates SOD2

2.4 過表達(dá)SOD2對MCF-7細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-SOD2組CyclinD1、MMP-2蛋白表達(dá)顯著降低，SOD2、P21、Ecadherin蛋白表達(dá)顯著升高，細(xì)胞活性、遷移和侵襲數(shù)顯著減少（P＜0.05，圖3、表4），提示過表達(dá)SOD2可抑制MCF-7細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

表4 過表達(dá)SOD2對MCF-7細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響（±s，n=9）Tab.4 Effect of overexpression of SOD2 on proliferation，migration and invasion of MCF-7 cells（±s，n=9）

表4 過表達(dá)SOD2對MCF-7細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響（±s，n=9）Tab.4 Effect of overexpression of SOD2 on proliferation，migration and invasion of MCF-7 cells（±s，n=9）

Note：Compared with pcDNA3.1 group，1）P＜0.05.

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圖3 過表達(dá)SOD2對MCF-7細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（×200）Fig.3 Effect of overexpression of SOD2 on proliferation，migration and invasive proteins expressions of MCF-7 cells（×200）

2.5 抑制SOD2表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制miR-27對MCF-7細(xì)胞增殖的影響與anti-miR-NC組相比，anti-miR-27組CyclinD1蛋白表達(dá)顯著降低，SOD2、P21蛋白表達(dá)顯著升高，細(xì)胞活性顯著降低（P＜0.05）；與anti-miR-27+si-NC組 相 比，anti-miR-27+si-SOD2組CyclinD1蛋白表達(dá)顯著升高，SOD2、P21蛋白表達(dá)顯著降低，細(xì)胞活性顯著升高（P＜0.05，表5、圖4）。提示抑制SOD2表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制miR-27對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用。

圖4 抑制SOD2表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制miR-27對MCF-7細(xì)胞增殖蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Inhibition of SOD2 expression reversed effect of inhibiting miR-27 on expression of proliferating protein in MCF-7 cells

表5 抑制SOD2表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制miR-27對MCF-7細(xì)胞增殖的影響（±s，n=9）Tab.5 Inhibition of SOD2 expression reverse effect of inhibiting miR-27 on proliferation of MCF-7 cells（±s，n=9）

表5 抑制SOD2表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制miR-27對MCF-7細(xì)胞增殖的影響（±s，n=9）Tab.5 Inhibition of SOD2 expression reverse effect of inhibiting miR-27 on proliferation of MCF-7 cells（±s，n=9）

Note：Compared with anti-miR-NC group，1）P＜0.05；compared with anti-miR-27+si-NC group，2）P＜0.05.

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2.6 抑制SOD2表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制miR-27對MCF-7細(xì)胞遷移、侵襲的影響與anti-miR-NC組相比，antimiR-27組MMP-2蛋白表達(dá)顯著降低，E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高，細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)顯著減少（P＜0.05），與anti-miR-27+si-NC組相比，anti-miR-27+si-SOD2組MMP-2蛋白表達(dá)顯著升高，E-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低，細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)顯著增多（P＜0.05，圖5、表6）。提示抑制SOD2表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制miR-27對MCF-7細(xì)胞遷移、侵襲的抑制作用。

圖5 抑制SOD2表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制miR-27對MCF-7細(xì)胞遷移、侵襲及蛋白表達(dá)的影響（×200）Fig.5 Inhibition of SOD2 expression reversed effect of miR-27 on migration，invasion and proteins expressions of MCF-7 cells（×200）

表6 抑制SOD2表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制miR-27對MCF-7細(xì)胞遷移、侵襲的影響（±s，n=9）Tab.6 Inhibition of SOD2 expression reversed effect of inhibiting miR-27 on migration and invasion of MCF-7 cells（±s，n=9）

表6 抑制SOD2表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制miR-27對MCF-7細(xì)胞遷移、侵襲的影響（±s，n=9）Tab.6 Inhibition of SOD2 expression reversed effect of inhibiting miR-27 on migration and invasion of MCF-7 cells（±s，n=9）

Note：Compared with anti-miR-NC group，1）P＜0.05；compared with anti-miR-27+si-NC group，2）P＜0.05.

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3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的重要原因，miRNA可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)控乳腺癌細(xì)胞生長、凋亡、遷移、侵襲等過程［6］。研究報(bào)道，miR-27a上調(diào)可促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞遷移、侵襲和血管生成［10］。miR-27過表達(dá)可促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖，加快細(xì)胞周期進(jìn)程及細(xì)胞遷移和侵襲［11］。miR-27在浸潤性乳腺癌中顯著上調(diào)，與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)［12］。提示miR-27及miR-27a參與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，但miR-27對乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制尚未闡明。本研究顯示，乳腺癌組織中miR-27表達(dá)顯著升高，提示miR-27在乳腺癌中可能起促癌基因作用。本研究轉(zhuǎn)染miR-27抑制表達(dá)載體，結(jié)果顯示，細(xì)胞活性、遷移和侵襲數(shù)顯著降低，說明抑制miR-27表達(dá)抑制MCF-7細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）參與細(xì)胞周期進(jìn)展，過表達(dá)CyclinD1通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期失調(diào)影響乳腺癌細(xì)胞生長［13］。P21是一種抑癌基因，在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，具有抑癌作用［14］。研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinases，MMP-2）主要通過降解細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)細(xì)胞侵襲，MMP-2異常表達(dá)與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及增殖、浸潤轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)［15］。E-鈣黏蛋白（E-cadherin）通過調(diào)控細(xì)胞黏附作用影響細(xì)胞轉(zhuǎn)移，與乳腺癌病理分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移 有關(guān)［16］。本研究 抑制miR-27表 達(dá)，CyclinD1、MMP-2蛋白表達(dá)降低，P21、E-cadherin蛋白表達(dá)升高，進(jìn)一步表明抑制miR-27表達(dá)可抑制MCF-7細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

研究報(bào)道，肝癌組織中SOD2呈低表達(dá)，與肝癌分期、大小、血管侵犯等惡性生物學(xué)行為有關(guān)［17］。SOD2在胃癌中呈高表達(dá)，沉默SOD2表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞增殖［18］。說明SOD2參與多種腫瘤進(jìn)展，但其作用可能因不同腫瘤有所不同。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者中SOD2活性較低，葉黃素通過誘導(dǎo)抗氧化酶SOD2表達(dá)和降低氧化應(yīng)激水平抑制乳腺癌細(xì)胞活力［19］。本研究顯示，過表達(dá)SOD2，細(xì)胞活性、遷移和侵襲數(shù)顯著降低，且CyclinD1、MMP-2蛋白表達(dá)降低，P21、E-cadherin蛋白表達(dá)升高。說明過表達(dá)SOD2可抑制MCF-7細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。此外，研究發(fā)現(xiàn)，GClnc1通過激活SIRT3/FOXO3/SOD2信號通路促進(jìn)胃癌SGC7901細(xì)胞增殖和遷移［20］。miR-146a通過減少SOD2抑制上皮性卵巢癌的增殖并增強(qiáng)其化學(xué)敏感性［21］。本研究發(fā)現(xiàn)miR-27可靶向調(diào)控SOD2表達(dá)，抑制SOD2表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制miR-27對乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖、遷移、侵襲的抑制作用，提示miR-27可能通過調(diào)控SOD2表達(dá)影響乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，miR-27可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制可能與靶向調(diào)控SOD2表達(dá)有關(guān)，為乳腺癌防治提供新靶點(diǎn)。