基于生物信息學分析miR-130b-3p在腎透明細胞癌中的表達、靶基因及預后價值①

鄒元章 盧俅 陳兵海（江蘇大學附屬醫(yī)院泌尿外科，鎮(zhèn)江212001）

miRNA是長度約為22個堿基的一類非編碼單鏈小分子RNA，可通過結合mRNA靶基因的3'非編碼區(qū)（3'UTR）導致靶標降解或抑制該mRNA翻譯［1］。miRNA通過負調(diào)節(jié)細胞過程相關基因參與細胞周期調(diào)節(jié)、應激反應以及細胞分化、增殖、侵襲、遷移和凋亡等過程［2-4］。因此，miRNA涉及細胞內(nèi)信號轉導通路的多個方面。近年，miRNA在人類疾病尤其腫瘤中的作用不斷被揭示，研究已表明大量miRNA在腫瘤組織中異常表達，并在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用［5-6］。

miR-130b-3p（曾為hsa-miR-130b）位于人染色體22q11.22區(qū)，研究顯示，miR-130b-3p在乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌等多種腫瘤中表達異常，并參與腫瘤發(fā)展，有望成為以上腫瘤治療靶點及預后生物標志物［7-10］。此外，研究報道，miR-130b-3p在腎透明細胞癌（renal clear cell carcinoma，KIRC）組織和細胞系中表達上調(diào)，且可促進腎癌細胞遷移、增殖，抑制其凋亡，因而有望成為KIRC的診斷標志物和治療靶點［11］。但miR-130b-3p在KIRC中的調(diào)控靶基因和預后價值尚未明確。因此，本研究通過生物信息學方法分析miR-130b-3p在KIRC中的表達水平、靶基因及預后意義，為進一步探索miR-130b-3p在KIRC中的作用機制和臨床應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 miR-130b-3p的注釋信息查詢miRBase數(shù)據(jù)庫是在線開放的microRNA序列和注釋資源庫，其最新版本包含來自271個生物的miRNA序列，包括38 589個miRNA前體和48 860個成熟體［12］。采用miRBase數(shù)據(jù)庫查詢miR-130b-3p在不同生物中的序列和注釋信息。

1.2 miR-130b-3p在腫瘤組織中的表達分析db-DEMC2.0數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.picb.ac.cn/db-DEMC/）整合了GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫的209個數(shù)據(jù)集，儲存了在36種腫瘤中差異表達的2 224個miRNA。UCSC（https：//genome.ucsc.edu/）數(shù)據(jù)庫包含TCGA和GDC的腫瘤數(shù)據(jù)，可提供數(shù)據(jù)下載和實現(xiàn)數(shù)據(jù)在線可視化。本研究采用dbDEMC2.0數(shù)據(jù)庫分析miR-130b-3p在人類腫瘤組織和正常組織中的表達情況；從UCSC數(shù)據(jù)庫下載KIRC及相應正常樣本的miRNA表達數(shù)據(jù)，提取miR-130b-3p的表達數(shù)據(jù)并分析其表達差異。

1.3 miR-130b-3p的靶基因預測UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/）數(shù)據(jù)庫包含的預測靶基因源于microRNA.org平臺和miRDB數(shù)據(jù)庫，StarBase3.0（http：//starbase.sysu.edu.cn/）數(shù)據(jù)庫獲得的預測靶基因來源于microT、miRanda、miRmap、PITA、RNA22、PicTar、TargetScan等數(shù)據(jù)庫或平臺。通過UALCAN和StarBase3.0數(shù)據(jù)庫獲取miR-130b-3p在KIRC中的預測靶基因，其中UALCAN數(shù)據(jù)庫選擇靶基因條件為down-reg，StarBase3.0數(shù)據(jù)庫選擇與miR-130b-3p表達負相關的基因，取兩者交集作為其靶基因集合用于后續(xù)分析。

1.4 miR-130b-3p靶基因的功能和通路富集分析Metascape整合了GO、KEGG、UniProt和Drug-Bank等多個權威數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)資源，是多功能的基因功能注釋分析工具［13］。將miR-130b-3p靶基因集導入Metascape，設置人類基因組作為背景基因，其他選擇默認進行GO和KEGG富集分析，KEGG分析結果采用R軟件（3.6.2）以散點圖展示。

1.5 miR-130b-3p預后分析Kaplan-Meier Plotter（https：//kmplot.com/）是基于GEO、EGA和TCGA臨床樣本分析mRNA、lncRNA、miRNA的預后常用的在線平臺。本研究采用Kaplan-Meier Plotter分析miR-130b-3p在KIRC患者中的預后價值。

2 結果

2.1 miR-130b-3p在染色體的定位和物種間的保守性miRBase數(shù)據(jù)庫查詢結果如表1，miR-130b-3p位于人染色體22q11.22區(qū)，其堿基序列為5′-CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU-3′；與山羊、小家鼠、豬、獼猴等共11個物種序列進行比對，發(fā)現(xiàn)miR-130b-3p序列在11個物種中完全一致，表明miR-130b-3p在物種間具有高度保守性。

表1 不同物種miR-130b-3p成熟體序列Tab.1 Mature sequence of miR-130b-3p in different species

2.2 miR-130b-3p在人類腫瘤和KIRC組織中的表達dbDEMC2.0數(shù)據(jù)庫分析miR-130b-3p在各腫瘤中的表達情況，結果顯示，miR-130b-3p在腎癌、乳腺癌等多種腫瘤中表達上調(diào)，而在淋巴瘤、胰腺癌等腫瘤中表達下調(diào)（圖1A）；腫瘤分級比較結果顯示，miR-130b-3p在腎癌高分級與低分級中的差異最為顯著（圖1B）。進一步分析miR-130b-3p在KIRC的表達，結果顯示，miR-130b-3p在KIRC組織較正常組織表達上調(diào)，且隨腫瘤分級增加而升高，差異具有統(tǒng)計學意義（圖1C、D）。

圖1 miR-130b-3p在人類腫瘤和KIRC中的表達Fig.1 Expression of miR-130b-3p in human cancers and KIRC

2.3 miR-130b-3p在KIRC中的靶基因UALCAN數(shù)據(jù)庫獲得195個miR-130b-3p在KIRC中的預測靶基因，StarBase3.0數(shù)據(jù)庫獲得1 224個預測靶基因，取兩者交集得到靶基因集，包含87個靶基因，其中NR3C2、PAK6和HSPA8為免疫相關基因，HSPA8、RAB5A、ITPR1為自噬相關基因（表2）。

表2 miR-130b-3p在KIRC中的靶基因集Tab.2 Target gene set of miR-130b-3p in KIRC

2.4 miR-130b-3p靶基因的GO功能和KEGG通路富集分析GO功能富集分析結果顯示，miR-130b-3p靶基因在KIRC主要涉及細胞自噬、頂樹突發(fā)育、磷脂酰肌醇生物合成過程、肌動蛋白細胞骨架形成等生物過程（圖2A）；KEGG通路富集分析顯示，miR-130b-3p靶基因參與甲狀腺激素合成信號通路、肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)信號通路以及Ras信號通路等（圖2B）。

圖2 miR-130b-3p靶基因GO和KEGG富集分析Fig.2 GO and KEGG enrichment analysis of miR-130b-3p target genes

2.5 miR-130b-3p與KIRC患者預后不良相關生存分析結果顯示，miR-130b-3p表達與KIRC患者預后顯著相關，miR-130b-3p高表達患者總生存期明顯低于低表達患者（圖3），表明miR-130b-3p有望成為KIRC患者的預后標志物。

圖3 miR-130b-3p在KIRC中的Kaplan-Meier生存曲線Fig.3 Kaplan-Meier curve of miR-130b-3p in KIRC

3 討論

本研究通過生物信息學方法發(fā)現(xiàn)miR-130b-3p序列在物種間具有高度保守性，提示miR-130b-3p在物種進化和調(diào)控靶基因中可能起關鍵作用。另外，對miR-130b-3p在腫瘤組織中的表達分析發(fā)現(xiàn)，miR-130b-3p在腎癌、乳腺癌等多種腫瘤中表達上調(diào)，而在淋巴瘤、胰腺癌等腫瘤中表達下調(diào)，提示miR-130b-3p在不同腫瘤中的作用可能不完全相同，甚至相反。文獻報道，miR-130b-3p以癌癥類型依賴性方式具有致癌和抑癌功能，而在KIRC中起致癌作用，與本研究結果一致［7，11］。此外，miR-130b-3p在KIRC高分級中的表達明顯高于低分級，提示miR-130b-3p可能參與KIRC進展。已有文獻報道，miR-130b-3p可能促進KIRC細胞生長而導致該腫瘤進展，且miR-130b-3p可引發(fā)癌細胞系786-O對舒尼替尼耐藥［14］。

miRNA通過與mRNA靶基因結合并抑制其表達或翻譯過程而參與人類疾?。ò[瘤）發(fā)生發(fā)展［15］。1個miRNA可靶向作用于數(shù)百或上千個靶基因，同樣，1個靶基因也可與多個miRNA相互作用［16］。本 研 究 通 過 數(shù) 據(jù) 庫 獲 得miR-130b-3p在KIRC中的預測靶基因87個，通過Metascape對靶基因在KIRC中的GO生物學過程和KEGG信號通路進行富集分析，發(fā)現(xiàn)miR-130b-3p靶基因集主要涉及細胞自噬、頂樹突發(fā)育、磷脂酰肌醇生物合成、肌動蛋白細胞骨架形成等生物過程和甲狀腺激素合成信號通路、肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)信號通路以及Ras信號通路等。

miR-130b-3p在腫瘤組織中表達異常，并與腫瘤患者不良預后顯著相關，有望成為腫瘤的預后標志物。如，ZHAO等［9］檢測miR-130b在52對胰腺癌組織和癌旁組織的表達，結果顯示，miR-130b在癌組織中表達明顯低于癌旁組織，生存分析表明miR-130b低表達與胰腺癌患者不良預后相關。而COLANGELO等［17］和WANG等［18］研究表明，miR-130b在結直腸癌和肝細胞癌中高表達，并與患者不良預后相關。本研究采用Kaplan-Meier Plotter平臺的KIRC患者臨床數(shù)據(jù)，對miR-130b-3p進行生存分析，結果顯示，miR-130b-3p在KIRC高表達與患者不良預后相關，表明miR-130b-3p有望成為KIRC的預后標志物。此外，研究顯示，miR-130b-3p在轉移性腎上腺皮質瘤中的表達與免疫細胞表達顯著相關，而免疫細胞表達也與腫瘤患者預后有關［19］。

綜上所述，miR-130b-3p在KIRC發(fā)展中具有重要作用；此外，本研究預測了miR-130b-3p在KIRC中的靶基因，為后期深入研究miR-130b-3p在KIRC中的調(diào)控機制提供理論依據(jù)。