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    殺傷細胞免疫球蛋白樣受體和人白細胞抗原C基因型特定前葡萄膜炎的關系

    2021-08-21 07:00:58王玉青劉云霞任桂芳濱州市中心血站濱州256613
    中國免疫學雜志 2021年13期
    關鍵詞:葡萄膜配體等位基因

    王玉青 劉云霞 任桂芳②(濱州市中心血站,濱州256613)

    葡萄膜炎是虹膜、睫狀體、脈絡膜及鄰近眼部結構的炎癥。它是獲得性失明的主要原因之一[1]。急性前葡萄膜炎(acute anterior uveitis,AAU)占所有葡萄膜炎病例的85%[2-3]。HLA-B27抗原陽性相關急性前葡萄膜炎(HLA-B27 antigen-positive associated with acute anterior uveitis,B27AAU)和特發(fā)性急性前葡萄膜炎(idiopathic acute anterior uveitis,IAAU)是AAU最常見的臨床病例[4]。臨床上對葡萄膜炎的藥物治療多使用免疫抑制劑,如糖皮質激素、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢素、甲氨蝶呤、秋水仙堿等。B27AAU和IAAU致病的免疫抑制機制尚不清楚。

    自然殺傷(natural killer,NK)細胞作為一種對靶細胞能夠直接進行殺傷的淋巴細胞,在細胞免疫方面發(fā)揮重要作用。殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immunoglobulin-like receptors,KIRs)是一種主要表達在NK細胞和部分T細胞表面的受體。KIR基因編碼的跨膜蛋白屬免疫球蛋白超家族,共有16個成員:8個抑制型,6個激活型和2個假基因。KIR與其配體的結合調控NK細胞和部分T細胞的活性進而發(fā)揮其重要的免疫功能[5-6]。雖然大多數(shù)KIR的配體并不知曉,目前其配體鑒定最多是人類白細胞抗原(human leucocyte antigen,HLA)C基因。HLA-C基因具有豐富的多態(tài)性,依據(jù)其第80位氨基酸的差異把HLA-C基因分成2大組:HLA-C1組是攜帶精氨酸,HLA-C2組攜帶賴氨酸。已有報道HLAC1可分別和KIR2DL2、2DL3、2DS2結合,HLA-C2可分別和KIR2DL1、2DS1結合來影響NK細胞的活性[7]。

    近年來隨著對KIR和HLA-C基因研究的不斷深入,不同的眼部疾病和炎癥性疾病都與KIR和HLAC基因多態(tài)性有關,如Vogt-Koyanagi-Harada(VKH)、重度干眼癥(dry eye disease,DED)、原發(fā)性Sj?gren綜合征(primary Sj?gren syndrome,SS)以及年齡相關黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)[8-11]等。但迄今未見KIR、HLA-C基因與B27A AU、IAAU關聯(lián)性的研究報道。本文采用序列特異性引物聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction sequence-specific primer,PCR-SSP)方法就KIR和HLA-C基因型與B27AAU和IAAU的關聯(lián)性研究報道如下,以為B27AAU和IAAU發(fā)生的免疫學機制奠定基礎。

    1 資料與方法

    1.1 資料選取遺傳上不相關的確診為AAU的患者196例以及210例健康者為對照組?;颊邅碜詽鲜械谒娜嗣襻t(yī)院眼科。通過視力、裂隙燈顯微鏡檢查、后段瞳孔擴大檢查、x線評價、HLA-B27分型及臨床表現(xiàn)確診。根據(jù)葡萄膜炎命名標準化(SUN)工作組的建議,對葡萄膜炎進行了定義和解剖學分類[12]。術語“急性”用于描述以突發(fā)性和有限時間(<3個月)為特征的特定葡萄膜炎綜合征的病程。本研究將AAU患者分為B27AAU組和IAAU組。根據(jù)與AAU相關的HLA-B27基因分型,對B27AAU進行診斷。IAAU的診斷依據(jù)眼科檢查,前房細胞有無閃光,無玻璃體細胞,虹膜炎、虹膜睫狀體炎、前睫狀體炎,無感染性病因。排除基因分型HLA-B27的AAU之外的患者被定義為IAAU組患者。所有患者均無關節(jié)炎、口腔或生殖器潰瘍病史,并由風濕病學家根據(jù)相應標準排除了AS、ReA、SpA和Beh?et?。˙D)的診斷。有眼部手術史、眼外傷、除葡萄膜炎外的、主要全身疾?。òㄌ悄虿 ⒛I功能衰竭、肝病、血液學和動脈硬化/心血管疾?。┑幕颊吲懦谕?。196例AAU患者中,男性117例,女性79例,年齡33~51歲,平均年齡43歲。同時從本院健康體檢中心抽取210名健康者作為對照組。該組由124名男性和86名女性組成,年齡30~55歲,平均年齡為41歲。研究對象均為山東地區(qū)漢族。每個參與者須知情同意,并經濟南市第四人民醫(yī)院委員會批準。

    1.2 方法

    1.2.1 DNA提取EZ Bead system-32 DNA提取工作站(Texas BioGene Inc.)提取血液基因組DNA,嚴格按照說明書操作。

    1.2.2KIR基因檢測采用PCR-SSP法對患者和健康者的16個KIR基因進行分型。KIR基因PCR特異性引物序列見表1。(由上海博尚生物技術有限公司合成)。PCR反應體系10μl:包括20 ng的受檢基因組DNA、0.2 mmol/L的dNTP、0.5 U的Taq DNA聚合酶(購自Promega)、0.4 μmol/L的引物(除了KIR2DS1的引物為0.8μmol/L外)和1×PCR反應緩沖液。PCR反應參數(shù)94℃,4 min;94℃,30 s,65℃,30 s,72℃,90 s,30個循環(huán);72℃,10 min。部分KIR基因PCR擴增的退火溫度略有變化:KIR2DS2(63℃)、KIR2DS3(63℃)、KIR2DS4(61℃)和KIR2DS5(63℃)。PCR產物用1~2%瓊脂糖凝膠電泳檢查,SYNGENE生物圖像分析儀進行結果分析。

    表1 KIR基因的序列特異性PCR引物Tab.1 Sequence specific PCR primers of KIR genes

    1.2.3HLA-C基因型檢測采用PCR-SSP法對患者和健康者的HLA-C基因進行分型。HLA-C基因PCR特異性引物序列為C1/C2正向引物:5'-CCGGGGAGCCGCGCA-3',C1反向引物:5'-GCGCAGGTTCCGCAGGC-3',C2反向引物:5'-CGCGCAGTTTCCGCAGGT-3'。PCR反應體系同1.2.2。PCR反應的陽性內對照為生長因子基因(growth hormone gene,GH)。PCR反應參數(shù)94℃,120 s;94℃,25 s,70℃,45 s,72℃,30 s,5個循環(huán);94℃,25 s,65℃,45 s,72℃,30 s,21個循環(huán);94℃,25 s,55℃,60 s,72℃,120 s,5個循環(huán);72℃,5 min。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢查,SYNGENE生物圖像分析儀進行結果分析。

    1.3 統(tǒng)計學分析HLA-C和KIR基因的表型頻率(phenotypic frequency,PF)通過直接計數(shù)測得。用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行χ2相關分析,Hardy-Weinberg法則證實樣本代表性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。比值比(odds ratio,OR)分析關聯(lián)強度,用Woolf公式計算(OR=ad/bc),同時計算95%可信區(qū)間(95%confidence interval,95%CI)。

    2 結果

    2.1KIR基因在患者組和健康對照組中的分布在196例AAU患者中,KIR基因的分布沒有偏離Hardy-Weinberg平衡(P=0.28)。與對照組相比,B27AAU患者激活KIR2DS2的頻率增加(P=0.022,OR=1.77,95%CI=1.08~2.90),然而,在Bonferroni校正后,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.067,表2)。與對照組相比,IAAU患者組抑制性KIR2DL2的頻率顯著增加(P=0.009,OR=2.25,95%CI=1.31~3.85),而抑制性KIR2DL3的頻率顯著降低(P=0.000,OR=0.03,95%CI=0.00~0.24)。其他KIR基因和基因型在B27AAU、IAAU和對照組之間的分布差異無統(tǒng)計學意義。

    表2 AAU患者和對照組KIR基因頻率分布[例(%)]Tab.2 Distributions of KIR gene frequencies in AAU patient and control groups[n(%)]

    2.2HLA-C基因在患者組和健康對照組中的分布與對照組相比,B27AAU患者的HLA-C1C1基因型頻率顯著降低(P=0.034,OR=0.55,95%CI=0.35~0.88,表3)。IAAU患者組HLA-C1C2基因型頻率較對 照 組 增 加(P=0.043,OR=1.97,95%CI=1.01~3.82),但經Bonferroni校正后,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.128)。與對照組相比,B27AAU組HLA-C1等位基因頻率顯著降低(P=0.009,OR=0.60,95%CI=0.42~0.84),而HLA-C2等位基因頻率顯著增加(P=0.009,OR=1.68,95%CI=1.19~2.37)。其他HLA-C等位基因和基因型在B27AAU、IAAU和對照組之間的分布無統(tǒng)計學意義(表3)。

    表3 AAU患者和對照組HLA-C等位基因頻率分析[例(%)]Tab.3 Distributions of HLA-C allele groups′frequencies in AAU patient and control groups[n(%)]

    2.3HLA-C基因和其KIR基因受體在患者組和健康對照組中的分布由于目前鑒定KIR的配體最多的是HLA-C分子,因此分析了HLA-C和KIR基因即受體和配體組合的基因型頻率在B27AAU和IAAU患者組與對照組中的分布(表4)。HLA-C1等位基因與其已知的KIR配體KIR2DS2與B27AAU的相關性(P=0.019,OR=1.90,95%CI=1.10~3.29),但Bonferroni校正后差異無統(tǒng)計學意義(P=0.058)。與對照組相比,B27AAU患者的KIR2DL1/HLA-C2基因型頻率顯著增加(P=0.044,OR=1.78,95%CI=1.12~2.83)。HLA-C1等位基因和KIR2DL2、KIR2DL3與IAAU顯著相關(P=0.044,OR=2.05,95%CI=1.14~3.66,P=0.001,OR=0.36,95%CI=0.20~0.62)。其他HLA-C和KIR基因型的表型頻率在B27AAU、IAAU和對照組之間的分布無統(tǒng)計學意義(表4)。

    表4 AAU患者和對照組HLA-C和KIR基因配對基因型頻率分布[例(%)]Tab.4 Distributions of HLA-C and KIR gene paired genotype frequencies in AAU patient and control groups[n(%)]

    3 討論

    KIR和其相應配體對NK細胞在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[13-16]。然而,KIR和HLA基因在B27AAU和IAAU發(fā)病機制中的作用尚不清楚。本研究是首次報道B27 AAU、IAAU與KIR、HLA-C基因之間的關聯(lián)。

    在本研究中,KIR基因和HLA-C等位基因在B27AAU、IAAU和對照組中分布的頻率不同,對照組中KIR基因和HLA-C等位基因的分布與中國漢族人群中的分布相似[9,17]。IAAU組與對照組相比,KIR2DL3和KIR2DL3/HLA-C1的頻率顯著降低,提示KIR2DL3和KIR2DL3/HLA-C1對IAAU有保護作用。KIR2DL3/HLA-C1比其他HLA-C抑制NK細胞的信號較弱,并且可能具有較低的激活閾值[18]。KHAKOO等[19]報道,KIR2DL3/HLA-C1基因型增加了早期丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染的清除率,減弱其抑制功能。與對照組相比,IAAU組的KIR2DL2和KIR2DL2/HLA-C1的頻率顯著增加,提 示KIR2DL2和KIR2DL2/HLA-C1對IAAU敏感。LEVINSON等[20]人報道KIR2DL2/HLA-C1結合增加Birdshot脈絡膜視網膜病變的風險。先前的研究表明,KIR2DL2似乎可以抵消KIR2DL3/HLA-C1的清除HCV的保護作用[19]。結果與KIR2DL2/HLA-C1和KIR2DL3/HLA-C1在IAAU組的分布相似。

    B27AAU患者的HLA-C1C1基因型 和HLA-C1等位基因頻率分別低于對照組,這提示HLA-C1在B27AAU中起保護作用。然而,患者的HLA-C2等位基因頻率高于對照組,提示HLA-C2在B27AAU的發(fā)病機制中起著不利的作用。此研究結果與前人報道相似:BD患者的HLA-C1頻率顯著低于健康對照組,而HLA-C2的頻率顯著高于健康對照組[15]。結果提示,HLA-C1對B27AAU和BD具有保護作用,而HLA-C2與兩種眼病的易感風險相關。

    KIRs及其配體的結合分析提示KIR2DL1/HLAC2組合與B27AAU呈正相關,HLA-C2與抑制性配體結合時對B27AAU有易感性是由于HLA-C2的易感性。先前的研究表明,B27AAU患者與對照的高加索白人之間KIR2DL1/HLA-C2組合頻率差異無統(tǒng)計學意義[21]。結果的不同可能是由于人群的差異造成的。同時也提示KIR與HLA的相互作用與不同的遺傳背景有關。

    綜上所述,本研究分析了KIR基因和HLA-C配體與中國漢族AAU病例的關系,提示KIR和HLA-C基因可以作為1個標記物,為有效治療疾病提供個性化方案。HLA-C配體與受體結合可能誘導NK細胞活化和抑制AAU進展。KIR受體及其HLA配體的基因分型、表達和功能,以及這些配體和受體在疾病發(fā)病中的作用有待進一步研究。

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