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    miRNA-200b通過靶向RhoA抑制宮頸癌細胞增殖、促進細胞凋亡

    2021-08-21 07:00:24何麗杰陳會佳王靜常丹丹呂丹丹李海娜天津市第五中心醫(yī)院檢驗科天津300450
    中國免疫學雜志 2021年13期
    關(guān)鍵詞:熒光素酶空白對照靶向

    何麗杰 陳會佳 王靜 常丹丹 呂丹丹 李海娜(天津市第五中心醫(yī)院檢驗科,天津300450)

    宮頸癌是世界范圍內(nèi)常見癌癥,是嚴重威脅婦女生命的常見惡性腫瘤之一,女性患者死亡率較高[1]。微小RNA(microRNA,miRNA)是內(nèi)源性單鏈小RNA,可通過翻譯后修飾在人類腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。研究報道,miRNA與宮頸癌細胞增殖、凋亡、侵襲等密切相關(guān),是宮頸癌診斷、治療和預(yù)后評估的新靶點[2-3]。miRNA-200是一類抑制腫瘤的miRNA家族,包括miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-200c等,促進miR-200家族表達可抑制胰腺癌細胞侵襲和遷移[4]。研究發(fā)現(xiàn),miRNA-200b在上皮性卵巢癌中異常表達,且血漿miRNA-200b水平可作為早期診斷上皮性卵巢癌的分子標志物[5]。RhoA是具有GTP酶活性的小分子G蛋白,參與腫瘤細胞生長、血管生成及浸潤轉(zhuǎn)移等進程。研究發(fā)現(xiàn),RhoA在胃癌組織及肺腺癌組織中均存在過度表達,參與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移、侵襲[6-7]。Bax為Bcl-2家族成員,具有促凋亡作用,過表達Bax可促進多種細胞自發(fā)凋亡,還可增加由多種因素引起的細胞凋亡[8]。CyclinD1在多種惡性腫瘤中異常高表達,可促進腫瘤細胞增殖[9]。目前關(guān)于miRNA-200b及RhoA蛋白對宮頸癌細胞增殖凋亡的影響鮮有報道。因此,本研究驗證miRNA-200b與RhoA蛋白在宮頸癌細胞中的靶向關(guān)系,并探討其在宮頸癌細胞增殖、凋亡中的作用,為宮頸癌治療提供新靶點。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試劑人宮頸癌HeLa細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫;胎牛血清購自美國Gibco公司;Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司;RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學發(fā)光液、CCK8試劑盒均購自碧云天生物有限公司;兔抗人RhoA單克隆抗體(克隆號:EPR18134)、兔抗人CyclinD1單克隆抗體(克隆號:EPR2241)、兔抗人Bax單克隆抗體(克隆號:EPR18283)、兔抗人VEGF單克隆抗體(克隆號:Y103)、小鼠抗人TGF-β1單克隆抗體(克隆號:TB21)均購自美國Abcam公司;辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(二抗)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

    1.1.2 主要儀器CO2細胞培養(yǎng)箱購自美國SHELDON公司;BD FACS Calibur流式細胞儀購自美國BD公司;實時熒光定量PCR儀購自德國Eppendorf公司;低溫高速離心機購自德國Heraeus公司;全自動酶標儀、電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀均購自美國Bio-Rad公司;搖床(TS-8)購自上海精密儀器制造公司;化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國GE公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染將人宮頸癌HeLa細胞接種于RPMI1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清),37℃、5%CO2培養(yǎng),取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。根據(jù)處理方法不同將HeLa細胞分為5組:空白對照組、mimic-NC組、miRNA-200b mimic組、RhoA-NC組和RhoA過表達組,HeLa細胞以1×106個/ml接種于6孔板,培養(yǎng)過夜。取2管,第1管加45μl DMEM分別與5 μl miRNA-200b模擬物、過表達陰性對照、RhoA空白對照質(zhì)粒、RhoA過表達質(zhì)?;靹?;第2管加45μl DMEM和5μl Lipofectamine2000混勻,放置5 min,融合20 min,加至6孔板,建立miRNA-200b mimic組、mimic-NC組、RhoA-NC組和RhoA過表達組,未轉(zhuǎn)染細胞作為空白對照組。分別于轉(zhuǎn)染后收集各組細胞進行后續(xù)實驗。

    1.2.2 RT-PCR檢測各組細胞miRNA-200b表達Trizol法提取各組HeLa細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,miRNA-200b以U6為內(nèi) 參,采 用SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR法檢測各組細胞miRNA-200b表達。引物由上海生工公司設(shè)計合成,miRNA-200b F:5'-GGGGTAATACTGCCTGGT-3',R:5'-TGCGTGTCGTGGCGTC-3';U6 F:5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3',R:5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min;95℃變性10 s,60℃退火30 s,共40個循環(huán)。各樣本重復(fù)檢測3次,2-ΔΔCt法計算miRNA-200b相對表達。

    1.2.3 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灢捎蒙镄畔W軟件TargetScan等數(shù)據(jù)庫分析miRNA-200b的靶基因,結(jié)果顯示,RhoA基因3′端存在miRNA-200b的結(jié)合位點,提示RhoA是miRNA-200b的直接靶基因。采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C該結(jié)果,分別擴增出含miRNA-200b結(jié)合位點的RhoA 3′UTR及miRNA-200b結(jié)合位點突變的RhoA 3′UTR系列,將其插入熒光素酶報告基因載體上,構(gòu)建野生型RhoA-Wt和突變型RhoA-Mut重組質(zhì)粒。將HeLa細胞接種于96孔板,37℃培養(yǎng)24 h,分別將RhoA-Wt重組質(zhì)粒、RhoA-Mut重組質(zhì)粒與miRNA-200b mimic(5'-UAAUACUGCCUGGUAAUGAUGA-3')或mimic-NC(5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′)共轉(zhuǎn)染至細胞中,37℃培養(yǎng)48 h,收集并裂解細胞,雙熒光素酶報告基因分析。

    1.2.4 Western blot和RT-PCR檢測各組細胞RhoA蛋白及mRNA表達分別收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細胞,加入RIPA細胞裂解液于冰上提取細胞中總蛋白,采用BCA蛋白濃度測定試劑盒對蛋白進行定量,將蛋白樣品與上樣緩沖液混勻,沸水浴加熱變性,取等量變性蛋白樣品加入上樣孔,行SDS-PAGE凝膠電泳。待蛋白分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉1 h,TBST洗膜,加入RhoA一抗(1∶1 500),4℃雜交過夜,TBST洗膜,加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶3 000),室溫雜交1 h,TBST洗膜,ECL化學發(fā)光,暗室成像拍照,以β-actin為內(nèi)標蛋白,Image J軟件計算各組細胞RhoA蛋白表達,RhoA mRNA檢測方法參照1.2.2。引物設(shè)計:RhoA F:5'-TGATTGTTGGTGATGGAGCCT-3';R:5'-ACTCTACCTGCTTTCCATCCAC-3';β-actin F:5'-GATTGGAATCTGGCTACT-3',R:5'-TAGGGCTGAAGCACAGGG-3'。

    1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡取轉(zhuǎn)染后的各組細胞,不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液,PBS離心洗滌3次。將細胞重懸于預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液中,調(diào)整細胞密度為1×106個/ml,加入1.25μl Annexin V-FITC輕輕混勻,避光室溫反應(yīng)15 min,用0.5 ml預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液重懸,加入10μl Ptopidium Iodide,流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率,實驗重復(fù)3次取平均值。

    1.2.6 CCK8法檢測細胞增殖分別收集各組細胞以2×103個/孔接種至96孔板,37℃常規(guī)培養(yǎng),轉(zhuǎn)染48 h,各孔細胞中加入混有10% CCK8檢測試劑的培養(yǎng)液,常規(guī)培養(yǎng)2 h,酶標儀測定波長450 nm處各孔光密度(OD)。實驗重復(fù)3次。

    1.2.7 Western blot和RT-PCR檢測Bax、CyclinD1和VEGF、TGF-β1蛋白及mRNA表達檢測方法參照1.2.2和1.2.4。Bax F:5'-GTGGAGGAGCTCTT

    CAGGGA-3',R:5'-AGGCACCCAGGGTGATGCAA-3';CyclinD1 F:5'-GCCGAATTCATGGAACACCAGCT-3',R:5'-TGCACCTGTAGACTGAGCTCGC-3';VEGF F:5'-ATGAACTTTCTGCTGTCTTGG-3';R:5'-TCACCGCCTCGGCTTGTCACA-3';TGF-β1 F:5'-CTACTACGCCAAAGAAGTCACC-3',R:5'-GAAATCGGCCCTGTACCGTCTCT-3'。

    1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,所有數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布,結(jié)果以±s表示,多樣本實驗結(jié)果采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 轉(zhuǎn)染miRNA-200b后HeLa細胞miRNA-200b表達比較與空白對照組和mimic-NC組相比,miRNA-200b mimic組miRNA-200b表達顯著升高(P<0.05)??瞻讓φ战M與mimic-NC組miRNA-200b mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,圖1)。

    圖1 各組miRNA-200b表達Fig.1 miRNA-200b expressions in each group

    2.2 miRNA-200b對RhoA的靶向調(diào)控作用驗證雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示,miRNA-200b與RhoA基因3′UTR存在互補結(jié)合位點,miRNA-200b和RhoA可靶向結(jié)合。熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染野生型RhoA基因表達載體WT-3′UTR后再轉(zhuǎn)染miRNA-200b mimic細胞的熒光素酶活性與再轉(zhuǎn)染mimic-NC組顯著降低;而轉(zhuǎn)染突變性RhoA基因 表達載 體Mutant-3′UTR后,再轉(zhuǎn) 染miRNA-200b mimic的HeLa細胞熒光素酶活性無明顯抑制作用(圖2)。

    圖2 miRNA-200b結(jié)合位點的保守性分析及熒光素酶活性分析Fig.2 Conservative analysis of miRNA-200b binding sites and activity analysis of luciferase

    2.3 各組細胞RhoA蛋白和mRNA表達比較與空白對照組和mimic-NC組相比,miRNA-200b mimic組RhoA蛋白及mRNA表達顯著降低,與RhoA-NC組相比,過表達RhoA,RhoA蛋白及mRNA表達顯著升高(P<0.05)??瞻讓φ战M與mimic-NC組、RhoA過表達組RhoA蛋白及mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,圖3)。

    圖3 各組RhoA蛋白和mRNA表達Fig.3 RhoA protein and mRNA expressions in each group

    2.4 各組細胞增殖和凋亡水平與空白對照組和mimic-NC組相比,miRNA-200b mimic組細胞凋亡比例顯著升高,細胞增殖受到抑制,RhoA過表達組細胞凋亡比例降低,細胞增殖能力顯著增強(P>0.05);空白對照組、mimic-NC組、RhoA-NC組細胞凋亡、增殖能力差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,圖4、5)。

    圖4 各組細胞轉(zhuǎn)染后增殖能力Fig.4 Cell proliferation ability after transfection in each group

    圖5 各組細胞轉(zhuǎn)染后細胞凋亡能力Fig.5 Cell apoptotic ability in each group after transfection

    2.5 各組細胞增殖相關(guān)基因和凋亡相關(guān)基因表達比較與空白對照組和mimic-NC組相比,miRNA-200b mimic組細胞Bax mRNA和蛋白表達顯著升高,而CyclinD1 mRNA和蛋白表達顯著降低(P<0.05);與RhoA-NC組相比,RhoA過表達組Bax mRNA和蛋白表達下降,而CyclinD1 mRNA和蛋白表達升高(P<0.05,圖6)。

    圖6 各組CyclinD1和Bax mRNA、蛋白表達Fig.6 CyclinD1 and Bax mRNA and protein expressions in each group

    2.6 各組細胞VEGF、TGF-β1表達比較與空白對照組和mimic-NC組相比,miRNA-200b mimic組細胞VEGF、TGF-β1 mRNA和蛋白表達顯著降低(P<0.05);與RhoA-NC組相比,RhoA過 表 達 組VEGF、TGF-β1 mRNA和蛋白表達顯著升高(P<0.05,圖7)。

    圖7 各組VEGF和TGF-β1 mRNA和蛋白表達Fig.7 VEGF and TGF-β1 mRNA and protein expressions in each group

    3 討論

    宮頸癌是一種常見婦科惡性腫瘤,是全世界女性,特別是發(fā)展中國家女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因,因此,深入了解參與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因,探討其分子機制具有重要意義。研究表明,miRNA在轉(zhuǎn)錄后通過負調(diào)控靶基因穩(wěn)定性或翻譯效率調(diào)節(jié)基因表達,起致癌或抑癌作用[10]。miRNA-200b家族可在多種人類癌癥中發(fā)揮腫瘤抑制作用[11]。miRNA-200b異常表達在乳腺癌、結(jié)直腸癌和膠質(zhì)瘤細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和轉(zhuǎn)移中起重要作用[12-13]。RhoA在人類多種癌癥中異常表達,并參與腫瘤發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移[14-15]。MA等[16]研究發(fā)現(xiàn),RhoA是miR-200b下游靶基因,miR-200b通過直接靶向RhoA調(diào)節(jié)血腫瘤屏障滲透性。本研究選擇人宮頸癌細胞HeLa,采用生物信息學驗證miRNA-200b與RhoA的靶向關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn),miRNA-200b與RhoA基因3′UTR存在互補結(jié)合位點;在轉(zhuǎn)染miRNA-200b模擬物后,RhoA表達水平顯著降低。上述結(jié)果均提示RhoA是miRNA-200b的下游靶基因,可能參與宮頸癌發(fā)生發(fā)展。

    miRNAs可通過靶向作用mRNA的3′UTR抑制其轉(zhuǎn)錄翻譯,從而發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等多種功能[17]。彭彪等[18]研究報道,miRNA-200b可通過靶向調(diào)控PROM1表達抑制膠質(zhì)瘤細胞侵襲。LIU等[19]研究發(fā)現(xiàn),miRNA-144通過雙重靶向RhoA和ROCK1在體外顯著抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力,在體內(nèi)抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程復(fù)雜,通常是由于抑癌基因失活和癌基因激活導(dǎo)致細胞周期和生存相關(guān)分子改變。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是血管內(nèi)皮細胞特異性結(jié)合因子,是促進腫瘤血管生成的關(guān)鍵刺激因子[20]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)是一種具有雙向調(diào)節(jié)功能的細胞負性免疫調(diào)節(jié)因子,在腫瘤細胞免疫逃逸及免疫抑制過程中發(fā)揮重要負性調(diào)節(jié)作用[21-22]。研究表明,惡性腫瘤患者中血清VEGF水平升高,細胞免疫功能異常減弱;VEGF水平越高,惡性腫瘤患者病情越嚴重,轉(zhuǎn)移和侵襲風險越高[23]。研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1、Foxp3蛋白在宮頸癌組織中表達增高,可能在促使宮頸癌細胞免疫逃逸、促進宮頸癌形成及轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用[24-25]。miRNAs被認為是基因表達轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要分子,在不同來源的腫瘤中有差異表達,不僅具有抑癌和致癌潛能,且具有免疫調(diào)節(jié)功能[26]。研究報道,miRNA可參與癌細胞免疫逃逸,從而導(dǎo)致腫瘤細胞免于凋亡而無限增殖[27]。羅衛(wèi)民等[28]發(fā)現(xiàn),miR-200b可能通過靶向VEGF抑制非小細胞肺癌細胞侵襲。LADAK等[29]研究表明,miR-200b可調(diào)控TGF-β1表達保護氣道上皮細胞免受EMT影響。因此,從miRNA參與腫瘤細胞免疫逃逸角度研究腫瘤增殖、遷移的分子機制,可為腫瘤轉(zhuǎn)移治療提供理論依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染miRNA-200b模擬物后,HeLa細胞VEGF、TGF-β1基因表達及細胞增殖能力顯著降低,凋亡水平升高;過表達RhoA基因表達后,VEGF、TGF-β1基因表達及細胞增殖能力明顯升高,凋亡水平下降。提示miRNA-200b通過靶向RhoA抑制HeLa細胞增殖能力并促進其凋亡,可能通過抑制宮頸癌細胞免疫逃逸抑制宮頸癌發(fā)展。

    綜上所述,miRNA-200b可通過靶向調(diào)控RhoA抑制HeLa細胞增殖并促進其凋亡,其作用機制可能為miRNA-200b抑制宮頸癌細胞免疫逃逸。因此,從腫瘤免疫逃逸角度為miRNA-200b治療宮頸癌提供了重要依據(jù),但具體作用機制有待進一步研究。

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