SMC4在人食管癌組織中的表達(dá)及對(duì)食管癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制研究

張 冉 石長(zhǎng)林 茍小軍 何鴻晏（四川省巴中市中心醫(yī)院胸心外科，巴中636000）

食管癌（esophageal cancer，EC）作為全球范圍致命的惡性腫瘤，主要分為食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）［1］。其中，ESCC是亞洲中部和東部最常見(jiàn)病理學(xué)類型，占所有病理學(xué)類型的90%。全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，ESCC全球發(fā)病率持續(xù)升高，已成為嚴(yán)重公共衛(wèi)生問(wèn)題［2］。EC轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是預(yù)后差的主要原因之一，而EC細(xì)胞侵襲和遷移是促進(jìn)EC轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵［3］。因此，探究EC細(xì)胞侵襲遷移的作用機(jī)制對(duì)其后續(xù)治療具有重要意義。染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白4（structural maintenance of chromosome 4，SMC4）是SMC核心成員，在有絲分裂過(guò)程染色體凝集和分離過(guò)程中起重要作用［4］。SMC4可參與各種非有絲分裂染色體功能發(fā)揮過(guò)程，如DNA修復(fù)、維持基因下調(diào)狀態(tài)［5］；SMC4在前列腺癌、結(jié)直腸癌及肝癌中呈異常高表達(dá)［6-8］，且與癌細(xì)胞侵襲遷移密切相關(guān)，而SMC4與EC的關(guān)系鮮有報(bào)道。本研究檢測(cè)SMC4在人EC組織中的表達(dá)，分析其與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系，通過(guò)小分子干擾RNA（siRNA）特異性降低SMC4表達(dá)，觀察其對(duì)EC細(xì)胞侵襲和遷移的影響，進(jìn)一步探討其可能的分子機(jī)制，為EC臨床治療提供新靶點(diǎn)和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人EC組織標(biāo)本及細(xì)胞來(lái)源 收集2018年5月至2019年4月我院手術(shù)切除的EC組織標(biāo)本及其相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本各114例，其中女性64例、男性50例，平均年齡（52.51±3.72）歲；＜50歲41例，≥50歲73例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期50例，Ⅲ～Ⅳ期64例；病理組織學(xué)類型：鱗癌84例，腺癌30例；組織分化程度：低分化65例，中分化28例，高分化21例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移74例，未轉(zhuǎn)移40例；腫瘤直徑：≥3 cm 79例，＜3 cm 35例；浸潤(rùn)深度：未及漿膜層34例，突破漿膜層80例。入選標(biāo)準(zhǔn)：癌組織經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為EC且未合并其他腫瘤；癌旁組織距離腫瘤邊緣外2 cm以上且經(jīng)病理學(xué)證實(shí)未發(fā)生癌變；患者術(shù)前未接受放化療及其他治療。制備組織石蠟切片備用。EC細(xì)胞株KYSE170和Eca-109購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究所。

1.1.2 主要試劑SMC4即用型免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶、RPIM1640細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；qRT-PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；Trizol總RNA提取試劑盒購(gòu)自廣東銳博生物科技技術(shù)股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自 美 國(guó)Sigma；KYSE170-siNC、KYSE170-siSMC4、Eca-109-siNC和Eca-109-siSMC4由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；青、鏈霉素購(gòu)自華北制藥有限公司；總蛋白提取試劑盒購(gòu)自北京普利萊；PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt抗體采購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.1.3 主要儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱采購(gòu)自上海三騰儀器有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自SANYO；生物安全柜購(gòu)自Haier；高速離心機(jī)購(gòu)自Thermo；Ti-U∕Ti-s倒置熒光顯微鏡購(gòu)自Nikon。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)組織切片中SMC4表達(dá) 將收集的EC組織及其相應(yīng)癌旁正常組織樣本固定包埋并切片，常規(guī)脫蠟和水化后置于檸檬酸鹽緩沖液中高壓修復(fù)，3%H2O2室溫下浸泡以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，封閉，加入稀釋后的SMC4一抗4℃孵育過(guò)夜，次日復(fù)溫后PBS洗滌，加入稀釋后的HRP標(biāo)記的驢抗山羊IgG、山羊抗兔IgG，室溫孵育30 min，PBS洗滌。加入適量DAB孵育5 min，去離子水終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯浸泡透明后干燥，中性樹(shù)膠封片，鏡檢觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師對(duì)病理切片進(jìn)行盲評(píng)，各切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，各視野隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，以細(xì)胞出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，根據(jù)染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞率綜合評(píng)分。染色強(qiáng)度記分依據(jù)：無(wú)著色記為0分，淡黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)記分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞記為0分，＜25%記為1分，25%～50%記為2分，51%～75%記為3分，＞75%記為4分。以上2項(xiàng)計(jì)分相加結(jié)果≥3分為陽(yáng)性。

1.2.2 穩(wěn)定干擾SMC4細(xì)胞系建立 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期EC細(xì)胞株KYSE170、Eca-109分別消化后加入含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基，均勻鋪至6孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至70%左右時(shí)換為無(wú)血清培養(yǎng)基待轉(zhuǎn)染，按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)操作，分別將干擾質(zhì)粒KYSE170-siSMC4及陰性對(duì)照KYSE170-siNC轉(zhuǎn)染至KYSE170細(xì)胞，將Eca-109-siNC和Eca-109-siSMC4轉(zhuǎn)染至Eca-109細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，將構(gòu)建成功的穩(wěn)定干擾細(xì)胞系分別記為KYSE170-siSMC4和KYSE170-siNC，Eca-109-siNC和Eca-109-siSMC4，同時(shí)設(shè)置KYSE170和Eca-109空白對(duì)照組。

1.2.3 MTT檢測(cè)KYSE170和Eca-109細(xì)胞增殖 消化KYSE170、KYSE170-siSMC4及KYSE170-siNC、Eca-109、Eca-109-siNC和Eca-109-siSMC4細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，5×103個(gè)∕孔接種至96孔板，混勻，37℃、5%CO2培養(yǎng)，第2、3、4、5、6天分別加入MTT試劑20 μl，37℃避光孵育4 h，棄孔內(nèi)液體，加入100 μl DMSO，37℃搖床快速振蕩15 min，充分溶解結(jié)晶物，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 Transwell小室檢測(cè)KYSE170和Eca-109細(xì)胞侵襲KYSE170、KYSE170-siSMC4及KYSE170-siNC、Eca-109、Eca-109-siNC和Eca-109-siSMC4細(xì)胞消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度，5×103個(gè)∕小室分別加入Transwell小室上室，下室加入600 μl含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)48 h，棉簽擦凈上室細(xì)胞，PBS清洗，結(jié)晶紫染色，常規(guī)制片，倒置顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)觀察5個(gè)視野，記錄穿膜細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)KYSE170和Eca-109細(xì)胞遷移KYSE170、KYSE170-siSMC4及KYSE170-siNC、Eca-109、Eca-109-siNC和Eca-109-siSMC4細(xì)胞消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)∕ml，取2 ml接種于6孔板，并在6孔板背面劃5條平行線，24 h后用200 μl槍頭在細(xì)胞中劃2條垂直于背面平行線的直線，PBS沖洗2次，加入2 ml無(wú)胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液，于0、24 h在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞向劃痕中間遷移的距離并拍照，各組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 IFA檢測(cè)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)分子N-cadherin表達(dá)KYSE170、KYSE170-siSMC4及陰性對(duì)照KYSE170-siNC細(xì)胞消化后，5×105個(gè)∕ml均勻鋪至6孔板，37℃、5%CO2靜置培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定10 min，PBS沖 洗2遍，0.1%Triton100通 透15 min，PBS沖洗，5%BSA室溫封閉30 min，分別加入適量封閉液稀釋的N-cadherin一抗，室溫孵育2 h，PBS沖洗，加入稀釋后的熒光標(biāo)記的山羊抗兔IgG，37℃避光孵育1 h，PBS沖洗，稀釋好的DAPI染細(xì)胞核，干燥，封片，共聚焦顯微鏡下觀察拍照，記錄陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.2.7 Western blot檢測(cè)KYSE170細(xì)胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，加入蛋白裂解液冰上裂解30 min，提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定含量。制備蛋白樣品，配制SDSPAGE凝膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，5%BSA封閉液室溫孵育2 h。分別加入適量封閉液稀釋的一抗，4℃孵育過(guò)夜，次日復(fù)溫，PBST洗滌，加入適量稀釋好的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，室溫孵育2 h，PBST洗滌，ECL避光5 min，暗室曝光并拍照，以GAPDH為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Graphpad5.01軟件作圖，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SMC4在EC組織和癌旁正常組織中的表達(dá)SMC4在EC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率（83.33%）高于顯著癌旁組織（10.53%，P＜0.001）。

2.2 SMC4在EC不同臨床病理分組中的表達(dá)SMC4表達(dá)與腫瘤直徑、TNM臨床分期、浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織分化程度密切相關(guān)（P＜0.05），與EC患者年齡、性別無(wú)關(guān)（P＞0.05，表1）。

表1 SMC4在EC不同臨床病理分組中的表達(dá)（例）Tab.1 Expression of SMC4 in different clinicopathologi?cal groups of esophageal cancer（n）

2.3 穩(wěn)定下調(diào)SMC4表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建Western blot結(jié)果顯示，KYSE170-siSMC4組SMC4表達(dá)明顯低 于Control組 和KYSE170-siNC組（P＜0.05，圖1A），Eca-109-siSMC4組SMC4表達(dá)明顯低于Control組和Eca-109-siNC組（P＜0.05，圖1B），提示SMC4下調(diào)細(xì)胞株構(gòu)建成功。

圖1 Western blot檢測(cè)KYSE170和Eca-109細(xì) 胞 中SMC4表達(dá)Fig.1 Western blot detection of SMC4 expression in KYSE170 and Eca-109 cells

2.4 SMC4對(duì)KYSE170和Eca-109細(xì)胞 增殖的 影響MTT結(jié)果顯示，與Control組和KYSE170-siNC組相比，KYSE170-siSMC4組第4、5、6天增殖能力明顯下降（P＜0.05，圖2A），Eca-109-siSMC4組第4、5、6天增殖能力明顯低于Control組和Eca-109-siNC組（P＜0.05，圖2B）。提示下調(diào)SMC4表達(dá)可明顯抑制KYSE170和Eca-109細(xì)胞增殖。

2.5 SMC4對(duì)KYSE170和Eca-109細(xì) 胞侵襲 的影響KYSE170-siSMC4組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著少于Control組和KYSE170-siNC組（P＜0.05，圖3A），Eca-109-siSMC4組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于Control組和Eca-109-siNC組（P＜0.05，圖3B），提示下調(diào)SMC4表達(dá)可明顯抑制KYSE170和Eca-109細(xì)胞侵襲。

圖3 SMC4對(duì)KYSE170和Eca-109細(xì) 胞 遷 移 的 影 響（×200）Fig.3 Effect of SMC4 on cell migration of KYSE170 and Eca-109 cells（×200）

2.6 SMC4對(duì)KYSE170和Eca-109細(xì)胞 遷移的 影響KYSE170-siSMC4組細(xì)胞遷移能力減弱，創(chuàng)傷愈合速率減慢，覆蓋劃痕區(qū)域少于Control組和KYSE170-siNC組（P＜0.05，圖4A），Eca-109-siSMC4組覆蓋劃痕區(qū)域明顯少于Control組和Eca-109-siNC組（P＜0.05，圖4B）。提示下調(diào)SMC4表達(dá)可抑制細(xì)胞遷移。

圖4 SMC4對(duì)KYSE170和Eca-109細(xì)胞遷移的影響Fig.4 Effect of SMC4 on cell migration of KYSE170 and Eca-109 cells

2.7 SMC4對(duì)EMT相關(guān)分子N-cadherin表達(dá)的影響 共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，下調(diào)SMC4表達(dá)，與Control組和KY SE170-siNC相比，KYSE170-siSMC4細(xì)胞中N-cadherin表達(dá)明顯下降（P＜0.05）。提示SMC4可促進(jìn)N-cadherin表達(dá)（圖5）。

圖5 SMC4對(duì)EMT相關(guān)分子N-cadherin表達(dá)的影響（×100）Fig.5 Effect of SMC4 on expression of EMT related mole?cule N-cadherin（×100）

2.8 SMC4對(duì)細(xì)胞PI3K∕Akt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響KYSE170-siSMC4組p-PI3K和p-Akt表達(dá) 明 顯 低 于Control組 和KYSE170-siNC組（P＜0.05），3組PI3K和Akt表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖6）。

圖6 SMC4對(duì)KYSE170細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of SMC4 on expressions of key proteins of PI3K/Akt signaling pathway in KYSE170 cells

3 討論

EC是全球高發(fā)惡性腫瘤之一，我國(guó)EC發(fā)病率位居全球第五，死亡率位居第四，且呈不斷上升趨勢(shì)［9］。分子靶向治療是繼手術(shù)治療、放化療的腫瘤治療策略，可增強(qiáng)腫瘤抑制基因表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，已成為國(guó)內(nèi)外腫瘤研究領(lǐng)域熱點(diǎn)。EC是常見(jiàn)消化道腫瘤，包括鱗癌與腺癌2種，近年雖然EC治療取得了一定進(jìn)展，但EC患者生存率并未顯著提高［10］。EC細(xì)胞侵襲和遷移是其轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，也是影響其療效和預(yù)后的主要原因［11］。因此，深入研究EC侵襲遷移的機(jī)制，有望為EC治療提供新靶點(diǎn)，對(duì)其治療具有重要意義。腫瘤轉(zhuǎn)移是復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，涉及黏附分子、蛋白溶酶、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子及相關(guān)信號(hào)通路等，機(jī)制復(fù)雜［12-13］。目前對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的認(rèn)識(shí)有限，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)移相關(guān)分子不足以解釋轉(zhuǎn)移的各層面，分子機(jī)制尚未明確。表觀遺傳學(xué)為人EC轉(zhuǎn)移研究提供了新的思路，也為阻止和治療EC轉(zhuǎn)移提供了新方案。

SMC4作為染色體腺苷三磷酸酶中SMC家族重要成員，是維持細(xì)胞周期中S期正常進(jìn)展的關(guān)鍵蛋白。近期研究發(fā)現(xiàn)，SMC4在肝癌組織中異常高表達(dá)，且與血管侵犯密切相關(guān)［14］。上調(diào)SMC4表達(dá)可通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）∕Smad信號(hào)通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤增殖侵襲，因此SMC4在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用［15］。本研究采用IFA法檢測(cè)SMC4在EC組織和癌旁正常組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示SMC4在EC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為83.33%，在癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為10.53%，SMC4在EC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織（P＜0.001）。進(jìn)一步分析SMC4表達(dá)與EC臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示SMC4蛋白表達(dá)與EC患者年齡、性別無(wú)關(guān)，而與腫瘤直徑、TNM臨床分期、浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織分化程度密切相關(guān)（P＜0.05）。為進(jìn)一步探討SMC4對(duì)EC侵襲、遷移的影響，本研究采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建了SMC4下調(diào)細(xì)胞株，MTT結(jié)果顯示，與Control組 和KYSE170-siNC組 相 比，KYSE170-siSMC4組細(xì)胞在第4、5、6天增殖能力明顯下降（P＜0.05），Eca-109-siSMC4組第4、5、6天增殖能力明顯低于Control組和Eca-109-siNC組（P＜0.05）。提示下調(diào)SMC4表達(dá)可明顯抑制KYSE170和Eca-109細(xì)胞增殖。采用Transwell和劃線法檢測(cè)細(xì)胞侵襲遷移能力，結(jié)果顯示，KYSE170-siSMC4組細(xì)胞侵襲和遷移能力顯著低于Control組和KYSE170-siNC組（P＜0.05），Eca-109-siSMC4組細(xì)胞侵襲和遷移能力顯著低于Control組和Eca-109-siNC組（P＜0.05），提示下調(diào)SMC4表達(dá)可抑制EC細(xì)胞KYSE170和Eca-109增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

EMT是具有上皮形態(tài)和功能的細(xì)胞表現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞樣特征的生理和病理學(xué)過(guò)程，常因極性和細(xì)胞間連接消失、細(xì)胞骨架重排而形成［16］。EMT是胃癌、結(jié)直腸癌、肺癌及乳腺癌等多種實(shí)體腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的重要進(jìn)程，其原因?yàn)镋MT是腫瘤細(xì)胞從腫瘤母體脫離并向周圍組織侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的起點(diǎn)，可減弱腫瘤細(xì)胞間黏附力，增強(qiáng)其生存及侵入間質(zhì)的能力［17］。細(xì)胞黏附分子鈣黏蛋白家族成員中的神經(jīng)性鈣黏蛋白（N-cadherin）常被作為間質(zhì)樣細(xì)胞的標(biāo)志物，且被證實(shí)在多種腫瘤EMT進(jìn)程中表達(dá)升高［18］。本研究經(jīng)IFA及共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，下調(diào)SMC4表 達(dá) 的EC細(xì)胞KYSE170中N-cadherin表達(dá)顯著下降，說(shuō)明SMC4可促進(jìn)N-cadherin表達(dá)，即可促進(jìn)EC細(xì)胞EMT進(jìn)程。

PI3K∕AKT在腫瘤增殖、侵襲和遷移過(guò)程中起重要作用，激活的PI3K可使質(zhì)膜產(chǎn)生3-磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），而PIP3可與Akt結(jié)合促使其從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)至細(xì)胞膜從而獲得催化活性，激活（磷酸化）的Akt從細(xì)胞膜脫落進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，從而調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和凋亡［19］。研究顯示，乳腺癌中SMC4可促進(jìn)PI3K∕AKT信號(hào)通路表達(dá)［20］。本研究顯示，KYSE170-siSMC4組p-PI3K和p-Akt表達(dá)水平明顯低于Control組和KYSE170-siNC組（P＜0.05），提示下調(diào)SMC4表達(dá)可抑制PI3K∕AKT信號(hào)通路活性。

綜上所述，下調(diào)SMC4表達(dá)可抑制人EC細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并通過(guò)降低EMT相關(guān)分子N-cadherin表達(dá)抑制EMT進(jìn)程，其作用機(jī)制可能與PI3K∕AKT信號(hào)通路有關(guān)。