桂皮醛對關節(jié)炎大鼠JAK/STAT信號通路的作用機制研究①

武豪杰 張明輝 洪成智 李 遵 陳欣欣（河南大學淮河醫(yī)院骨科，開封475001）

類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種全身慢性自身免疫性疾病，以滑膜炎、組織增生、血管翳形成和骨質損傷為典型特征，患者常有關節(jié)腫脹、疼痛、功能障礙甚至關節(jié)畸形等［1］。該病發(fā)病率及致殘率高，嚴重影響患者的生存質量，臨床治療以藥物、外科治療、免疫和生物療法為主，往往給患者帶來沉重的經(jīng)濟負擔［2］。肉桂（Cinnamomum cassiaPresl）是我國傳統(tǒng)中藥材，具有廣泛的藥理作用，也是一種常用的食品調味劑［3］。桂皮醛（Cinnamaldehyde，Cin）是肉桂的主要有效成分，多項研究證實Cin對RA具有治療作用，但具體機制尚不清楚［4-6］。近年來，有研究報道JAK∕STAT信號通路的激活與關節(jié)炎多細胞因子水平升高相關，在關節(jié)炎的發(fā)病過程中起重要作用［7］。因此，本研究以JAK∕STAT信號通路為切入點，采用IL-1β誘導的MH7A人RA成纖維樣滑膜細胞和Ⅱ型膠原誘導的大鼠關節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型，探究Cin對MH7A和CIA大鼠的作用及其相關分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人RA成纖維樣滑膜細胞MH7A，購自上海中科院細胞庫。細胞采用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在5%CO2、37℃、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 動物SPF級SD大鼠40只，6周齡，體重180～220 g，雌雄各半，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司（許可證號：SCXK（京）2017-0011）。實驗動物及飼養(yǎng)條件符合《實驗動物管理條件》要求。

1.1.3 藥品與試劑 桂皮醛（純度＞98%）購自上海一基實業(yè)有限公司；弗氏完全佐劑、牛Ⅱ型膠原蛋白購自碧云天生物技術有限公司；甲氨蝶呤（MTX，2.5 mg×100片）購自上海上藥信誼藥廠有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素混合液（100×）、胰蛋白酶-EDTA消化液、HE染色試劑盒、CCK-8試劑盒、RIPA裂解液、PMSF、脫脂奶粉、ECL發(fā)光液、PVDF轉印膜購自北京索萊寶科技有限公司；IL-6、IL-8、TNF-α ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、GAPDH兔源單克隆抗體、羊抗兔二抗購自美國CST公司；Marker購自SMOBiO公司；中性樹膠購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.4 儀器AE223電子天平購自上海舜宇恒平科學儀器有限公司；By-dzc3000大鼠豚鼠專用電子秤購自北京寶元興業(yè)科技有限公司；37140爪腫測量儀購自意大利Ugo Basile；MET VX200-T型渦旋振蕩器購自施銳（上海）貿(mào)易有限公司；DW-86L626超低溫冰箱購自海爾公司；YA.ZD-10普通型電熱蒸餾水器購自上海申安醫(yī)療器械廠；RM2245切片機購自上海聚慕醫(yī)療器械有限公司；DYCZ-24KS型雙板垂直電泳儀購自北京六一儀器廠；G：BOX多功能凝膠成像系統(tǒng)購自Syngene；Multiskan MK3酶標儀購自Thermo Fisher Scientific；IX53顯微鏡購自日本奧林巴斯；TGL16MB高速冷凍離心機購自長沙湘智離心機儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)MH7A細胞接種在含有10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基，在5%CO2、37℃、飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長至覆蓋培養(yǎng)皿70%～80%時，PBS清洗2次，胰酶消化液處理1 min，用含血清的1640培養(yǎng)基終止消化，1∶3傳代。

1.2.2 CCK-8檢測不同濃度Cin對MH7A細胞活性的影響 將MH7A細胞以5×103個∕孔的濃度接種在96孔板中，每孔100 μl，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細胞貼壁后棄掉培養(yǎng)基，加入含Cin終濃度分別為0、20、40、60、80、100 nnol∕L的培養(yǎng)基90 μl，每組設置6個復孔，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后加入10 μl CCK-8在37℃下繼續(xù)孵育2 h，450 nm處測吸光度，實驗重復3次。

1.2.3 ELISA試劑盒檢測MH7A細胞IL-6、IL-8、TNF-α的含量 將MH7A細胞以5×106個∕孔的濃度接種于6孔板中，細胞過夜貼壁后進行實驗。細胞分為對照組、IL-1β組、IL-1β+Cin組。對照組加入2 ml正常培養(yǎng)基，IL-1β組加入2 ml含20 ng∕ml IL-1β的培養(yǎng)基，IL-1β+Cin組加入2 ml含有20 ng∕ml IL-1β和不同濃度Cin（40、60、80 nnol∕L）的培養(yǎng)基，以上各組細胞放置在5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后收集細胞和其培養(yǎng)上清。細胞用于Western blot法檢測蛋白表達，細胞培養(yǎng)上清用于檢測細胞因子含量。取各組待測細胞培養(yǎng)上清加入到反應孔中，每孔100 μl，每組分別設4個復孔，37℃孵育90 min，棄掉孔內(nèi)液體，加入100 μl生物素化抗體工作液，37℃孵育60 min，棄掉孔內(nèi)液體，洗滌3次，隨后加入100 μl酶結合物工作液，37℃孵育30 min后棄掉孔內(nèi)液體，洗滌5次，每孔加入90 μl底物溶液，37℃孵育15 min，加50 μl終止液，450 nm波長下檢測，按照標準曲線計算各組細胞培養(yǎng)上清中IL-6、IL-8、TNF-α的含量。

1.2.4 Western blot法檢測細胞中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3的蛋白表達 取1.2.3中收集的各組細胞，加入蛋白裂解液置冰上裂解20 min，離心取上清，測定蛋白的濃度，配制15%的分離膠和5%的濃縮膠進行SDS-PAGE電泳，上樣后80 V電泳2 h，60 V轉膜2 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，隨后將條帶放入10 ml的JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3兔源一抗蛋白稀釋液中，一抗稀釋比例為1∶500，4℃過夜，第2天用TBST緩沖液清洗3次，每次10 min。37℃環(huán)境下加入羊抗兔二抗孵育2 h，二抗稀釋比例為1∶1 000，TBST緩沖液清洗3次后滴加ECL發(fā)光液，反應1 min后置于凝膠成像系統(tǒng)顯影。免疫印跡實驗的內(nèi)參蛋白為GAPDH，用Image J軟件分析各個蛋白對應的灰度值，計算蛋白的相對表達量，蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值∕內(nèi)參蛋白灰度值。

1.2.5 Ⅱ型膠原誘導的大鼠CIA模型的制備 從40只大鼠中隨機選取30只造CIA模型，另外10只大鼠為對照組。將Ⅱ型膠原和弗氏完全佐劑混合均勻，乳化，制成1 g∕L的乳劑，按照0.1 ml∕只的劑量在造模大鼠尾根部皮下注射，7 d后再進行1次加強注射，對照組以同樣的方法在相同部位注射等量生理鹽水，造模時間共計14 d［8］。CIA模型的成功與否以關節(jié)炎評分（arthritis index，AI）進行判斷。采用4分制標準進行AI評分：0分為各足跖未見腫脹；1分為足跖輕度腫脹；2分為足跖中度腫脹；3分為足跖部位重度腫脹；4分為足跖部和踝關節(jié)部均腫脹或呈畸形。將前后四足累計評分作為AI評分，評分為4分以上的大鼠認定為造模成功，最大評分為16分［9］。

1.2.6 分組及給藥 取造模成功的大鼠根據(jù)體重隨機分為模型組、Cin組（75 mg∕kg）、甲氨蝶呤組（MTX，1 mg∕kg），每組10只，給藥方法為灌胃給藥，給藥體積為10 ml∕kg。模型組和對照組大鼠灌胃給予等量蒸餾水。于造模成功后第2天開始給藥，1次∕d，連續(xù)21 d［1］。

1.2.7 測量大鼠AI評分和足跖容積 分別在造模第14、21、28、35天時，記錄AI評分；在大鼠踝關節(jié)處做標記，在造模前、造模第14、21、28、35天時采用爪腫測量儀測量大鼠左后足跖容積［10］。

1.2.8 ELISA試劑盒檢測大鼠血清中IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α的水平 給藥21 d后結束實驗，大鼠麻醉后腹主動脈取血，放在4℃冰箱中靜置2 h，3 000 r∕min離心10 min，分離血清。采用ELISA試劑盒檢測大鼠血清中IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α的水平，具體流程同1.2.3。

1.2.9 HE染色觀察各組大鼠關節(jié)組織病理學改變 試驗結束后，處死大鼠，分離其后肢踝關節(jié)，置于10%的福爾馬林中固定，隨后進行脫鈣、組織脫水、制作組織蠟塊、切片，切片厚度為4 μm。組織切片置于載玻片上，使用二甲苯脫蠟30 min，不同濃度梯度的乙醇溶液中復水，然后使用蘇木精和伊紅染液分別染細胞核和細胞質，脫水后用中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察各組大鼠關節(jié)組織的病理改變。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS25.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，GraphPad Prism 8.0作圖。實驗重復3次，計量資料以±s表示，多樣本比較采用單因素方差分析，兩樣本比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CCK-8法檢測Cin對MH7A細胞活性的影響結 果 顯 示：不 同 濃 度 的Cin（0、20、40、60、80、100 nmol∕L）對MH7A細胞活性的影響無顯著差異（P＞0.05）。表明Cin在0～100 nmol∕L濃度范圍內(nèi)不影響MH7A細胞的活性。因此，課題組在隨后的實驗中選擇40、60和80 nmol∕L劑量的Cin研究其對RA的潛在治療作用，見圖1。

圖1 CCK-8法檢測Cin對MH7A細胞活性的影響Fig.1 CCK-8 method to detect effect of Cin on activity of MH7A cells

2.2 各組MH7A細胞培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-8和TNF-α的含量 藥物干預后24 h，與對照組比較，IL-1β組MH7A細胞培養(yǎng)上清中IL-6、IL-8、TNF-α含量升高，IL-1β+Cin組細胞培養(yǎng)上清中炎癥因子的水平則顯著降低，呈劑量依賴性（P＜0.05），說明Cin可抑制IL-1β誘導的MH7A細胞釋放炎癥因子，見表1。

表1 各組MH7A細胞培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-8和TNF-α含量（±s，n=3）Tab.1 Contents of IL-6，IL-8 and TNF-α in MH7A cell culture supernatant of each group（±s，n=3）

表1 各組MH7A細胞培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-8和TNF-α含量（±s，n=3）Tab.1 Contents of IL-6，IL-8 and TNF-α in MH7A cell culture supernatant of each group（±s，n=3）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs IL-1β group.

Groups Control IL-1β IL-1β+Cin-40 IL-1β+Cin-60 IL-1β+Cin-80 IL-6（ng∕ml）1.09±0.02 11.54±0.551）10.02±0.981）8.42±0.671）2）3.20±0.321）2）IL-8（ng∕ml）1.01±0.01 55.23±4.231）52.87±5.571）50.21±3.241）30.19±2.251）2）TNF-α（pg∕ml）3.94±0.12 14.89±0.911）13.23±0.861）12.01±1.021）2）7.65±0.841）2）

2.3 各 組MH7A細 胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達 藥物干預后24 h，與對照組比較，IL-1β組MH7A細 胞 中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白相對表達水平顯著增加（P＜0.05）；與IL-1β組 比 較，IL-1β+Cin組MH7A細 胞 中JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白相對表達水平降低，Cin抑制了JAK2和STAT3蛋白的磷酸化，呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 Western blot檢測各組MH7A細胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達情況Fig.2 Protein expression levels of JAK2，p-JAK2，STAT3，p-STAT3 in MH7A cells of each group were determined by Western blot

2.4 Cin對CIA大鼠AI和足跖腫脹度的影響 造模第14天，模型組、Cin組和MTX組大鼠后足出現(xiàn)明顯紅腫，體積增大，AI顯著升高，說明造模成功。與模型組比較，給藥后Cin組和MTX組大鼠AI指數(shù)和足跖容積均顯著降低（P＜0.01），表明Cin和MTX可顯著抑制CIA大鼠的足跖腫脹，降低AI評分，見表2。

表2 Cin對CIA大鼠AI評分和足跖容積的影響（±s，n=10）Tab.2 Effect of Cin on AI score and paw volume of CIA rats（±s，n=10）

表2 Cin對CIA大鼠AI評分和足跖容積的影響（±s，n=10）Tab.2 Effect of Cin on AI score and paw volume of CIA rats（±s，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs model group.

Groups Control Model Cin MTX AI score 14 d-9.53±1.21 9.51±1.33 9.49±1.02 21 d-9.96±1.23 8.51±1.192）8.49±1.062）28 d-10.11±1.18 7.02±1.072）7.31±1.252）35 d-11.15±1.24 7.21±1.062）7.33±1.192）Paw volume∕ml 0 d 1.73±0.09 1.73±0.08 1.72±0.09 1.73±0.08 14 d 1.74±0.09 2.38±0.131）2.26±0.121）2.30±0.111）21 d 1.74±0.08 2.48±0.111）2.23±0.121）2）2.29±0.091）2）28 d 1.74±0.10 2.97±0.121）2.09±0.111）2）2.18±0.111）2）35 d 1.75±0.09 3.37±0.121）2.01±0.091）2）2.07±0.081）2）

2.5 各組大鼠血清中IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α的水平 與對照組比較，模型組大鼠血清中炎癥因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，Cin組和MTX組大鼠血清中炎癥因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α的表達水平均顯著降低（P＜0.05），見圖3。

圖3 各組大鼠血清IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α含量比較Fig.3 Comparison of serum IL-6，IL-8，IL-1β and TNFα levels in rats in each group

2.6 Cin對CIA大鼠關節(jié)滑膜組織病理變化的影響 對照組大鼠關節(jié)組織病理切片可見清晰關節(jié)腔，無炎癥細胞浸潤，未見組織增生。與對照組比較，模型組大鼠關節(jié)組織病理切片可見滑膜細胞明顯增生，組織間隙縮小，關節(jié)面明顯粗糙且有大量炎癥細胞浸潤和血管新生；與模型組比較，Cin組大鼠給藥治療后組織增生明顯減少，炎癥細胞浸潤的現(xiàn)象顯著減輕；同樣，MTX組也緩解了CIA大鼠的關節(jié)組織損傷和炎癥反應，見圖4。

圖4 各組大鼠關節(jié)滑膜組織病理學觀察（×100）Fig.4 Histopathological observation of joint synovium of rats in each group（×100）

3 討論

RA屬于自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)以關節(jié)慢性炎癥、疼痛腫脹、四肢運動障礙為主，嚴重者可導致關節(jié)畸形、喪失基本功能，使患者生存質量受到極大影響，是危及人類生命健康的主要疾病之一［11］。實驗及臨床研究證明，中藥及其有效成分對RA的治療效果顯著，可多成分、多靶點影響RA的發(fā)生發(fā)展及轉歸［12-13］。桂皮醛是我國傳統(tǒng)中藥肉桂的主要活性成分，常被用作香料和食品添加劑。現(xiàn)代研究表明，肉桂具有抗菌、抗炎、抗腫瘤，治療糖尿病和肥胖等代謝系統(tǒng)疾病的作用［14-15］。研究發(fā)現(xiàn)，桂皮醛可能對RA疾病具有一定的抑制作用，但其作用機制尚未明了［16］。本研究采用人滑膜成纖維細胞MH7A和Ⅱ型膠原誘導的大鼠關節(jié)炎模型研究桂皮醛對RA的作用，以探討其作用機制。

RA的發(fā)生機制復雜，大量研究表明，滑膜成纖維細胞在RA疾病中具有重要作用，活化的滑膜成纖維細胞是滑膜組織中炎癥介質和促炎因子的主要來源，而炎癥因子的濃度往往與患者的臨床癥狀、炎癥指標、疾病活動和血清生物指標等密切相關，抑制炎癥因子的水平則可顯著降低滑膜細胞活化導致的骨侵蝕和關節(jié)破壞［17-18］。本研究結果顯示，IL-1β誘導24 h后，IL-1β組MH7A細胞培養(yǎng)上清中炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α含量顯著升高，使用不同濃度的Cin處理后，MH7A細胞上清中IL-6、IL-8、TNF-α含量降低，表明Cin可抑制IL-1β誘導的炎癥因子釋放。與體外實驗結果一致，在體內(nèi)實驗中，我們發(fā)現(xiàn)模型組大鼠后足明顯紅腫、體積增大，AI顯著升高，血清中炎癥因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α表達水平亦顯著升高，與模型組比較，Cin組大鼠AI指數(shù)和足跖容積均顯著降低，血清炎癥因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α的表達水平亦顯著降低，表明Cin可減少關節(jié)炎大鼠炎癥因子的分泌，改善大鼠AI指數(shù)，減輕關節(jié)腫脹程度。RA疾病的治療中最重要的目標即通過預防骨質破壞來維持正常的關節(jié)功能［19］。本研究中，我們采用HE染色觀察Cin對關節(jié)炎大鼠關節(jié)組織病理變化的影響，結果顯示，模型組大鼠的關節(jié)組織切片可見明顯滑膜組織增生，組織間隙縮小，關節(jié)面明顯粗糙且有大量炎癥細胞浸潤現(xiàn)象，而Cin可顯著減輕Ⅱ型膠原所致的關節(jié)組織炎癥細胞浸潤和骨質破壞，表明Cin能夠改善關節(jié)炎大鼠關節(jié)組織病變，減輕關節(jié)損傷。JAK∕STAT信號通路是一種高度保守的信號轉導途徑，在機體的免疫調節(jié)和炎癥過程中具有重要作用［20］。ZHU等［21］研究發(fā)現(xiàn)，JAK∕STAT信號通路關鍵蛋白的活化可促進RA過程中滑膜成纖維細胞增生、促炎細胞因子釋放和骨質破壞。YANG等［22］研究證明，抑制JAK∕STAT信號通路活化使膠原誘導型關節(jié)炎大鼠的成纖維樣滑膜細胞Bcl-2表達水平降低，Bax表達水平升高，細胞凋亡顯著，抑制JAK∕STAT信號通路是目前治療RA的一種潛在新途徑。本研究Western blot檢測結果顯示，IL-1β的誘導可使MH7A細胞中JAK2和STAT3蛋白相對表達水平及其磷酸化水平升高，而不同濃度的Cin則降低了細胞中JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白相對表達水平，抑制JAK2和STAT3蛋白磷酸化程度，表明Cin可抑制JAK∕STAT信號通路的活化。

綜上所述，Cin可能通過抑制JAK∕STAT信號通路活化，減少滑膜成纖維細胞釋放炎癥因子而產(chǎn)生的RA的治療作用，可改善RA疾病的關節(jié)腫脹、炎癥反應和骨質損傷現(xiàn)象。Cin可能是RA的潛在治療藥物。