miR-377調(diào)控THEM4對(duì)高糖誘導(dǎo)的人近端腎小管上皮細(xì)胞EMT的作用

譚德敏 曾雨如 向海燕 張明霞 劉 珊 張 瑤（湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院腎內(nèi)科，恩施445000）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）被定義為腎臟受累的糖尿病，表現(xiàn)為蛋白尿和∕或腎小球?yàn)V過(guò)率受損［1］。DN是一種微血管并發(fā)癥，可引起腎纖維化進(jìn)展，最終導(dǎo)致不可逆的腎損害［2］。目前，DN的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，普遍接受的假說(shuō)包括基底膜增厚、腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）積累、腎小球硬化、腎小管間質(zhì)纖維化（tubulointerstitial fibrosis，TIF）等［3-4］。上皮細(xì)胞向運(yùn)動(dòng)性間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過(guò)程稱為EMT，EMT在發(fā)育、傷口愈合和干細(xì)胞行為中是不可或缺的，并在病理學(xué)上有助于纖維化和癌癥的進(jìn)展［5］。既往研究表明，EMT與DN的加速纖維化有關(guān)，腎小管細(xì)胞在受到損傷或局部激活后會(huì)失去上皮表型并獲得間質(zhì)細(xì)胞特有的纖維化特征［6］。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的RNA，主要通過(guò)與mRNA的3′非編碼區(qū)（3′untranslated region，3′UTR）的不完全互補(bǔ)結(jié)合，作為轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的生理和病理調(diào)節(jié)因子。miRNA在包括糖尿病性腎病在內(nèi)的多種腎臟疾病中異常表達(dá)，成為DN重要的治療干預(yù)靶點(diǎn)［7-8］。有研究發(fā)現(xiàn)微小RNA-377（microRNA-377，miR-377）與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且發(fā)現(xiàn)在DN患者中miR-377異常高表達(dá)，可能與腎臟病變程度有關(guān)，但miR-377對(duì)高糖誘導(dǎo)的人近端腎小管上皮細(xì)胞EMT的影響及其機(jī)制目前還未有研究［9-10］。硫酯酶超家族成員4（thioesterase superfamily member 4，THEM4）在DN中發(fā)揮重要作用，THEM4低表達(dá)可能引起糖尿病小鼠腎小管間質(zhì)ECM沉積［11］?；诖?，本研究構(gòu)建高糖損傷近端腎小管上皮細(xì)胞HK-2模型，觀察miR-377在其中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞EMT的影響，并結(jié)合THEM4探索其可能的作用機(jī)制，為DN腎小管EMT提供潛在的干預(yù)靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 人近端腎小管上皮細(xì)胞HK-2購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；miR-377、anti-miR-377、pcDNA3.1-THEM4、si-THEM4及各自的陰性對(duì)照購(gòu)自廣州銳博生物有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative realtime polymerase chain reaction，qPCR）相關(guān)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；THEM4蛋白一抗購(gòu)自美國(guó)Protein Tech公司；E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗購(gòu)自美國(guó)Cellular Signaling Technology公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)HK-2細(xì)胞加入DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。2～3 d換液1次，按照1：3的比例接種傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與處理 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2細(xì)胞，以適當(dāng)密度接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞融合至70%，嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000試劑說(shuō)明書指示，將miR-377、anti-miR-377、pcDNA3.1-THEM4、si-THEM4及各自的陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞，并使用30 mmol∕L葡萄糖處理。將細(xì)胞分為正常葡萄糖組（NG組：5 mmol∕L葡萄糖）、高糖組（HG組：30 mmol∕L葡萄糖）、HG+miR-NC組（HG+轉(zhuǎn)染miR-NC）、HG+miR-377組（HG+轉(zhuǎn)染miR-377）、HG+anti-miR-NC組（HG+轉(zhuǎn)染anti-miR-NC）、HG+anti-miR-377組（HG+轉(zhuǎn)染anti-miR-377）、HG+miR-377+pcDNA3.1組（HG+共 轉(zhuǎn) 染miR-377+pcDNA3.1）、HG+miR-377+pcDNA3.1-THEM4組（HG+共轉(zhuǎn)染miR-377+pcDNA3.1-THEM4）、HG+miR-377+si-NC組（HG+共轉(zhuǎn)染miR-377+si-NC）和HG+miR-377+si-THEM4組（HG+共轉(zhuǎn)染miR-377+si-THEM4）組。48 h后收集細(xì)胞備用。

1.2.3 qPCR檢測(cè)miR-377表達(dá) 使用Trizol試劑提取HK-2細(xì)胞中的RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制成cDNA，根據(jù)qPCR試劑盒說(shuō)明書，進(jìn)行miR-377表達(dá)的測(cè)定。miR-377正向引物序列為5′-GAGCAGAGGTTGCCCTTG-3′，反向引物序列為5′-ACAAAAGTTGCCTTTGTGTGTGA-3′（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為53 bp）。內(nèi)參GAPDH正向引物序列為5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，反向引物序列為5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。miR-377的表達(dá)量通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算得出。

1.2.4 Western blot檢 測(cè)Vimentin、E-cadherin、THEM4蛋白表達(dá)HK-2細(xì)胞加入裂解液以提取總蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測(cè)定蛋白濃度，吸取30 μg蛋白樣品進(jìn)行10% SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%脫脂奶粉封閉1 h，4℃條件下加入Vimentin、E-cadherin、THEM4一抗（稀釋度為1：1 000）孵育過(guò)夜，之后加入二抗（稀釋度為1：5 000）室溫孵育2 h，置增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液顯影，以GAPDH為內(nèi)參，分析Vimentin、E-cadherin、THEM4蛋白條帶灰度值。

1.2.5 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)Starbase網(wǎng)站（http：∕∕starbase.sysu.edu.cn∕）預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-377與THEM4的3′UTR部分堿基 可形成互補(bǔ)配對(duì)。分別構(gòu)建包含miR-377結(jié)合位點(diǎn)的野生型THEM4（WT-THEM4）或 突 變 型THEM4（MUTTHEM4）3′UTR報(bào)告基因載體，利用Lipofectamine 2000試劑將miR-NC、miR-377分別與WT-THEM4、MUT-THEM4共轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)48 h后檢測(cè)雙熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。所有計(jì)量數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過(guò)表達(dá)miR-377對(duì)高糖誘導(dǎo)的人近端腎小管上皮細(xì)胞HK-2 EMT的影響qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，與NG組相比，HG誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中miR-377表達(dá)量明顯升高；與HG+miR-NC組相比，HG+miR-377組miR-377表 達(dá) 量 明 顯 升 高（P＜0.05，圖1A）。Western blot檢 測(cè)發(fā)現(xiàn)，與NG組相比，HG誘 導(dǎo)的HK-2細(xì)胞內(nèi)Vimentin蛋白表達(dá)量明顯升高，E-cadherin蛋白水平明顯降低；與HG+miR-NC組相比，HG+miR-377組HK-2細(xì)胞的Vimentin蛋白表達(dá)量明顯升高，E-cadherin蛋白水平明顯降低（P＜0.05，圖1B、C）。

圖1 過(guò)表達(dá)miR-377對(duì)高糖誘導(dǎo)的人近端腎小管上皮細(xì)胞HK-2 EMT的影響Fig.1 Effect of overexpression of miR-377 on EMT of high glucose-induced human proximal renal tubu?lar epithelial cells HK-2

2.2 抑制miR-377對(duì)高糖誘導(dǎo)的人近端腎小管上皮細(xì)胞HK-2 EMT的影響qPCR檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示，與NG組相比，HG誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中miR-377表達(dá)量明顯升高；與HG+anti-miR-NC組相比，HG+antimiR-377組miR-377表達(dá)量明顯降低（P＜0.05，圖2A）。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，與NG組相比，HG誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞內(nèi)Vimentin蛋白水平明顯升高，Ecadherin蛋白表達(dá)量明顯降低；與HG+anti-miR-NC組相比，HG+anti-miR-377組Vimentin蛋白水平明顯降低，E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯升高（P＜0.05，圖2B、C）。

圖2 抑制miR-377對(duì)高糖誘導(dǎo)的人近端腎小管上皮細(xì)胞HK-2 EMT的影響Fig.2 Effect of inhibition of miR-377 on EMT of high glu?cose-induced human proximal renal tubular epithe?lial cells HK-2

2.3 miR-377靶向調(diào)控THEM4 Starbase網(wǎng)站預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，THEM4的3′UTR含有與miR-377互補(bǔ)的核苷酸序列（圖3A）。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-NC組 相比，miR-377明 顯抑 制WT-THEM4的熒光素酶活性（P＜0.05），對(duì)MUT-THEM4熒光素酶活性無(wú)明顯影響（圖3B）。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，與miR-NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-377明顯降低THEM4蛋白的表達(dá)；與anti-miR-NC組相比，轉(zhuǎn)染anti-miR-377明顯提高THEM4蛋白水平（P＜0.05，圖3C、D）。

圖3 miR-377靶向調(diào)控THEM4Fig.3 miR-377 targets regulates THEM4

2.4 過(guò)表達(dá)THEM4能逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-377對(duì)高糖誘導(dǎo)的人近端腎小管上皮細(xì)胞HK-2 EMT的影響 與HG+miR-377+pcDNA3.1組相比，HG+miR-377+pcDNA3.1-THEM4組HK-2細(xì)胞中THEM4、E-cadherin蛋白水平明顯升高，Vimentin蛋白表達(dá)量明顯降低（P＜0.05，圖4）。

圖4 過(guò)表達(dá)THEM4能逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-377對(duì)高糖誘導(dǎo)的人近端腎小管上皮細(xì)胞HK-2 EMT的影響Fig.4 Overexpression of THEM4 reversed effect of over?expression of miR-377 on EMT of high glucose-in?duced human proximal renal tubular epithelial cells HK-2

2.5 抑制THEM4能逆轉(zhuǎn)抑制miR-377對(duì)高糖誘導(dǎo)的人近端腎小管上皮細(xì)胞HK-2 EMT的影響 與HG+miR-377+si-NC組相比，HG+miR-377+si-THEM4組HK-2細(xì)胞的THEM4、E-cadherin蛋白表達(dá)明顯降低，Vimentin蛋白水平明顯升高（P＜0.05，圖5）。

圖5 抑制THEM4能逆轉(zhuǎn)抑制miR-377對(duì)高糖誘導(dǎo)的人近端腎小管上皮細(xì)胞HK-2 EMT的影響Fig.5 Inhibition of THEM4 reversed effect of miR-377 on EMT of high glucose-induced human proximal re?nal tubular epithelial cells HK-2

3 討論

DN是腎衰竭的主要原因，也是糖尿病的主要致死并發(fā)癥。DN的自然病史包括腎小球超濾，進(jìn)行性尿蛋白，腎小球?yàn)V過(guò)率下降，最后是終末期腎?。?2］。作為糖尿病的主要并發(fā)癥之一，約20%～40%的1型和2型糖尿病患者受DN的影響，最終發(fā)展為終末期腎?。?3］。盡管目前有大量治療方法側(cè)重于處理DN的主要指標(biāo)，包括高血糖和高血壓，但仍有大量患者遭受持續(xù)進(jìn)展性和嚴(yán)重的腎損傷［14］。因此，表征DN的早期生物標(biāo)志物，制定減輕DN嚴(yán)重程度的治療策略，可阻止DN向終末期腎病進(jìn)展，改善患者的健康結(jié)果。

研究表明，高血糖刺激的EMT在啟動(dòng)和進(jìn)展DN的腎纖維化中起關(guān)鍵作用［15］。腎小管EMT包括4個(gè)步驟：?jiǎn)适掀ぜ?xì)胞的黏附特性、獲得間充質(zhì)細(xì)胞表型、破壞腎小管基底膜以及遷移至腎間質(zhì)［16］。其特點(diǎn)是上皮表面標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)減少，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin表達(dá)增加［5］。本研究中，與NG組相比，HG誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中Vimentin蛋白表達(dá)明顯增加，E-cadherin蛋白水平明顯降低，與既往研究一致［17］。

miRNA在眾多疾病中扮演至關(guān)重要的角色，包括糖尿病、心血管疾病、腎臟疾病和癌癥［18］。大量資料顯示，腎臟中miRNA的異常表達(dá)可能導(dǎo)致DN的發(fā)生和發(fā)展［19］。此外，幾種miRNA被認(rèn)為是腎EMT的重要介質(zhì)，如miR-188-5p、miR-145等［20-21］。miR-377已被證明參與糖尿病常見(jiàn)的并發(fā)癥，被視為糖尿病并發(fā)癥預(yù)防策略的潛在新靶點(diǎn)。高糖誘導(dǎo)miR-377水平增加，而miR-377的下調(diào)通過(guò)直接上調(diào)靶基因SIRT1來(lái)抑制高糖、缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞血管生成和炎癥，影響糖尿病視網(wǎng)膜病變進(jìn)展［22］。miR-377在DN小鼠腎臟組織中表達(dá)上調(diào)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA?；撬嵘险{(diào)基因1（long non-coding RNA taurine-upregulated gene 1，lncRNA TUG1）通過(guò)下調(diào)miR-377表達(dá)水平減輕高葡萄糖引起的腎小球細(xì)胞ECM積累［23］。然而miR-377對(duì)在DN細(xì)胞EMT中的功能尚未可知。本研究中，qPCR檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示，與NG組相比，HG誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中miR-377表達(dá)量明顯增加，與前述研究相同。過(guò)表達(dá)miR-377顯著增加高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中Vimentin蛋白表達(dá)量，明顯降低E-cadherin蛋白水平，抑制miR-377則反之，可以降低Vimentin蛋白水平而顯著增加E-cadherin蛋白表達(dá)量。表明miR-377在高糖誘導(dǎo)的人近端腎小管上皮細(xì)胞EMT過(guò)程中可能具有促進(jìn)作用。

據(jù)報(bào)道，過(guò)表達(dá)THEM4可抑制高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞膠原分泌［24］。在糖尿病小鼠腎組織中，THEM4 mRNA和蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，過(guò)表達(dá)THEM4可明顯減輕糖尿病小鼠ECM積聚［25］。以上研究表明，THEM4能夠減輕DNECM沉積，從而發(fā)揮一定的保護(hù)作用。本項(xiàng)研究中，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，THEM4是miR-377的功能性靶基因。并且，上調(diào)或下調(diào)miR-377明顯抑制或促進(jìn)THEM4的蛋白表達(dá)。過(guò)表達(dá)THEM4能逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-377促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞Vimentin蛋白表達(dá)的作用，并逆轉(zhuǎn)其抑制E-cadherin蛋白表達(dá)的作用。同時(shí)，抑制THEM4能逆轉(zhuǎn)抑制miR-377對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞內(nèi)Vimentin蛋白表達(dá)的抑制作用，以及對(duì)E-cadherin蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用。這些結(jié)果證實(shí)，靶向調(diào)控THEM4的表達(dá)可能是miR-377誘導(dǎo)高糖損傷的近端腎小管上皮細(xì)胞HK-2 EMT的重要途徑之一。

綜上所述，miR-377在高糖誘導(dǎo)的人近端腎小管上皮細(xì)胞明顯上調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-377可誘導(dǎo)EMT過(guò)程，抑制其表達(dá)時(shí)作用相反，其作用機(jī)制與靶向調(diào)控THEM4表達(dá)有關(guān)，為DN的發(fā)病機(jī)制提供了新的見(jiàn)解。