金黃色葡萄球菌類腸毒素K對(duì)T淋巴細(xì)胞活化特點(diǎn)及抗腫瘤活性研究①

何亞南 孫鈺椋 任雅坤 張勝輝 陳童彤 路依林 郭 睿 劉彥禮 李永海 林俊堂

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，新鄉(xiāng)453003）

金黃色葡萄球菌腸毒素（Staphylococcal enterotoxins，SEs）是由金黃色葡萄球菌分泌的一類外毒素，由于其超抗原活性成為研究重點(diǎn)［1］。作為典型超抗原，SEs通過直接與主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ類分子（major histocompatibility complex classⅡ，MHCⅡ）非限定性結(jié)合，無需抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）加工呈遞便可以完整分子形式遞呈給T淋巴細(xì)胞，從而活化大量具有特異性TCR Vβ亞群的T淋巴細(xì)胞（5%～20%，包括CD4+和CD8+T細(xì)胞），隨后釋放大量細(xì)胞因子，如IL-2、IFN-γ及TNF-α等，同時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，尤其對(duì)MHCⅡ陽性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)殺傷作用［2-3］。因此，SEs誘導(dǎo)的免疫激活作用已被廣泛用于抗腫瘤免疫治療研究［4］。但SEs具有誘發(fā)機(jī)體嘔吐、腹瀉和發(fā)熱等毒副作用，一定程度上限制了其臨床應(yīng)用［5］。

隨著SEs研究深入，2004年國(guó)際命名委員會(huì)將SEs家族的1個(gè)亞組命名為金黃色葡萄球菌類腸毒素（Staphylococcal enterotoxin-like，SEls）［6］，其具有與典型SEs相似的結(jié)構(gòu)及超抗原活性，但無致嘔等副作用，在臨床治療惡性腫瘤中具有潛在應(yīng)用價(jià)值，并已有相關(guān)報(bào)道［7］。目前已鑒定出一系列SEls成員，包括SElJ、SElK-Q、SElU、SElV和SElX等［8-10］。課題組前期已成功構(gòu)建并表達(dá)高純度SElK［11］。本研究旨在研究SElK對(duì)T淋巴細(xì)胞的活化作用，并分析其體內(nèi)外抗腫瘤活性，為進(jìn)一步闡明SElK超抗原活性提供理論基礎(chǔ)，以期促進(jìn)SElK在臨床腫瘤治療中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞、外周血6～8周齡SPF級(jí)BALB∕c雌性小鼠，體重（24±2）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均獲得我院動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)批準(zhǔn)，并按照中國(guó)動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)要求進(jìn)行操作；腫瘤細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存；本研究中所用外周血樣本均由本實(shí)驗(yàn)室志愿者知情同意情況下捐贈(zèng)，相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作符合我院倫理委員會(huì)要求。

1.1.2 主要試劑MTT購(gòu)自Sigma公司；FBS（胎牛血清）、DMEM高糖培養(yǎng)基和RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；超純RNA提取試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛公司；5×All-In-One RT MasterMix和Prime ScriptTMRT Master Mix購(gòu)自TaKaRa公司；CD4-PE和CD8-FITC購(gòu)自ebioscience公司；細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天。

1.1.3 主要儀器HR40-IIA2型超凈工作臺(tái)（青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司）；L3-5K型臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）；MCO-18AC型CO2培養(yǎng)箱（上海普和希健康醫(yī)療器械有限公司）；FACSCalibur型流式細(xì)胞儀（BD公司）；5020型PCR儀（Thermo公司）；ABI Prism 7500型qPCR儀（Applied Biosystems公 司）；SpectraMax?i3型酶標(biāo)儀（Molecular Devices公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾淋巴細(xì)胞及人PBMCs分離提取 無菌條件下分離小鼠脾臟，研磨后獲得脾細(xì)胞懸液，100 μm不銹鋼篩網(wǎng)過濾，紅細(xì)胞裂解液裂解2次，PBS洗2次，含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至1×107個(gè)∕ml備用?？鼓苤行迈r外周血與PBS等體積稀釋，常規(guī)密度梯度離心分離獲得人PBMCs，加入紅細(xì)胞裂解液裂解殘留紅細(xì)胞，洗2次，含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基重懸PBMCs，調(diào)整細(xì)胞密度至2×106個(gè)∕ml備用。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù) 小鼠脾淋巴細(xì)胞（終密度5×106個(gè)∕ml）接種至6孔板，2 ml∕孔，加入SElK（終濃度1 μg∕ml）37℃、5%CO2下刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞72 h；收集細(xì)胞，PBS洗2次，100 μl PBS重懸，分別加入CD4-PE和CD8-FITC單克隆抗體4℃避光孵育30 min，PBS洗2次，Guava easyCyte流式細(xì)胞儀檢測(cè)，F(xiàn)lowJo軟件分析。

1.2.3 qPCR將調(diào)整后的小鼠脾淋巴細(xì)胞（終密度5×106個(gè)∕ml）與SElK（終濃度1 μg∕ml）共 培 養(yǎng)48 h，超純RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，5×All-In-One RT Master Mix試劑盒反轉(zhuǎn)錄1 μg RNA獲得cDNA，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒及ABI Prism 7500進(jìn)行qPCR反應(yīng)，檢測(cè)目的基因表達(dá)。小鼠源β-actin、IFN-γ、顆粒酶A（Granzyme A）和顆粒酶B（Granzyme B）特異性引物序列見表1［12-13］，2-ΔΔCt法計(jì)算，7500 Software v2.3軟件分析數(shù)據(jù)。調(diào)整后的人PBMCs（終密度1×106個(gè)∕ml）與SElK（終濃度1 μg∕ml）共培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞cDNA。參考文獻(xiàn)［14］相對(duì)定量法及特異性引物進(jìn)行Vβ譜分析，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本Vβ和Cβ的絕對(duì)拷貝數(shù)，計(jì)算各Vβ百分比=（Vβn∕Cβ）×100%。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將小鼠脾淋巴細(xì)胞（終密度5×106個(gè)∕ml）接種到至6孔板，3 ml∕孔，加入SElK（終濃度0.1、1.0和10 μg∕ml）與小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液37℃、5%CO2共培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，按照Annexin V-FITC∕PI凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 體外抗腫瘤活性檢測(cè) 人PBMCs作為效應(yīng)細(xì)胞，BT474和A431細(xì)胞作為靶細(xì)胞，檢測(cè)SElK的體外抗腫瘤活性。靶細(xì)胞（BT474：8×103個(gè)∕100 μl，A431：3×103個(gè)∕100 μl）依次接種于96孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)12 h后移除舊培養(yǎng)基，PBS洗2次，加入人PBMCs懸液（2×105個(gè)∕50 μl），加入PBS（50 μl）孔作為對(duì)照；分別加入連續(xù)稀釋的SE1K（50 μl，終濃度0.1、1.0和10 μg∕ml）孔作為SElK處理組；SElK刺激的人PBMCs（終濃度0.1、1.0和10 μg∕ml）孔作為空白組；僅加入RPMI1640培養(yǎng)基為背景組。37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h后加入20 μl MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h。2 000 r∕min離心10 min，吸出液體，120 μl∕孔依次加入DMSO。將96孔板置于酶標(biāo)儀中振蕩20 s，設(shè)置測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm，參考波長(zhǎng)為630 nm，檢測(cè)各孔吸光度（A），計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率（%）=｛1-［（ASElK處理組-A背景組）-（A空白組-A背景組）］∕（A對(duì)照組-A背景組）｝×100%。

1.2.6 體內(nèi)抗腫瘤活性檢測(cè) 小鼠腫瘤模型建立：取8只小鼠，在第0天皮下注射200 μl（2×106個(gè)∕只）小鼠乳腺癌細(xì)胞（EMT-6）至小鼠右腋下，第1天將小鼠隨機(jī)分成2組：實(shí)驗(yàn)組［SElK，尾靜脈注射30 μg∕（200 μl·只）］，對(duì)照組（尾靜脈注射等體積PBS），每組4只，第5、10、5、20、25天分別注射PBS或SElK。第5天開始每5 d觀察腫瘤組織大小，計(jì)算腫瘤體積（mm3）=最長(zhǎng)直徑×最短直徑2∕2，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)（第30天）處死小鼠，分離腫瘤組織，拍照并稱重。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用Dunnett檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SElK對(duì)T淋巴細(xì)胞亞型增殖的影響SElK（1 μg∕ml）可顯著刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞增殖，與對(duì)照組相比，SElK刺激后可顯著促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞增殖，二者百分比分別提高1.40倍（P＜0.05）和1.25倍（P＜0.01，圖1A、B）。

2.2 SElK顯著刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞中相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)qPCR法檢測(cè)SElK體外刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞48 h后，脾淋巴細(xì)胞中IFN-γ、顆粒酶A和B基因表達(dá)量顯著升高，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞標(biāo)志物顆粒酶A和B表達(dá)變化更為顯著（P＜0.01，圖1C）。

圖1 SElK對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞的活化作用Fig.1 Effect of SElK on mouse derived T lymphocytes ac?tivation

2.3 SElK對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SElK刺激48 h后小鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡情況，不同濃度SElK（0.1、1.0和10 μg∕ml）刺激組與未刺激組均呈現(xiàn)明顯凋亡現(xiàn)象，但與未刺激組相比，不同濃度SElK處理組中淋巴細(xì)胞早期凋亡比例變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，晚期凋亡比例明顯降低（P＜0.01），正?；罴?xì)胞比例顯著提高（P＜0.01，圖2）。表明SElK可顯著激活脾淋巴細(xì)胞并維持其活性，進(jìn)而延緩細(xì)胞凋亡。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SElK刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞48 h后細(xì)胞凋亡情況Fig.2 Apoptosis of splenic lymphocytes stimulated by SElK for 48 h were analyzed by flow cytometry

2.4 SElK體外刺激人T淋巴細(xì)胞中Vβ的表達(dá)譜 根據(jù)目前已建立的qPCR法檢測(cè)SElK體外刺激人PBMCs特異性Vβ T淋巴細(xì)胞的增殖譜，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，SElK可激活攜帶TCR Vβ5（P＜0.01）、TCR Vβ17（P＜0.05）和TCR Vβ20（P＜0.05）亞群的T淋巴細(xì)胞，攜帶TCR Vβ5的T淋巴細(xì)胞最為顯著（圖3）。

圖3 SElK激活人PBMCs特異性TCR Vβ譜Fig.3 SELK activates TCR Vβ spectrum specific to hu?man PBMCs

2.5 SElK體外顯著抑制腫瘤生長(zhǎng) 采用MTT法檢測(cè)SElK對(duì)BT474和A431腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，SElK在體外刺激人PBMCs后對(duì)腫瘤細(xì)胞BT474及A431的殺傷作用較強(qiáng)，在體外具有顯著抗腫瘤活性（P＜0.01），腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為90%以上（圖4A）。

2.6 SElK體內(nèi)顯著抑制腫瘤生長(zhǎng) 為進(jìn)一步檢測(cè)SElK的體內(nèi)抑瘤活性，實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)實(shí)時(shí)檢測(cè)腫瘤體積，結(jié)果表明自15 d起，各檢測(cè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)SElK對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)具有明顯抑制作用（圖4B，P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束時(shí)，分離小鼠腫瘤組織，可明顯觀察到SElK（30 μg∕只）處理組小鼠腫瘤組織較PBS對(duì)照組小鼠腫瘤組織縮?。▓D4C）；重量檢測(cè)結(jié)果表明SElK（30 μg∕只）處理組小鼠體內(nèi)腫瘤組織重量較PBS對(duì)照組小鼠腫瘤組織重量顯著降低（圖4D，P＜0.01）。

圖4 SElK體內(nèi)外抗腫瘤活性檢測(cè)Fig.4 Antitumour effect of SElK in vitro and in vivo

3 討論

腫瘤嚴(yán)重威脅人類健康，盡管可通過手術(shù)、放化療等手段治療，但依然存在復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，現(xiàn)有抗腫瘤藥物不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用，同時(shí)也會(huì)影響正常細(xì)胞功能和存活，具有嚴(yán)重副作用。傳統(tǒng)腫瘤治療方法的局限性促使研究者尋找新的替代療法，而通過免疫增強(qiáng)劑激活宿主自身免疫力具有廣闊前景。腫瘤免疫治療是利用自身免疫系統(tǒng)對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞進(jìn)行特異性殺傷，并盡可能地降低副作用，是繼化療和靶向治療后最具前景的腫瘤治療方法之一［15］。

SEs作為典型的細(xì)菌外毒素，早在1989年就已將該類能夠誘導(dǎo)極強(qiáng)免疫學(xué)活性的蛋白命名為超抗原［16］。而作為超抗原家族成員，SEs通過與MHCⅡ類分子和特定TCR Vβ鏈可變區(qū)結(jié)合，有效激活具有特異性TCR Vβ片段的T淋巴細(xì)胞，發(fā)揮潛在高效的抗腫瘤作用［17］。已有大量報(bào)道證實(shí)SEs具有較強(qiáng)的腫瘤治療潛力，并在基礎(chǔ)及臨床研究中證實(shí)SEs治療后可產(chǎn)生較強(qiáng)的抗腫瘤作用［18］。我國(guó)SEA、SEB和SEC2已被用作腫瘤治療的補(bǔ)充藥物成分。作為經(jīng)典的超抗原，SEA可有效抑制黑色素瘤生長(zhǎng)［19］；SEB在體外和體內(nèi)都能激活T淋巴細(xì)胞抑制膀胱腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或?qū)⑵渲苯託纾?0］；SEC2一直被用作腫瘤治療的輔助藥物［21］。盡管SEs在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出較強(qiáng)的潛能，但其自身固有的腸毒性及致嘔毒性產(chǎn)生嚴(yán)重副作用，限制了其作為新型抗腫瘤制劑的應(yīng)用，而致嘔吐毒性較低的SEls的發(fā)現(xiàn)為開發(fā)新型抗腫瘤制劑提供了候選藥物［22］。

因此，本研究重點(diǎn)分析SElK對(duì)T淋巴細(xì)胞的活化效果，并驗(yàn)證其體內(nèi)外抗腫瘤活性，進(jìn)一步闡明SElK的超抗原特性，結(jié)果顯示，SElK刺激后小鼠脾淋巴細(xì)胞中CD4+T和CD8+T淋巴細(xì)胞百分比顯著上調(diào)，尤其是CD4+T淋巴細(xì)胞。作為輔助性T淋巴細(xì)胞，CD4+T淋巴細(xì)胞可引導(dǎo)免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的攻擊；而CD8+T淋巴細(xì)胞是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞死亡的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的主要參與者，可直接殺滅腫瘤細(xì)胞［23］。qPCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SElK可顯著刺激人PBMCs中攜帶TCR Vβ5、17和20亞群的T淋巴細(xì)胞增殖。同時(shí)SEs激活的T淋巴細(xì)胞可分泌大量細(xì)胞因子，對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷至關(guān)重要［24］。本研究結(jié)果亦表明，SElK激活的小鼠脾淋巴細(xì)胞中，IFN-γ、顆粒酶A和B基因表達(dá)顯著增加，尤其是顆粒酶A和B基因表達(dá)呈劑量依賴性增加，與CD8+T淋巴細(xì)胞上調(diào)結(jié)果一致，表明SElK刺激后顯著增強(qiáng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活性。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，不同濃度SElK處理組中，盡管對(duì)淋巴細(xì)胞的早期凋亡無明顯影響，但可顯著降低晚期凋亡細(xì)胞比例，且活細(xì)胞比例顯著增加，表明SElK在淋巴細(xì)胞凋亡過程中可維持細(xì)胞活性進(jìn)而減少淋巴細(xì)胞凋亡。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SElK可通過促進(jìn)T淋巴細(xì)胞活化和細(xì)胞因子釋放發(fā)揮其潛在抗腫瘤活性，因此，SElK激活的人PBMCs在體外對(duì)人腫瘤細(xì)胞BT474和A431生長(zhǎng)具有強(qiáng)烈抑制作用，抑制率達(dá)90%以上。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SElK在免疫系統(tǒng)正常的小鼠腫瘤模型中發(fā)揮較強(qiáng)的抗腫瘤作用，SElK治療后可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。但SElK治療后尚未完全殺死腫瘤細(xì)胞，小鼠體內(nèi)腫瘤仍在繼續(xù)生長(zhǎng)，表明臨床上SElK與放化療聯(lián)用可能抗腫瘤效果更佳。

綜上，本研究表明，SElK可顯著促進(jìn)T淋巴細(xì)胞活化，并釋放大量細(xì)胞因子，最終誘導(dǎo)其體內(nèi)外較強(qiáng)的抗腫瘤活性，豐富了對(duì)SElK超抗原特性的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也為其在臨床腫瘤免疫治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。