響應(yīng)面優(yōu)化榆黃蘑的液體發(fā)酵工藝

魯 鐵，尚浩樂，張少營，楊宣宣，馮蓉琴，陳懷中，包潤澤，謝朝暉

(1.河南城建學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南 平頂山 467036； 2.平頂山健康食品協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 平頂山 467036)

榆黃蘑(Pleurotuscitrinopileatus)隸屬于傘菌目口蘑科側(cè)耳屬，又名金頂側(cè)耳、金頂蘑、玉皇蘑，屬木腐真菌，常生長于闊葉樹的枯木之上，具有較強的分解木質(zhì)素與纖維素的能力，是一種藥食功能兼具的天然真菌[1]。其特點為菌蓋呈草黃色至鮮黃色的光滑漏斗狀，直徑3～10 cm，菌肉白色，柄偏生，菌蓋鮮黃、油亮[2]。該菌主要分布在東北、華北、華南、西藏等地。

榆黃蘑香味濃郁、味道鮮美，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、微量元素和礦物質(zhì)，具有多種生理藥理活性物質(zhì)[3-4]。其中多糖是主要的活性成分之一[5]，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎、抗衰老、降血糖[6]等生物活性，因此深受消費者青睞。研究發(fā)現(xiàn)榆黃蘑液體發(fā)酵菌球提取液能夠明顯增強小白鼠的體液免疫系統(tǒng)和細胞免疫功能[7]，提取的胞外多糖能有效抑制體外S-180癌細胞[8]，并能對CY有減毒作用,增強小鼠免疫功能[9]。榆黃蘑中含有8種必需氨基酸和12種微量元素且重金屬含量較低，對人體危害較小[10]。

目前，榆黃蘑的人工栽培還處于起步階段，榆黃蘑的報道主要集中在多糖的提取以及活性的測定方面。雖然可以通過人工栽培獲得其子實體，但是人工栽培食用菌具有周期長、成本高的缺點。因此，研究榆黃蘑的液體發(fā)酵工藝能有效縮短培養(yǎng)周期，降低栽培成本。榆黃蘑液體發(fā)酵的研究較少，王偉曾對榆黃蘑的液體發(fā)酵條件進行了研究[11]，對榆黃蘑碳源、氮源、無機鹽的選擇尚未見公開報道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

試驗所用菌種來源于平頂山健康食品協(xié)同創(chuàng)新中心，菌絲體通過長白山自然保護區(qū)二道白河鎮(zhèn)野生子實體經(jīng)組織分離獲得。

1.1.2 試劑

木糖、酵母膏、葡萄糖、乳糖、無水乙醇、果糖、瓊脂粉、蔗糖、過磷酸鈣、麥芽糖、胰蛋白胨、可溶性淀粉、牛肉膏、硝酸銨、硝酸鉀、氯化銨、磷酸二氫銨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鉀、硫酸鉀、碳酸鈣、維生素等。

1.2 儀器

Systec V-40型高壓蒸汽滅菌鍋；HWS-1000F型恒溫培養(yǎng)箱；GZX-9023MBE型鼓風(fēng)干燥箱；DLHR-D2802型恒溫振蕩器；SW-CJ-2F型潔凈工作臺。

1.3 試驗方法

1.3.1 試劑和培養(yǎng)基的配制

PDA 斜面培養(yǎng)基(1 L)：馬鈴薯200 g(煮汁)、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g。

種子培養(yǎng)基(1 L)：葡萄糖10 g、蔗糖10 g、酵母膏2 g、牛肉膏2 g、蛋白胨2 g、KH2PO42 g、MgSO41 g。

1.3.2 榆黃蘑菌絲干重的測定

將發(fā)酵得到的菌絲體經(jīng)純水沖洗后，使用100目篩絹過濾，置于鼓風(fēng)干燥箱中55 ℃烘干至恒質(zhì)量，精度0.01 g電子天平稱質(zhì)量[12]。

1.3.3 菌種活化和種子液的制備

菌種活化：將轉(zhuǎn)接斜面保存的榆黃蘑接種到PDA培養(yǎng)基中，置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，待其長滿后接種。

種子液的制備：使用打孔器接入10塊直徑為1 cm的菌塊，接入裝液量100 mL于250 mL搖瓶種子培養(yǎng)基中，于25 ℃、150 r·min-1培養(yǎng)7 d[13]。

1.3.4 單因素試驗

單因素液體發(fā)酵培養(yǎng)最佳單因素的篩選：按3個變量組合優(yōu)化培養(yǎng)基，在基本培養(yǎng)基基礎(chǔ)之上進行變量的考量，具體參考方案如下。

(1)在碳源單因素試驗中，以碳源為變量，固定氮源和無機鹽。碳源單因素分別為：C1葡萄糖、C2蔗糖、C3可溶性淀粉、C4木糖、C5乳糖、C6果糖、C7麥芽糖、C8不添加(對照組)；每種碳源的質(zhì)量濃度均為20 g·L-1。

(2)在氮源單因素試驗中，以氮源為變量，固定碳源和無機鹽。氮源的單因素分別為：N1胰蛋白胨、N2酵母膏、N3牛肉膏、N4硝酸銨、N5硝酸鉀、N6氨化銨、N7磷酸二氫銨、N8不添加(對照組)；每種氮源的質(zhì)量濃度均為6 g·L-1。

(3)在無機鹽單因素試驗中，以無機鹽為變量，固定碳源和氮源。無機鹽的單因素分別為：W1磷酸氫二鉀、W2磷酸二氫鉀、W3氯化鉀、W4硫酸鉀、W5硫酸鎂、W6碳酸鈣、W7過磷酸鈣、W8不添加(對照組)；每種無機鹽的質(zhì)量濃度均為1 g·L-1。

單因素培養(yǎng)條件為25 ℃、150 r·min-1，培養(yǎng)6 d，生物學(xué)重復(fù)3次。以最大菌絲體產(chǎn)生量作為響應(yīng)值對象篩選出三個因素的最優(yōu)值[14]。

1.3.5 多因素試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，篩選出對榆黃蘑生物量影響最為顯著的碳源、氮源、無機鹽，利用中心組合旋轉(zhuǎn)設(shè)計(Box-Benhnken)法做響應(yīng)面的研究，優(yōu)化三個影響因素，擬合響應(yīng)值方程，解得最佳配比，并預(yù)測最優(yōu)結(jié)果。多因素試驗結(jié)果使用Design-Expert 8.0程序進行分析。

試驗過程中使用容量為250 mL的三角錐形瓶，裝100 mL培養(yǎng)基，接種量5%的榆黃蘑菌種，搖床轉(zhuǎn)速為150 r·min-1，培養(yǎng)一周，每組試驗生物學(xué)重復(fù)3次。(注意試驗前種子的制備)

1.3.6 出菇試驗

使用多因素試驗中的最佳培養(yǎng)配方對榆黃蘑菌種進行制備，將獲得的發(fā)酵產(chǎn)物在無菌條件下接種至處理好的栽培袋中。栽培配方為棉籽殼75%、麥麩15%、玉米粉8%、石膏粉1%、蔗糖1%，培養(yǎng)料含水量為65%。培養(yǎng)料裝袋121 ℃下高壓滅菌2 h，制成培養(yǎng)袋，對其進行發(fā)菌、出菇試驗[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

磷源、氮源、無機鹽對菌絲體生物量的影響分別如圖1～圖3所示。

2.1.1 碳源對菌絲體生物量的影響

由圖1可知，可溶性淀粉是榆黃蘑最佳的碳源，其菌絲體干重為3.83 g·L-1，可溶性淀粉對榆黃蘑菌絲體生長較有利(圖中誤差線均表示標準誤差)。

圖1 碳源單因素試驗結(jié)果

2.1.2 氮源對菌絲體生物量的影響

由圖2可知，牛肉膏是榆黃蘑最佳的氮源，其菌絲體干重為2.43 g·L-1，牛肉膏對榆黃蘑菌絲體生長較有利。

圖2 氮源單因素試驗結(jié)果

2.1.3 無機鹽對菌絲體生物量的影響

由圖3可知，碳酸鈣是榆黃蘑最佳的無機鹽，其菌絲體干重為2.80 g·L-1，碳酸鈣對榆黃蘑菌絲體生長較有利。

圖3 無機鹽單因素試驗結(jié)果

2.2 多因素響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基配方

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，中心點設(shè)置為：碳源為可溶性淀粉、氮源為牛肉膏、無機鹽為碳酸鈣，響應(yīng)面試驗因素水平及編碼如表1所示。依照此試驗設(shè)計，進行3次水平試驗，得到平均值，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Design-Expert 8.0軟件，得到最終響應(yīng)面結(jié)果如表2所示。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗結(jié)果

通過Design Expert 8.0 Trial軟件對表3數(shù)據(jù)進行非線性回歸的二次項擬合后，得到相應(yīng)的回歸方程：

Y=-6.185 31+0.285 82X1+4.936 94X2+3.144 0X3+4.444 44X1X2- 0.028 121 1X1X3-0.036 667X2X3-5.282 22X12-0.906 00X22-0.527 11X32

由模型中系數(shù)的顯著性檢驗可知：碳源、氮源、無機鹽的一次項對榆黃蘑菌絲體生長的影響達到極顯著水平(P<0.01)[16];氮源與碳源、無機鹽的交互作用均未達到顯著水平；碳源與無機鹽的交互作用達到極顯著水平(P<0.01)；三種因素的二次項均達到極顯著水平(P<0.01)。由F值可知：各因素對榆黃蘑菌絲生長的影響依次為：氮源(B)>無機鹽(C)>碳源(A)；分析方差表明：此模型達到極顯著水平(P<0.01)，模型的失擬項不顯著(P=0.889 5>0.05)，說明該方程擬合良好。因此，各因素值和響應(yīng)值之間的關(guān)系可以用此模型進行函數(shù)化，該回歸方程可以對試驗結(jié)果進行分析預(yù)測。

用Desing-Expert 8.0軟件對二次多項式回歸方程進行計算求解，得出適宜榆黃蘑生長的培養(yǎng)基的優(yōu)化值為：可溶性淀粉22.09 g·L-1、牛肉膏2.73 g·L-1、碳酸鈣2.30 g·L-1，菌絲體干重可達7.33 g·L-1。等高線和響應(yīng)面圖分別如圖4～圖6所示。

圖4 可溶性淀粉和牛肉膏對榆黃蘑菌絲體產(chǎn)量影響的等高線和響應(yīng)面圖

圖5 可溶性淀粉和碳酸鈣對榆黃蘑菌絲體產(chǎn)量影響的等高線圖和響應(yīng)面圖

圖6 可溶性淀粉和碳酸鈣對榆黃蘑菌絲體產(chǎn)量影響的等高線圖和響應(yīng)面圖

2.3 驗證試驗

在最優(yōu)條件下通過3次重復(fù)試驗，測得實際榆黃蘑干重為7.20 g·L-1，其標準差為0.12，與理論偏差1.77%，計算得到RMSE為7.20，實際值與理論值基本相符，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的培養(yǎng)基參數(shù)可靠，具有一定參考價值。

2.4 出菇試驗結(jié)果

使用上述試驗優(yōu)化獲取的液體菌種，接種量為每包10 mL，菌絲生長為白色、健壯，培養(yǎng)出的榆黃蘑如圖7、圖8所示。

圖7 榆黃蘑子實體(正面)

圖8 榆黃蘑子實體(背面)

3 結(jié)論

以榆黃蘑為研究對象，利用不同的培養(yǎng)基對其進行培養(yǎng)，并將菌絲干重作為響應(yīng)值對其進行培養(yǎng)基優(yōu)化。通過碳源、氮源、無機鹽三個因素進行試驗分析，最終得到榆黃蘑培養(yǎng)基最佳發(fā)酵條件。在此基礎(chǔ)上選取每個單因素最佳的三個因子，基于響應(yīng)面試驗的中心組合法探索三者的交互效應(yīng)，得到最佳培養(yǎng)基配方為：可溶性淀粉22.09 g·L-1、牛肉膏2.73 g·L-1、碳酸鈣2.30 g·L-1，得到的菌絲體干重可達7.20 g·L-1。

以最佳的液體發(fā)酵培養(yǎng)條件制備出菌種進行榆黃蘑的栽培試驗，栽培的榆黃蘑發(fā)菌速度快，且生長旺盛，適合進一步的推廣應(yīng)用。