Bcl-2、Caspase-3、Apo2.7在胃癌變過(guò)程中的表達(dá)及與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性研究

熊 見(jiàn)，魏宇燕△，李 亮，段 松

重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院：1.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科；2.消化內(nèi)科；3.病理科，重慶 404000

目前，胃癌是世界上常見(jiàn)的惡性腫瘤，全世界每年有超過(guò)120萬(wàn)新發(fā)胃癌病例，我國(guó)約占40%，病死率居第2位[1]。胃癌的發(fā)生是由多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，在正常情況下，胃黏膜上皮細(xì)胞的增殖和凋亡之間保持動(dòng)態(tài)平衡,細(xì)胞調(diào)控機(jī)制的紊亂與胃癌的發(fā)生關(guān)系密切[2-4]。B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和凋亡細(xì)胞相關(guān)抗體(Apo2.7)是細(xì)胞凋亡基因中的重要成員，在細(xì)胞凋亡機(jī)制網(wǎng)絡(luò)中居中心地位[5-6]，目前對(duì)其研究多采用免疫組化的方法，以定性和半定量為主，而流式定量檢測(cè)較為少見(jiàn)。由于免疫組化染色方法的局限性，其陰性結(jié)果對(duì)疾病進(jìn)程的診斷不及定量方法明確。本研究選取不同類(lèi)型的凋亡調(diào)控相關(guān)基因，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其在胃癌變過(guò)程中的表達(dá)情況，結(jié)合對(duì)照免疫組化染色陽(yáng)性表達(dá)情況，研究其與胃癌進(jìn)程的相關(guān)性，探討其在胃癌早期診斷中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2019年10月至2020年6月在重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院進(jìn)行胃鏡檢查的364例受檢者的364例標(biāo)本，其中男204例，年齡35～84歲，中位年齡51歲；女160例，年齡29～81歲，中位年齡59歲；經(jīng)病理診斷[7]為正常胃黏膜(NOR)73例，慢性淺表性胃炎(CSG)80例，慢性萎縮性胃炎(CAG)67例，腸上皮化生 (IM)35例，黏膜上皮異型增生(GIN) 48例，胃癌 61例。

1.2儀器與試劑 免疫組化染色兔抗人Bcl-2、Caspase-3及Apo2.7單克隆抗體均采用美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞抗體PE Caspase-3(美國(guó)BD，克隆:19/Caspase-3/CPP32，分類(lèi)號(hào):610322)；PE Bcl-2(美國(guó)BD，克隆:N46-467，分類(lèi)號(hào):562532)；PE Apo2.7(法國(guó)Immunotech S.A.S)；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit Ⅰ(美國(guó)BD,分類(lèi)號(hào):556421)；組織勻漿儀(美國(guó)BD-GINimachine-90 250)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD FACSCanto Ⅱ)。

1.3方法

1.3.1單細(xì)胞懸液制備 消化內(nèi)窺鏡下取新鮮或冷凍組織(1～2 mm)，用磷酸鹽緩沖液(PBS)浸濕。將組織和1 mL PBS放入已預(yù)洗過(guò)的勻漿盤(pán)中，將勻漿盤(pán)插入組織勻漿儀中進(jìn)行組織粉碎1 min。用7 μm孔徑濾器過(guò)濾并用PBS沖洗濾器獲得細(xì)胞懸液，洗下的細(xì)胞放于試管內(nèi)，250×g離心細(xì)胞懸液5 min。棄上清液用PBS重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)節(jié)細(xì)胞水平至5×105～1×106/mL。

1.3.2流式標(biāo)本制備 (1)100 μL單細(xì)胞懸液冷破膜后分別加入20 μL Bcl-2、Caspase-3抗體及同型對(duì)照，2～8 ℃孵育15～30 min，加2 mL PBS(2～8 ℃)后250×g離心5 min，棄上清液，0.5 mL PBS重懸細(xì)胞沉淀備檢。(2)Apo2.7檢測(cè)：取100 μL細(xì)胞懸液各加在2支試管中，然后加100 μg/mL的Digitonin冰浴透膜20 min，2 mL PBS 250×g離心5 min棄上清液，各加20 μL Apo2.7-PE單抗及同型對(duì)照，室溫暗處孵育30 min后PBS洗滌，加入含2.5%小牛血清的PBS 0.5 mL重懸置冰浴中備檢。(3)細(xì)胞凋亡檢測(cè)管加入5 μL的FITC-Annexin V和5 μL的PI工作液及100 μL單細(xì)胞懸液，室溫暗處孵育15 min，0.4 mL PBS重懸備檢。

1.3.3免疫組化染色 運(yùn)用免疫組化染色SP法檢測(cè)所有標(biāo)本Bcl-2、Caspase-3及Apo2.7的表達(dá)。主要步驟：(1)將4 μm切片脫蠟，梯度乙醇脫水；(2)將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)，微波熱修復(fù)10 min；(3)3%H2O2去離子水室溫孵育10 min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS沖洗3次，每次3 min；(4)除去PBS，滴加非免疫性血清，室溫下孵育10 min，濾紙吸干；(5)滴加50 μL第一抗體，4 ℃過(guò)夜，PBS沖洗3次，每次3 min；(6)依次加第二、第三抗體，室溫下各孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min；(7)每張切片加入100 μL二氨基聯(lián)苯胺顯色液；(8)自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染；(9)自來(lái)水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明；(10)干燥封片。

1.3.4免疫組化結(jié)果判定 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒顯像判為陽(yáng)性反應(yīng)。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的百分率分成4 個(gè)等級(jí)：陰性(-)，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞；+，陽(yáng)性細(xì)胞百分率<30%；++，陽(yáng)性細(xì)胞百分率為30%～70%；+++，陽(yáng)性細(xì)胞百分率>70%。

2 結(jié) 果

2.1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果比較 在由CSG向胃癌演變的過(guò)程中，細(xì)胞凋亡率及Caspase-3、Apo2.7表達(dá)率逐漸降低，而B(niǎo)cl-2則在這一演變的過(guò)程中表達(dá)率逐漸增加，至胃癌期到達(dá)高峰。除GIN組的細(xì)胞凋亡率及Apo2.7表達(dá)率與胃癌組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，其余各組與胃癌組間細(xì)胞凋亡率及Apo2.7表達(dá)率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CAG、IM、GIN、胃癌組與NOR組比較，細(xì)胞凋亡率及Caspase-3、Apo2.7表達(dá)率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組Bcl-2、Caspase-3和Apo2.7表達(dá)率及細(xì)胞凋亡率見(jiàn)表1，變化趨勢(shì)見(jiàn)圖1。

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況及Bcl-2、Caspase-3、Apo2.7表達(dá)情況

圖1 Bcl-2、Caspase-3和Apo2.7表達(dá)率及細(xì)胞凋亡率在各組病變中的變化趨勢(shì)

2.2Bcl-2、Caspase-3及Apo2.7的表達(dá)率與細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性分析 Bcl-2表達(dá)率與細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)(r=-1.198,P<0.05),Caspase-3、Apo2.7的表達(dá)率與細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)(r=0.852、0.867,P<0.05)。

2.3免疫組化結(jié)果比較 不同組間Bcl-2、Caspase-3和Apo2.7的免疫組化陽(yáng)性率見(jiàn)表2。各基因型表達(dá)陽(yáng)性程度和免疫組化陽(yáng)性率同流式細(xì)胞表達(dá)率趨勢(shì)較一致。除GIN組的Apo2.7免疫組化陽(yáng)性率與胃癌組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，其余各組與胃癌組Apo2.7免疫組化陽(yáng)性率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CAG、IM、GIN、胃癌組與NOR組比較，Bcl-2、Caspase-3和Apo2.7的免疫組化陽(yáng)性率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組Bcl-2、Caspase-3、Apo2.7免疫組化結(jié)果比較

3 討 論

胃癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其中腺癌在胃的惡性腫瘤中占95%。胃癌早期癥狀和體征不典型，出現(xiàn)明顯癥狀和體征時(shí)已屬中晚期，我國(guó)每年胃癌新發(fā)病例約為67.9萬(wàn)，同期死亡人數(shù)更高達(dá)49.8萬(wàn)[8]。研究表明，“慢性胃炎-胃黏膜萎縮-IM-異型增生-胃癌”為胃癌的病理學(xué)發(fā)展模式，胃黏膜細(xì)胞凋亡率的進(jìn)行性下降導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)增殖并呈高增生狀態(tài)，過(guò)度增殖狀態(tài)的細(xì)胞更易受到致癌物質(zhì)的損傷，從而增加了DNA畸變的風(fēng)險(xiǎn)，最終可能導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。研究表明Bcl-2和Caspase-3是重要的兩種凋亡抑制基因，其表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在密切的關(guān)系[9-10]。Bcl-2是TSUJIMOTO等最早從伴有t(14；18)(q32；q21)染色體易位的B細(xì)胞淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)的原癌基因，而Caspase-3是Caspase系統(tǒng)中導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵成分，它是細(xì)胞線(xiàn)粒體依賴(lài)凋亡途徑的重要因素，處于凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，是細(xì)胞凋亡效應(yīng)期的重要中心分子。Apo2.7最早是由ZHANG等[11]報(bào)道的新的細(xì)胞凋亡標(biāo)志物，有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，主要通過(guò)線(xiàn)粒體途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡,在凋亡檢測(cè)中極具前景，是凋亡細(xì)胞的一個(gè)早期反應(yīng)。線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)和功能障礙是各種刺激因素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的中心事件，單抗能與線(xiàn)粒體膜蛋白特異性結(jié)合，并由此導(dǎo)致線(xiàn)粒體內(nèi)凋亡因子釋放，參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。Apo2.7參與該調(diào)節(jié)，與Bcl-2密切相關(guān)。

本研究顯示，Bcl-2、Caspase-3及Apo2.7的表達(dá)與細(xì)胞凋亡率亦存在相關(guān)性，通過(guò)Bcl-2的高表達(dá)及Caspase-3和Apo2.7基因的表達(dá)下調(diào)，使細(xì)胞凋亡過(guò)程受到抑制，細(xì)胞凋亡率呈趨勢(shì)性下降，細(xì)胞凋亡與增殖比例失調(diào)可致癌變概率增大，這與劉愛(ài)群等[12]或楊靜等[13]通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)胃病變組織中Bcl-2及Caspase-3的研究結(jié)果一致。同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn)，Bcl-2、Caspase-3及Apo2.7的免疫組化陽(yáng)性率進(jìn)展與流式細(xì)胞表達(dá)率趨勢(shì)一致，Bcl-2陽(yáng)性率漸行性增高，Caspase-3和Apo2.7漸行性降低，其蛋白表達(dá)陽(yáng)性程度亦與其陽(yáng)性率趨勢(shì)相符。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各指標(biāo)可在胃黏膜病變中全程量化，而免疫組化染色各指標(biāo)只能半定量監(jiān)測(cè)，各病變期仍存在陰性標(biāo)本，特異性不足，體現(xiàn)了流式細(xì)胞術(shù)相對(duì)于免疫組化方法在臨床應(yīng)用中的一大優(yōu)勢(shì)。

本研究資料顯示了在胃癌變過(guò)程中，細(xì)胞凋亡率、Bcl-2、Caspase-3及Apo2.7的量變關(guān)系，通過(guò)分析其變化趨勢(shì)可對(duì)胃癌的早期診斷及病程監(jiān)測(cè)提供參考，亦說(shuō)明了細(xì)胞凋亡調(diào)控在胃黏膜細(xì)胞異常增殖及癌變過(guò)程中所起的作用。監(jiān)測(cè)細(xì)胞凋亡率以及Bcl-2、Caspase-3、Apo2.7在胃黏膜組織中的定量表達(dá)情況，可推斷其疾病進(jìn)展情況。