水城小黃姜總黃酮提取工藝優(yōu)化及抗氧化作用研究

翁貴英李金輝朱淼謝斐

（1六盤(pán)水師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，貴州 六盤(pán)水553001；2六盤(pán)水師范學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，貴州 六盤(pán)水553001）

生姜為姜科（Zingiberaceae）姜屬(Zingiber)植物姜（Zingiber officinale Roscoe）的根莖，具有抗過(guò)敏、抗腫瘤、降膽固醇、抗氧化、促進(jìn)血液循環(huán)、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)以及解毒等多種生理作用[1]，是藥食同源的保健植物品種。生姜中含有多酚、黃酮[2]、嘌呤、姜油[3]等多種生物活性成分，是其發(fā)揮重要生理功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。

黃酮類化合物是植物體內(nèi)大量存在的一類物質(zhì)，在延緩衰老、消炎鎮(zhèn)痛、預(yù)防癌癥等多個(gè)方面具有明顯功效[4]，同時(shí)還具有顯著的抗氧化活性?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，腫瘤、炎癥及退行性疾病等均與自由基的清除存在一定聯(lián)系，因此，抗氧化活性是預(yù)防和抵抗多種疾病的重要方法[5]。

水城小黃姜?dú)v史悠久，據(jù)《水城廳志·食貨》記載早在乾隆年間水城即盛產(chǎn)小黃姜。其產(chǎn)地主要分布于水城區(qū)的發(fā)耳鎮(zhèn)、新街鄉(xiāng)、都格鎮(zhèn)、雞場(chǎng)鄉(xiāng)、楊梅鄉(xiāng)、營(yíng)盤(pán)鎮(zhèn)以及龍場(chǎng)鄉(xiāng)等。其中以發(fā)耳小黃姜品質(zhì)為上佳，富含硒[6]及多種微量元素[7]，為全國(guó)名特優(yōu)新農(nóng)產(chǎn)品[8]和國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品[9]。目前，關(guān)于水城小黃姜的研究主要集中在農(nóng)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)、高產(chǎn)栽培技術(shù)[10]及微量元素的測(cè)定[7]等方面，對(duì)其黃酮及自由基的清除作用鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究利用L9（34）正交設(shè)計(jì)對(duì)小黃姜黃酮化合物的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，并進(jìn)一步檢測(cè)總黃酮提取液對(duì)亞硝基、DPPH自由基、羥基自由基和ABTS自由基的清除活性，旨在為水城小黃姜的開(kāi)發(fā)和合理利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑與儀器

水城小黃姜采自貴州省水城區(qū)發(fā)耳鎮(zhèn)，采回后洗凈、去皮、切片，自然風(fēng)干，粉碎備用。

蘆丁、硫酸亞鐵、水楊酸、硝酸鋁、過(guò)氧化氫、無(wú)水乙醇、二苯代苦味酰肼自由基(DPPH)、檸檬酸、磷酸二氫鈉、對(duì)氨基苯磺酸、亞硝酸鈉、鹽酸萘乙二胺、95%乙醇、ABTS[2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽]、氫氧化鈉、過(guò)硫酸鉀等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(浙江溫嶺市林大機(jī)械有限公司)、臺(tái)式低速離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司)、電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）、Scientz-IID型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）、722可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京東西儀器有限公司）、DZKW-D水浴鍋（上海菁華科技儀器有限公司)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將干燥的蘆丁10 mg溶于70%乙醇溶液，配置濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別取標(biāo)準(zhǔn)品0 mL、1.5 mL、2.5 mL、3.5 mL、4.5 mL、5.5 mL置于10mL容量瓶，依次加入5.5 mL、4 mL、3 mL、2 mL、1 mL、0 mL的70%乙醇補(bǔ)齊至5.5 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，6 min后再加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，6 min后再加4%的氫氧化鈉溶液4 mL，加70%的乙醇定容，15 min后在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)其吸光度A，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

在乙醇濃度90%、料液比1∶20 g/mL時(shí)，分別檢測(cè)超聲時(shí)間為20 min、30 min、40 min、50 min、60 min條件下的黃酮得率；在乙醇濃度90%、超聲時(shí)間40 min時(shí)，分別檢測(cè)料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL條件下的黃酮得率；在料液比1∶20 g/mL、超聲時(shí)間40 min時(shí)，分別檢測(cè)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、70%、80%、90%、100%條件下的黃酮得率。

1.2.3 水城小黃姜總黃酮提取工藝正交試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比三個(gè)條件進(jìn)行L9(34）正交設(shè)計(jì)，每組重復(fù)三次。詳見(jiàn)表1。

表1 總黃酮提取的正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Variables and levels in the orthogonal experiment design of Extraction Process of Total Flavonoids

1.2.4 水城小黃姜總黃酮抗氧化活性檢測(cè)

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到水城小黃姜總黃酮提取最優(yōu)工藝，并將最優(yōu)條件下的提取液梯度稀釋10、40、80、160和320倍后進(jìn)行抗氧化活性檢測(cè)，參照文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行亞硝基的清除試驗(yàn)[11]、DPPH自由基的清除試驗(yàn)[12]、羥自由基的清除試驗(yàn)[13]、ABTS自由基的清除試驗(yàn)[12]、羥自由基的清除試驗(yàn)[13]、ABTS自由基的清除試驗(yàn)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁濃度（c，mg/ml）為橫坐標(biāo)，以吸光度（A）作為縱坐標(biāo)，作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，詳見(jiàn)圖1，其線性回歸方程為：Y=1.118 3X+0.007 6（R2=0.999 7）。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 The standard curve of rutin

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取時(shí)間對(duì)水城小黃姜黃酮得率影響

提取時(shí)間對(duì)水城小黃姜黃酮得率的影響詳見(jiàn)圖2，總黃酮的得率在0.901%～0.941%之間，隨著提取時(shí)間的增加其總黃酮得率也增加，在提取時(shí)間為40 min時(shí)，水城小黃姜總黃酮得率達(dá)到最高為0.941%，當(dāng)繼續(xù)加大提取時(shí)間時(shí)，總黃酮得率卻降低，最低的得率為0.901%，可能是由于隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，部分黃酮類物質(zhì)有被進(jìn)一步破壞，從而導(dǎo)致得率有所下降[15]，故后續(xù)試驗(yàn)選擇在超聲時(shí)間40 min附近進(jìn)行。2.2.2 不同料液比水城小黃姜總黃酮得率影響不同料液比對(duì)水城小黃姜總黃酮得率影響詳見(jiàn)圖3，其總黃酮的得率0.603%～1.191%之間。當(dāng)料液比為1∶20 g/mL時(shí)水城小黃姜總黃酮得率最高為1.191%，隨料液比增加得率略有降低，綜合考慮成本及提取效果，后續(xù)試驗(yàn)選擇在1∶20 g/mL附近進(jìn)行。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響Figure 2 Effect of extraction time on the yield of flavonoids

圖3 料液比對(duì)黃酮得率的影響Figure 3 Effect of solid-liquid ration on the yield of flavonoids

2.3 正交因素試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)料液比、乙醇濃度及提取時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)，采用SPSS Statistics軟件和Microsoft Excel 2007進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理，詳見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)各條件處理的得率Table 2 Experimental condition and corresponding results

2.2.3 不同乙醇濃度對(duì)水城小黃姜得率影響

不同乙醇濃度對(duì)水城小黃姜得率影響詳見(jiàn)圖4，總黃酮的得率在0.730%～0.890%之間。當(dāng)乙醇濃度為90%時(shí)，水城小黃姜總黃酮得率最高為0.890%，乙醇濃度低于或高于90%，水城小黃姜總黃酮得率均低于0.890%，分析可能是此時(shí)濃度對(duì)水城小黃姜總黃酮溶解度最大，故正交試驗(yàn)選擇在90%乙醇濃度附近進(jìn)行。

圖4 乙醇濃度對(duì)黃酮得率的影響Figure 4 Effect of ethanol concentration on the yield of flavonoids

9均值1均值2均值3極差3(1∶30)0.96 0.83 0.85 0.13 3(100)0.90 0.92 0.82 0.11 2(40)0.85 0.90 0.88 0.05 1 0.92 0.86 0.86 0.06 8.45

極差越大對(duì)黃酮提取的影響就越大，同一個(gè)影響因素中均值大小決定因素的不同水平，均值最大值為該影響因素的最佳水平。由表2可知，料液比是影響提取效果的最重要因素，就總黃酮提取率而言，料液比的均值最大為0.96，乙醇濃度的均值最大0.92，提取時(shí)間均值最大0.90，A因素的1水平，B因素的2水平，C因素的2水平為最優(yōu)工藝條件。三個(gè)因素對(duì)黃酮得率的影響依次為：料液比＞乙醇濃度＞提取時(shí)間。其中水城小黃姜總黃酮提取的最佳條件是料液比1∶15，乙醇濃度90%，超聲時(shí)間40 min。在該工藝條件下，進(jìn)行三次平行試驗(yàn)，得到水城小黃姜總黃酮的平均含量為1.009%，與表中的結(jié)果1.007%相近，進(jìn)一步證明該工藝的穩(wěn)定性。

2.4 抗氧化活性

2.4.1 水城小黃姜總黃酮對(duì)亞硝基的清除率

水城小黃姜總黃酮對(duì)亞硝基的清除率見(jiàn)圖5A，水城小黃姜總黃酮對(duì)對(duì)亞硝基的清除率在55.68%～10.80%之間，樣液稀釋到10倍時(shí)，水城小黃姜總黃酮含量為0.067 mg/mL，清除率最高可達(dá)55.68%。樣液稀釋到320倍時(shí)，水城小黃姜總黃酮含量為0.002 mg/mL，此時(shí)清除率最低為10.80%。在該試驗(yàn)設(shè)定的濃度范圍內(nèi)，不同濃度水城小黃姜總黃酮提取液對(duì)亞硝基均有清除作用，且對(duì)亞硝基的清除率隨著樣液黃酮濃度的增大而增大。

2.4.2 水城小黃姜總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率

水城小黃姜總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率見(jiàn)圖5B,水城小黃姜總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率在80.07%～97.81%之間，樣液稀釋到10倍時(shí)，水城小黃姜總黃酮含量為0.067 mg/mL，此時(shí)清除率為97.81%，當(dāng)樣液稀釋倍數(shù)為320倍時(shí)，水城小黃姜總黃酮含量為0.002 mg/mL，對(duì)DPPH自由基的清除率為80.07%。不同濃度水城小黃姜總黃酮提取液對(duì)DPPH自由基都有清除作用，且隨著水城小黃姜提取液黃酮濃度的增大清除率增大。在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)水城小黃姜總黃酮對(duì)DPPH自由基清除率均大于80%，表明對(duì)DPPH自由基清除率較強(qiáng)。

2.4.3 水城小黃姜總黃酮對(duì)羥自由基的清除率

水城小黃姜總黃酮對(duì)羥自由基的清除率見(jiàn)圖5C,水城小黃姜總黃酮對(duì)亞硝基的清除率在29.13%～60.03%之間。樣液稀釋到10倍時(shí)，水城小黃姜總黃酮含量為0.067 mg/mL，清除率最高可達(dá)60.03%,當(dāng)樣液稀釋倍數(shù)為320倍時(shí)，水城小黃姜總黃酮含量為0.002 mg/mL，清除率僅為10.80%。在該試驗(yàn)設(shè)定的濃度范圍內(nèi)，不同濃度水城小黃姜總黃酮提取液對(duì)羥自由基都有清除作用，且隨著水城小黃姜提取液黃酮濃度的增大清除率增大。

2.4.4 水城小黃姜總黃酮對(duì)ABTS自由基清除率

水城小黃姜總黃酮對(duì)ABTS自由基清除率見(jiàn)圖5D，水城小黃姜總黃酮對(duì)對(duì)亞硝基的清除率在5.21%～98.01%之間，樣液稀釋到10倍時(shí)，水城小黃姜總黃酮含量為0.067 mg/ml，清除率最高可達(dá)98.01%。樣液稀釋倍數(shù)為320倍，水城小黃姜總黃酮含量為0.002 mg/ml，清除率最低為10.80%。在該試驗(yàn)設(shè)定的濃度范圍內(nèi)，不同濃度水城小黃姜總黃酮提取液對(duì)ABTS自由基均有清除作用，且隨著水城小黃姜總黃酮提取液濃度的增大對(duì)其清除率增大。

圖5 抗氧化性試驗(yàn)其中：A為亞硝基的清除率；B為DPPH自由基的清除率；C為羥自由基的清除率；D為ABTS自由基清除率Figure 5 Anti-oxidative activity testNote:A Scavenging rate of nitroso-group;B Scavenging rate of DPPH;C Scavenging rate of hydroxy radical;D Scavenging rate of ABTS

對(duì)水城小黃姜總黃酮提取液進(jìn)行亞硝基、DPPH自由基、羥基自由基和ABTS自由基抗氧化作用實(shí)驗(yàn)，表明其抗氧化作用，隨著水城小黃姜樣液黃酮濃度的增加而增強(qiáng)，整體變化趨勢(shì)一致，該試驗(yàn)設(shè)定的濃度范圍內(nèi)水城小黃姜總黃酮對(duì)DPPH自由基清除率均大于80%，對(duì)DPPH自由基清除率較強(qiáng)，此外，水城小黃姜總黃酮對(duì)亞硝基、DPPH自由基、羥基自由基和ABTS自由基的清除率均出現(xiàn)高于50%的清除率，表明整體抗氧化活性良好。

3 結(jié)論與展望

目前，對(duì)于小黃姜化學(xué)成分提取方法的研究主要集中于多糖[16]、姜精油[17]、姜辣素[18]及姜酚[19]等成分提取工藝的優(yōu)化，對(duì)其黃酮及抗氧化活性方面研究較為薄弱。本研究以水城小黃姜為研究對(duì)象，采用超聲輔助提取總黃酮的方法，利用L9（34）正交設(shè)計(jì)對(duì)工藝進(jìn)行優(yōu)選，并檢測(cè)其總黃酮提取液對(duì)亞硝基、DPPH自由基、羥基自由基和ABTS自由基的清除活性。結(jié)果表明，當(dāng)乙醇濃度90%，料液比1∶15，超聲提取40 min時(shí)，其總黃酮的得率達(dá)到最大值為1.007%，其提取液對(duì)亞硝基、DPPH自由基、羥基自由基和ABTS自由基的清除率均表現(xiàn)出高于50%的清除率，說(shuō)明黃酮提取物的抗氧化活性較強(qiáng)。

隨著貴州省農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和“十二大產(chǎn)業(yè)”向縱深發(fā)展，生姜成為助推脫貧攻堅(jiān)和鄉(xiāng)村振興的優(yōu)勢(shì)品種。水城小黃姜屬貴州三大姜之一，是六盤(pán)水市特色經(jīng)濟(jì)作物。其可食用也可藥用，尤其以發(fā)耳小黃姜品質(zhì)上佳，其因含有的姜揮發(fā)油和姜辣素含量較高（是其他產(chǎn)姜地區(qū)的3至5倍）、辣味濃等優(yōu)質(zhì)特點(diǎn)而成為出口免檢農(nóng)產(chǎn)品。2017年，貴州省水城縣小黃姜種植面積已達(dá)4萬(wàn)余畝，目前該地主要產(chǎn)品為姜茶，其利用率相對(duì)較低，如能充分發(fā)揮生姜的多項(xiàng)功效，開(kāi)發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)且附加值高的姜類產(chǎn)品，將帶來(lái)更大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益，增加種植戶的經(jīng)濟(jì)收入，推動(dòng)水城的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。本研究即對(duì)水城小黃姜黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并檢測(cè)其抗氧化活性，以期為小黃姜的開(kāi)發(fā)利用提供參考。