轉(zhuǎn)基因番木瓜基因組DNA的快速制備和PCR 檢測(cè)方法

潘志文 陳偉庭 高潔兒 周峰 姚涓 王聲斌 姜大剛

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物及植物用微生物生態(tài)環(huán)境安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（廣州）/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510642）

自1996年轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化以來，創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益，為全球的糧食安全、氣候變化和環(huán)境可持續(xù)發(fā)展做出了巨大貢獻(xiàn)。全球轉(zhuǎn)基因作物種植規(guī)模日益擴(kuò)大，根據(jù)國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織（International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications，ISAAA）發(fā)布的報(bào)告，2018年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積接近2億 hm2，主要包括玉米、大豆、棉花等［1］。在我國(guó)，商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物主要包括轉(zhuǎn)基因棉花和轉(zhuǎn)基因番木瓜。

番木瓜（Carica papaya L.）又名木瓜，是著名的“嶺南佳果”。番木瓜生育期內(nèi)易受病害侵染，番木瓜環(huán)斑病毒（papaya ring spot virus，PRSV）的肆虐，導(dǎo)致全球各地的番木瓜品質(zhì)和產(chǎn)量大幅度降低，嚴(yán)重影響相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。1991年，F(xiàn)itch等［2］將PRSV病毒編碼外殼蛋白（coat protein，CP）的基因片段轉(zhuǎn)入番木瓜，培育出抗環(huán)斑病毒病的轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1等品系，并于1998年5月在夏威夷商業(yè)化生產(chǎn)。由我國(guó)自主研發(fā)的轉(zhuǎn)基因番木瓜“華農(nóng)1號(hào)”品系［3］，也于2006年獲得安全證書并準(zhǔn)許商業(yè)化生產(chǎn)。Cheng等［4］研發(fā)的轉(zhuǎn)基因番木瓜GM YK品系也在田間表現(xiàn)出優(yōu)良的抗性。鑒于轉(zhuǎn)基因番木瓜已經(jīng)在我國(guó)批準(zhǔn)商業(yè)化生產(chǎn)，并且具有較大的市場(chǎng)份額，為保護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)和選擇權(quán)，加強(qiáng)對(duì)轉(zhuǎn)基因番木瓜的監(jiān)管，建立和優(yōu)化快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法非常必要。

在轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)方法中，基于PCR的核酸檢測(cè)方法被廣泛應(yīng)用。合適的DNA提取與純化方法在很大程度上決定了PCR檢測(cè)的準(zhǔn)確性與可靠性［5］。DNA的提取過程中要減少各種因素對(duì)核酸的破壞與降解作用，盡量去除材料中的蛋白質(zhì)、多糖以及提取過程中使用的有機(jī)溶劑等雜質(zhì)［6］。因而，DNA提取質(zhì)量直接影響后續(xù)PCR檢測(cè)的質(zhì)量和效率。常用的提取DNA的方法有十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法、十二烷基硫酸鈉（SDS）法、高鹽低pH法、聚乙烯吡咯烷酮法、試劑盒法等，但這些方法都需要多步操作，耗時(shí)繁瑣［6］。因此，快速、簡(jiǎn)易抽提DNA的方法一直是研究的熱點(diǎn)，其中以水稻為材料的報(bào)道較多［7-10］；Zou等［11］研究建立的方法可以在30 s內(nèi)從植物、動(dòng)物或微生物材料中提取得到質(zhì)量較高的核酸用于PCR檢測(cè)，但該方法需要在抽提過程中用濾紙將DNA轉(zhuǎn)移，對(duì)技術(shù)的要求較高?；谝陨?，本研究建立番木瓜材料基因組DNA的簡(jiǎn)易快速制備的方法，大大提升轉(zhuǎn)基因番木瓜檢測(cè)的效率，為轉(zhuǎn)基因番木瓜檢測(cè)提供重要的技術(shù)儲(chǔ)備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本研究所用的非轉(zhuǎn)基因番木瓜臺(tái)農(nóng)2號(hào)、轉(zhuǎn)基因番木瓜華農(nóng)1號(hào)材料均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 本研究所用制備緩沖液（10 mmol/L Tris，0.5 mmol/L EDTA，0.1 mol/L KCl，pH9.5）為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭┖椭卣麴s水配置；PCR試劑TaKaRa Taq Hot Start Version與TaKaRa Premix Ex Taq（Probe qPCR）、6×上樣緩沖液，購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 儀器 本研究所用主要儀器如下：Tissue Lyser高通量組織研磨儀（QIAGEN，德國(guó)）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)Centrifuge 5415R（Eppendorf，德國(guó)）；T100TMThermal Cycler PCR熱循環(huán)儀與CFX Connect Real-Time System實(shí)時(shí)熒光PCR系統(tǒng)，普通電泳系統(tǒng)PowerPac Basic與SUB-CELL Model 96，凝膠成像系統(tǒng)Gel DocXR+（BIO-RAD，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料DNA的制備 根據(jù)不同番木瓜材料，DNA制備方法略有不同。

葉片材料：使用3-5 mm孔徑的圓形打孔器在葉片上打孔，把切割下來的圓形葉片置于2.0 mL離心管中，加入3顆3-5 mm硬質(zhì)合金鋼珠，使用高通量組織研磨儀勻漿。12 000 r/min離心30 s，1片圓形葉片（約25 mg）加入100 μL制備緩沖溶液，渦旋混勻，65℃加熱10 min，12 000 r/min室溫離心10 min。

果肉：稱取100-200 mg果肉置于2.0 mL離心管中，加入3顆3-5 mm硬質(zhì)合金鋼珠，使用高通量組織研磨儀勻漿。12 000 r/min離心30 s，每100 mg材料加入200 μL的制備緩沖溶液，渦旋混勻，室溫靜置10 min，12 000 r/min室溫離心10 min。

吸取經(jīng)過離心后的上清液20 μL，加入制備緩沖溶液進(jìn)行10倍稀釋即為DNA溶液的原液，通過加入制備緩沖溶液進(jìn)行5-25倍稀釋用于PCR檢測(cè)。

1.2.2 引物與探針 Papain基因PCR方法引物探針參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第323號(hào)-1-2020 《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè) 番木瓜內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定性PCR方法》［12］、NPT II基因PCR方法引物探針參考中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1196-2012 《轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè) 玉米檢測(cè)方法》［13］、CaMV 35S啟動(dòng)子、NOS終止子PCR方法引物探針參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)業(yè)部1782號(hào)公告-3-2012 《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè) 調(diào)控元件CaMV 35S啟動(dòng)子、FMV 35S啟動(dòng)子、NOS啟動(dòng)子、NOS終止子和CaMV 35S終止子定性PCR方法》［14］。所有引物及探針序列信息如表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 轉(zhuǎn)基因木瓜篩選檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR所用引物及探針序列信息Table 1 Primers and probes sequence information used in transgenic papaya real-time PCR detection

1.2.3 PCR方法 本研究使用的PCR方法包括普通PCR方法和實(shí)時(shí)熒光PCR方法。

普通PCR擴(kuò)增體系包含：25 ng/μL DNA模板2.0 μL，5 U/μL Taq HS DNA聚合酶0.125 μL，10 μmol/L上下游引物各1.0 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 2.0 μL，10×PCR Buffer（Mg2+plus）2.5 μL，重蒸餾水補(bǔ)至25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，35次循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增完成后，在每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)加入6×上樣緩沖液5.0 μL，混合均勻后取10.0 μL于2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束進(jìn)行凝膠成像分析。

實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增體系包含：2×TaKaRa Premix Ex Taq（Probe qPCR）10 μL，DNA模 板2.0 μL，10 μmol/L上下游引物各0.8 μL，10 μmol/L探針0.4 μL，重蒸餾水補(bǔ)至20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋旱谝浑A段95℃ 1 min；第二階段95℃ 5 s；60℃ 30 s，循環(huán)數(shù)45（在第二階段的60℃延伸后采集熒光信號(hào)）。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA的制備

本研究制備番木瓜基因組DNA關(guān)鍵步驟主要包括根據(jù)勻漿樣品的量，加入適量的制備緩沖液；對(duì)緩沖液上清進(jìn)行適當(dāng)倍數(shù)稀釋。用于制備DNA的番木瓜組織制備流程如圖1所示，葉片的制備主要使用小孔徑打孔器，大約3-5 mm直徑；番木瓜果肉的制備主要采用稱量的方法。

圖1 葉片、果肉基因組DNA溶液制備流程圖Fig. 1 Genomic DNA preparation process of leaf and fruit

本方法制備番木瓜基因組DNA溶液由于含有較多的雜質(zhì)，不能采用常用的方法對(duì)其進(jìn)行濃度測(cè)定，我們對(duì)其質(zhì)量的評(píng)價(jià)主要以PCR方法進(jìn)行。

2.2 基因組DNA的普通PCR檢測(cè)

為了測(cè)試簡(jiǎn)易法制備的基因組的質(zhì)量，通過普通PCR的方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)鮮葉片、干葉片以及果肉基因組DNA溶液，分別以原液、5倍、25倍和125倍稀釋液共4個(gè)梯度濃度進(jìn)行番木瓜內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Papain的普通PCR擴(kuò)增。電泳結(jié)果顯示，番木瓜鮮葉片基因組DNA溶液經(jīng)過5-125倍稀釋以后均能擴(kuò)增得到清晰特異的目的條帶，其中125倍稀釋的DNA溶液擴(kuò)增條帶較弱，原液擴(kuò)增條帶與5倍稀釋DNA條帶亮度沒有明顯變化（圖2-A）；番木瓜干葉片基因組DNA溶液經(jīng)過稀釋以后，原液擴(kuò)增條帶最亮，5倍稀釋樣品次之，25倍稀釋更弱，125倍稀釋的DNA溶液擴(kuò)增條帶最弱，只能隱約看到條帶（圖2-B）；番木瓜果肉基因組DNA溶液PCR結(jié)果顯示，只有DNA原液和經(jīng)過低倍稀釋（5倍）擴(kuò)增的條帶清晰、特異（圖2-C）。說明，本方法建立的快速DNA制備方法獲得的番木瓜基因組DNA，可以應(yīng)用于PCR檢測(cè)，并且抽提效果新鮮葉片強(qiáng)于干葉片，強(qiáng)于番木瓜果肉。

圖2 內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Papain普通PCR擴(kuò)增Fig. 2 PCR amplification of endogenous gene Papain

2.3 基因組DNA的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)

為了驗(yàn)證本研究中的制備緩沖液對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR沒有抑制作用，首先用制備緩沖液稀釋CTAB法提取的番木瓜基因組DNA，設(shè)置共7個(gè)梯度濃度作為梯度標(biāo)準(zhǔn)品（Std1-Std7）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果（表2）顯示，Std1-Std7標(biāo)準(zhǔn)品的重復(fù)性良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率為90.73%，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 7（圖3-A），符合定量檢測(cè)要求，表明制備緩沖液可以直接用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)中。

對(duì)使用本方法提取番木瓜鮮葉片、干葉片以及果肉基因組DNA，并以原液5倍、25倍和125倍稀釋液共4個(gè)梯度濃度進(jìn)行Papain基因?qū)崟r(shí)熒光PCR擴(kuò)增。鮮葉片和干葉片樣品提取的DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率分別為95.83%和102.09%（表2），相關(guān)系數(shù)分別為R2=0.991 3（圖3-B）和R2=0.999 4（圖3-C），不同稀釋倍數(shù)的樣品重復(fù)性也較好。果肉樣品提取的DNA，1-25倍稀釋時(shí)重復(fù)性較好；但當(dāng)稀釋倍數(shù)為125倍時(shí)，部分樣品出現(xiàn)擴(kuò)增不穩(wěn)定，重復(fù)性較差，部分平行沒有出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，導(dǎo)致了所計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率達(dá)到145.32%（表2），相關(guān)系數(shù)R2=0.987 2（圖3-D），說明果肉樣品可能含有較多的雜質(zhì)影響PCR擴(kuò)增。因而，本方法提取的葉片DNA在25倍以下的稀釋濃度，能滿足實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的要求，而果肉樣品的基因組DNA制備，高倍稀釋時(shí)不能滿足實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的要求。

表2 番木瓜Papain基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCRTable 2 Real-time fluorescence PCR of papaya endogenous Papain gene

圖3 番木瓜Papain基因?qū)崟r(shí)熒光PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 3 Real-time fluorescence PCR standard curve of Papain gene

2.4 快速制備DNA模板靈敏度驗(yàn)證

為了進(jìn)一步對(duì)本研究建立基因組DNA制備方法進(jìn)行驗(yàn)證，制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、1%、5%轉(zhuǎn)基因番木瓜的鮮葉片、干葉片、果肉樣品，用本方法制備DNA溶液（原液）進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分驗(yàn)證。普通PCR電泳結(jié)果顯示，Papain基因在所有的檢測(cè)樣品中都有特異的條帶擴(kuò)增，大小與預(yù)期一致（圖4-A）；而CaMV 35S啟動(dòng)子（圖4-B）、NOS終止子（圖4-C）、NPTⅡ基因（圖4-D）在0.1%的低濃度時(shí)，擴(kuò)增條帶較弱；在5%的濃度時(shí)，擴(kuò)增條帶強(qiáng)清晰特異，與預(yù)期結(jié)果相符。這些結(jié)果表明本方法制備的基因組DNA，在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因番木瓜普通PCR方法檢測(cè)時(shí)，可以獲得良好的效果。

圖4 轉(zhuǎn)基因番木瓜普通PCR電泳結(jié)果Fig. 4 PCR electrophoresis results of transgenic papaya

熒光定量PCR的結(jié)果（表3）顯示：在5%轉(zhuǎn)基因番木瓜的鮮葉片、干葉片、果肉樣品的檢測(cè)中，內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Papain、外源基因CaMV 35S啟動(dòng)子、NOS終止子、NPTⅡ基因均能得到典型擴(kuò)增曲線和Ct值，且標(biāo)準(zhǔn)偏差值（SD）范圍在0.010-0.150之間，重復(fù)性良好；在1%樣品檢測(cè)中，不管內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因還是外源基因，均能得到典型擴(kuò)增曲線和Ct值，且SD值范圍在0.010-0.504之間，重復(fù)性較好；在0.1%樣品檢測(cè)中，不管內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因還是外源基因，葉片樣品均能得到典型擴(kuò)增曲線和Ct值，Ct值均小于36，且SD值范圍在0.036-0.551之間，重復(fù)性較好；而0.1%的果肉樣品，雖然內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因還是外源基因均能得到典型擴(kuò)增曲線和Ct值，但外源基因部分平行擴(kuò)增Ct值大于36，重復(fù)性稍差，如CaMV 35S和NPTⅡ基因的Ct值就差異比較大，SD值分別為1.660和1.415。以上結(jié)果說明用本方法制備的基因組DNA，可以用于不同葉片的檢測(cè)中，但是對(duì)于果肉等含有雜質(zhì)比較多的樣品的檢測(cè)，在低含量時(shí)檢測(cè)具有局限性。

表3 轉(zhuǎn)基因番木瓜實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)與分析Table 3 Data and analysis of real-time fluorescence PCR of transgenic papaya

3 討論

目前，已有多個(gè)轉(zhuǎn)基因番木瓜品系被各國(guó)批準(zhǔn)商業(yè)化應(yīng)用。在我國(guó)，由于轉(zhuǎn)基因番木瓜“華農(nóng)1號(hào)”已經(jīng)批準(zhǔn)商業(yè)化種植，對(duì)轉(zhuǎn)基因番木瓜的管理和檢測(cè)技術(shù)的研究收到越來越多的重視。目前對(duì)轉(zhuǎn)基因番木瓜的檢測(cè)主要使用基于核酸的檢測(cè)方法，其中PCR方法是目前最成熟、應(yīng)用最多的檢測(cè)方法。本研究建立了快速簡(jiǎn)便的基因組DNA提取方法，與傳統(tǒng)的核酸提取方法（如CTAB法、SDS法、試劑盒法等）相比具有巨大的優(yōu)勢(shì)［6］，本研究建立的快速抽提和PCR檢測(cè)方法在特異性和靈敏度方面，可以滿足葉片和果實(shí)等不同組織的檢測(cè)需要。因此，在滿足PCR檢測(cè)要求的前提下，開發(fā)更簡(jiǎn)單高效的轉(zhuǎn)基因番木瓜基因組DNA提取方法十分必要。

本方法的關(guān)鍵在于控制加入番木瓜材料的用量與加入制備緩沖液的比例，避免獲得的PCR模板中含過多的雜質(zhì)抑制PCR擴(kuò)增。本方法制備基因組DNA步驟簡(jiǎn)單，僅需一次勻漿和離心，然后進(jìn)行簡(jiǎn)單的稀釋，即可直接獲得基因組DNA溶液用于普通PCR擴(kuò)增以及實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，稀釋范圍從1-25倍均可，適用范圍廣，效果良好，能制備較多的DNA溶液，滿足多次PCR檢測(cè)的需要。本方法與傳統(tǒng)的CTAB或SDS抽提方法相比，操作步驟大幅度減少，節(jié)省了抽提時(shí)間；即使與商業(yè)化的抽提試劑盒相比，也更簡(jiǎn)單。而且，從樣品勻漿、制備PCR模板到PCR擴(kuò)增均可使用96孔方孔板、96孔PCR板、多通道微量移液器等進(jìn)行，更加高效，因而特別適合用于大批量番木瓜材料的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)，能大大提高轉(zhuǎn)基因番木瓜檢測(cè)工作的效率。

本研究結(jié)果顯示，本方法用于制備轉(zhuǎn)基因番木瓜葉片和果肉樣品基因組DNA溶液效果較好，使用普通PCR方法及實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)時(shí)，含量低至0.1%的轉(zhuǎn)基因番木瓜基因組DNA仍然能擴(kuò)增得到清晰的目的條帶或典型擴(kuò)增曲線和Ct值，表明本方法可以用于轉(zhuǎn)基因番木瓜葉片與果肉樣品檢測(cè)。對(duì)于含雜質(zhì)較多的果肉等樣品梯度稀釋時(shí)，實(shí)時(shí)熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率超出正常范圍，因此，還需要進(jìn)一步調(diào)整優(yōu)化提取方法和條件，以達(dá)到更好效果。

4 結(jié)論

本研究通過探索建立了一套適用于番木瓜轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的快速制備基因組DNA模板的方法，使用該方法可以從各種葉片、果肉等組織提取得到番木瓜基因組DNA模板，獲得的模板能滿足普通PCR與實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的要求。