基于信號肽策略提高外源蛋白在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)

苗華彪 曹艷 楊夢瀚 黃遵錫

（1. 云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650500；2. 生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程中心，昆明 650500）

與大腸桿菌和酵母菌相比，枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究起步較晚，但因其具有：安全、蛋白分泌能力強(qiáng)、易于高密度發(fā)酵、遺傳背景清晰和被認(rèn)為是安全菌株（generally recognized as safe，GRAS）等優(yōu)勢，使其成為基因表達(dá)系統(tǒng)研究熱點(diǎn)之一［1-3］?？莶菅挎邨U菌作為表達(dá)宿主菌可以將蛋白分泌到胞外培養(yǎng)基中，這一過程由位于外源蛋白N末端的信號肽來完成，它可以正確的將外源蛋白導(dǎo)向分泌裝置，在蛋白分泌過程中起著不可替代的作用［2，4］。目前，只有少數(shù)外源蛋白在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，但還有大多數(shù)外源蛋白的分泌和表達(dá)效果不理想。其中枯草芽孢桿菌信號肽的氨基酸組成、類型和分泌途徑均會對外源蛋白分泌的效率產(chǎn)生影響，合適的信號肽是保證外源蛋白在枯草芽孢桿菌高效表達(dá)的關(guān)鍵因素之一?；谛盘栯牡牟呗蕴岣咄庠吹鞍椎姆置诹渴乔袑?shí)可行的，并且往往會取得意想不到的效果［5-6］。雖然科學(xué)家們對枯草芽孢桿菌信號肽進(jìn)行了堅(jiān)持不懈的探究，但仍然存在許多尚未解決的問題。本文綜述了枯草芽孢桿菌信號肽的最新研究進(jìn)展，重點(diǎn)討論了一般分泌途徑（general secretion pathway，Sec）和雙精氨酸分泌途徑（twin-arginine traslocation pathway，Tat）信號肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、分類、分泌機(jī)制及其在提高外源蛋白表達(dá)方面的實(shí)際應(yīng)用。同時總結(jié)了信號肽在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中應(yīng)用的問題和展望，以期為通過信號肽的策略提高外源蛋白在枯草芽孢桿菌中的高效表達(dá)提供一定的參考。

1 信號肽的概述

四十多年前蛋白質(zhì)合成后的轉(zhuǎn)移與定位是不為人知的，直到1975年Blobel等［7］正式提出信號假說（signal hypothesis）后，才得以解決。其認(rèn)為游離核糖體是開始合成分泌蛋白的場所，新合成的蛋白質(zhì)有一個內(nèi)源性的信號肽，可以與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜識別并結(jié)合，緊隨其后的新生肽鏈則不斷延伸并通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，合成完成后信號肽則被信號肽酶（signal peptidase，SPase）水解［7］，此后，信號識別顆粒（signal recognition protein，SRP）及其受體（SRP receptor，SR）的發(fā)現(xiàn)完善了該假說［8-9］。隨后大量的研究表明信號肽的作用機(jī)理普遍存在于動植物和微生物中，進(jìn)而使其成為一個系統(tǒng)的理論，Blobel也因此獲得了1999年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎［4］。信號肽的提出為研究蛋白質(zhì)的空間屬性這一新領(lǐng)域開辟了道路，也為研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)［7-9］。

2 枯草芽孢桿菌信號肽分泌途徑

由于枯草芽孢桿菌缺乏外膜結(jié)構(gòu)，分泌蛋白會轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外培養(yǎng)基中，保證分泌蛋白的正確定位和轉(zhuǎn)移則由信號肽來完成［2］?？莶菅挎邨U菌可以將300多種蛋白分泌到胞外［2-4］，至少包含4種類型的蛋白分泌途徑，分別為：Sec分泌途徑、Tat分泌途徑、假菌絲蛋白輸出途徑（Pseudophilin pathway，Com）和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子途徑（ATP-binding cassette transporter，ABC）［4］。其中Sec和Tat分泌途徑的信號肽占整個枯草芽孢桿菌的90%以上，為此將重點(diǎn)討論這兩種分泌途徑的信號肽。

2.1 Sec分泌途徑

2.1.1 Sec分泌途徑信號肽的類型 Sec分泌途徑是枯草芽孢桿菌最主要的分泌途徑，主要轉(zhuǎn)運(yùn)未折疊的蛋白質(zhì)。由于信號肽預(yù)測軟件的算法不同，對信號肽的分類也會存在一定的差異。通常根據(jù)SPase切割底物特異性不同可分為兩類：I型信號肽，是由I型信號肽酶（Lep）進(jìn)行切割的信號 肽［4，10-11］，Tjalsma等［10］總結(jié)了這種信號肽有166種，Brockmeier等［12］總結(jié)了173種；II型信號肽，是由II型信號肽酶（LspA）進(jìn)行切割的一類脂蛋白信號肽［11，13］，據(jù) Tjalsma等［11］報道有114種。隨著對枯草芽孢桿菌信號肽的不斷研究，目前可在信號肽數(shù)據(jù)庫（http：//www.signalpeptide.de/index.php）中查詢到的枯草芽孢桿菌來源的信號肽已有244種，在Tjalsma等［11］報道的基礎(chǔ)上新增了61種。

2.1.2 Sec分泌途徑信號肽的結(jié)構(gòu) 對Sec分泌途徑的信號肽基本性質(zhì)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)I型信號肽長度在17-45 aa之間，平均長度接近28 aa；II型信號 肽 更 短（13-38 aa），平 均 長 度 不 足20 aa（圖 1-A）［4-5，11］。雖然信號肽的一級結(jié)構(gòu)之間沒有直接相關(guān)性，但其二級結(jié)構(gòu)還是有一定的規(guī)律可循。利 用SignalP 3.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）和Phobius（http：//phobius.sbc.su.se/）信號肽預(yù)測網(wǎng)站可將信號肽分為3段不同的結(jié)構(gòu)域：（1）N端結(jié)構(gòu)域，通常含有1-5個帶正電的氨基酸殘基（R/K），這可能與轉(zhuǎn)運(yùn)過程中膜脂質(zhì)雙層中帶負(fù)電荷的磷脂相互作用有關(guān)［11］。（2）H端結(jié)構(gòu)域，是由7-15個疏水性氨基酸組成的螺旋結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)有利于信號肽插入膜中，有助于特定SPase的切割［2-3，11］，而且H端結(jié)構(gòu)域疏水性氨基酸占比高達(dá)80%左右，其中甘氨酸（G）、脯氨酸（P）、亮氨酸（L）和纈氨酸（V）出現(xiàn)頻率最高［4，11］。（3）C端結(jié)構(gòu)域位于信號肽的最末端，包含SPase切割位點(diǎn)，將信號肽從成熟蛋白上切割下來，成熟蛋白則可折疊成天然構(gòu)象，信號肽則被移除和降解。通常，Lep信號肽的SPase識別位點(diǎn)是AXAA，LspA信號肽是LAAC，它與其他分泌型蛋白信號肽最大差異在于具有一個不變的半胱氨酸（C）殘基，有助于脂蛋白的切割和錨定［4-5，11，14］。信號肽能夠有效地被SPase識別并剪切的前提條件是C端必須具有一個β片狀折疊延伸結(jié)構(gòu)，且C端-2位的氨基酸殘基通常具有體積小且無電荷的特點(diǎn)［4］。

2.1.3 Sec途徑信號肽的分泌機(jī)制 Sec分泌途徑一般分為4步完成（圖1-B）：（1）識別：首先，在核糖體上轉(zhuǎn)錄翻譯后的基因，生成一條N端帶有一段信號肽的多肽鏈，由SRP來完成對該多肽鏈的識別，并被膜受體（FtsY）引導(dǎo)至轉(zhuǎn)運(yùn)子［14］。其中，SRP是一個高度保守的蛋白-核酸復(fù)合物，它包括一個細(xì)胞質(zhì)小RNA（scRNA）［15］、兩個組蛋白類似物（HBsu）［16］和一個獨(dú)立蛋白（Ffh）組成［11，16］。（2）易位：前體蛋白主要通過Sec轉(zhuǎn)運(yùn)酶完成跨膜，它由轉(zhuǎn)運(yùn)通道（SecYEG）［17］、馬達(dá)蛋白（SecA）［17-18］和輔助蛋白（SecDF-YrbF）3部分組成［19-20］。其中，SecYEG蛋白是由SecY、SecE和SecG三個單體蛋白形成的膜結(jié)合異源三聚體，在蛋白轉(zhuǎn)移中起輔助通道作用，只與蛋白分泌的效率有關(guān)［17］。Sec轉(zhuǎn)運(yùn)酶的能量來源是由馬達(dá)組件SecA催化ATP的水解來提供，多數(shù)情況下SecA是以單體的形式存在，但SecA也存在其他的寡聚體結(jié)構(gòu)形式來發(fā)揮同樣的功能［21-22］。此外，SecA也可充當(dāng)伴侶分子，直接將底物從合成位點(diǎn)轉(zhuǎn)運(yùn)到轉(zhuǎn)運(yùn)酶上，但這種僅由SecA構(gòu)成的通道效率較低［21-22］。SecDF與同系物YrbF構(gòu)成一個異源三聚體的輔助蛋白［23］，作用是將前體蛋白從通道中提取出來［2-3］，但某些前體蛋白（PhoB和YvaY）的分泌，需要另外一個同型二聚體輔助蛋白CsaA的參與［24］。（3）切除：前體蛋白跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)后，位于N末端的信號肽需要被切除，否則，可能會影響到其他蛋白的易位，信號肽序列的切割是由膜結(jié)合蛋白SPase來完成，切除下來的信號肽不會一直存在，由SppA和TepA將其降解［2-4］。枯草芽孢桿菌染色體上存在多種SPase基因，多數(shù)情況下，1-2個基因的表達(dá)足以滿足前體蛋白的加工和細(xì)胞活力［2-4］，這種基因多樣性保證了不同條件下蛋白分泌的靈活性。此外，SPase不僅具有切割功能，也參與枯草芽孢桿菌的產(chǎn)孢和貼壁生物膜的形成等生理反應(yīng)［11，25］。（4）加工后修飾：轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的修飾、折疊和后續(xù)過程都會受到一些特定分子伴侶的影響?？莶菅挎邨U菌具有細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外兩種分子伴侶以單獨(dú)或協(xié)同作用的方式加快蛋白質(zhì)的折疊和組裝，可以協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的聚集和維持轉(zhuǎn)運(yùn)前體蛋白的構(gòu)象［21，26-28］。如脂蛋白（PrsA）屬于細(xì)胞外伴侶，可促進(jìn)成熟蛋白的折疊、穩(wěn)定正確的蛋白構(gòu)象［25］。分泌到膜外的蛋白，如果發(fā)生了錯誤折疊則由蛋白酶類進(jìn)行降解。

2.2 Tat分泌途徑

2.2.1 Tat分泌途徑信號肽的類型和結(jié)構(gòu)特點(diǎn) Tat類信號肽作為枯草芽孢桿菌第二大分泌途徑，數(shù)量少了很多［4，11，32］，一般認(rèn)為有24種這樣的信號肽，其中有14種能被Lep信號肽酶所識別［11］。該類信號肽長度要明顯大于Sec途徑信號肽，N端結(jié)構(gòu)域的長度是Sec途徑信號肽的兩倍，在N端和H端的連接處具有一個明顯的保守序列++RR## （圖1-C）［4-5，11］；H端相比于Sec途徑信號肽長度更長且疏水性要低［11］；C端出現(xiàn)頻率較高的氨基酸殘基也和Sec途徑信號肽不同［4-5，11］。

2.2.2 Tat途徑信號肽的分泌機(jī)制 Tat分泌途徑信號肽轉(zhuǎn)運(yùn)那些折疊迅速或已經(jīng)在胞內(nèi)折疊好的蛋白質(zhì)［29-31］，這些蛋白利用Sec分泌途徑信號肽很難轉(zhuǎn)運(yùn)（圖1-D）。與Sec分泌途徑不同的是，目前，僅鑒定出PhoD、YwnN、QcrA和YkuE這4種底物蛋白是明確按照Tat途徑進(jìn)行分泌［29-31，33-36］。Tat系統(tǒng)可以處理高達(dá)150 kD的前體蛋白，但Tat途徑中的各組件都比較小，這意味著它們需要組裝成較大的復(fù)合物，以促進(jìn)較大前體蛋白的跨膜通過［29，37］。與大腸桿菌相比，枯草芽孢桿菌Tat分泌途徑擁有兩套相互獨(dú)立的通道蛋白復(fù)合物：由tatAdCd操作子所編碼的TatA（230 kD）通道蛋白，它由在膜上成“ L形”排列的TatAd（7.4 kD）蛋白和具有6個跨膜螺旋的TatCd（28 kD）蛋白復(fù)合組成；及由tatAyCy操作子所編碼的TatC（200 kD）通道蛋白，它由TatAy（6 kD）和TatCy（28.9 kD）兩種蛋白組成；底物蛋白的易位，還需要枯草芽孢桿菌TatAc（6.7 kD）蛋白的幫助［37-38］。進(jìn)行蛋白分泌時，首先轉(zhuǎn)運(yùn)酶復(fù)合物通過兩親性雙螺旋結(jié)構(gòu)形成一個比Sec途徑孔道要大的直徑為5-6 nm的跨膜Tat孔空結(jié)構(gòu)，這也許是已折疊蛋白能夠穿過該通道的一個重要原因［29-30］。之后，前體蛋白先與TatA/TatC相連的復(fù)合物相互作用，在跨膜pH梯度下，將折疊好的前體蛋白轉(zhuǎn)移到Tat孔外［31］，易位后，I型SPase裂解信號肽，成熟的蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中［29-31］。另外，Walther等［39］基于電區(qū)域（DCR）和兩親性螺旋（APH）的互補(bǔ)性，也提出了Tat分泌途徑一種可能機(jī)制：這種Tat分泌途徑的蛋白質(zhì)被7個鹽橋“拉鏈”，形成了一個易于穿過脂質(zhì)雙層的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。Tat途徑已成為一種日益流行的運(yùn)輸途徑，因?yàn)樗鼘⒛繕?biāo)蛋白全折疊分泌到培養(yǎng)基中，從而降低了純化成本，在生物技術(shù)應(yīng)用方面的研究也越來越受到重視。

圖1 枯草芽孢桿菌Sec和Tat分泌途徑信號肽的主要特征和機(jī)制示意圖（依據(jù)參考文獻(xiàn)［2，5，21，27，29-31］繪制）Fig .1 Schematic diagram of the main characteristics and mechanism of the signal peptides about the secretory pathways of Bacillus subtilis Sec and Tat（Based on the references［2，5，21，27，29-31］）

3 信號肽在提高外源蛋白分泌表達(dá)中的應(yīng)用

3.1 基于對信號肽的直接替換提高外源蛋白的 表達(dá)

目前，對信號肽的應(yīng)用仍然處于探索階段，由于對分泌機(jī)制了解有限，準(zhǔn)確預(yù)算出一個蛋白的最佳信號肽還較為困難。雖然研究人員開發(fā)了有助于信號肽選擇的預(yù)測工具，但評分和蛋白實(shí)際分泌量似乎不相關(guān)［12］。為了提高外源蛋白的表達(dá)量，學(xué)者們開始嘗試直接在外源蛋白的N端添加或者替換原有信號肽，詳見表1。雖然這種方式工作量較大，且存在一定的隨機(jī)性，但近年來在提高外源蛋白表達(dá)量方面也取得了一定成果，實(shí)現(xiàn)了酰胺酶［40］、氨肽酶［41］、堿性絲氨酸蛋白酶［42］、角蛋白酶［43］、L-天冬酰胺酶［44］、β-甘露聚糖酶［45］、堿性果膠酶［46］、果聚糖蔗糖酶［47］、普魯蘭酶［48］、聚對苯二甲酸乙二醇酯水解酶［49］、脂肪酶［50］、β-半乳糖苷酶［51］和淀粉酶［52-56］胞外表達(dá)量的提高。通常借鑒被認(rèn)為能夠高效分泌外源蛋白的常用信號肽，如Sec分 泌 途 徑 的AmyE［40-42，44，47-49，51-52，55-56］、 AprE［42，46，51-52，55］、NprE［41-43，45，47-48，51-54，56］、NprB［40，42，45，50，54］、SacB［40-42，47-49，52，54，56］和Bpr［41-42，46-47，49，53-55］等外源蛋白的信號肽；Tat分泌途徑的PhoD［［42，45，49，51，54，56］、YwbN［42-46，49，51，53］、 LipA［40，42-45，50，54，56］、WapA［42-44，46-47，52-53］等外源蛋白的信號肽，構(gòu)建幾個乃至幾十個含有不同信號肽的異源表達(dá)載體，分別將其導(dǎo)入枯草芽孢桿菌中，并進(jìn)行外源蛋白分泌量的比較，進(jìn)而確定哪種信號肽適合外源蛋白的表達(dá)。這種方式篩選到的高表達(dá)信號肽，由于篩選范圍的狹小，未必就是這種外源蛋白分泌最佳信號肽。有趣的是，我們無法確定哪種類型的信號肽比較適合外源蛋白的分泌表達(dá)，甚至，同一類外源蛋白（淀粉酶）由于基因和性質(zhì)上的差異，導(dǎo)致所篩選的高效表達(dá)信號肽也不同［52-56］。雖然Tat分泌途徑的信號肽只有24種，但在提高外源蛋白表達(dá)方面，似乎概率性更高［43-45，49-51，53］。

表1 基于對信號肽的直接替換提高外源蛋白表達(dá)的研究Table 1 Research on improving the expression of foreign proteins based on direct replacement of signal peptides

3.2 基于對信號肽的突變提高外源蛋白的表達(dá)

有報道顯示枯草芽孢桿菌信號肽N端帶正電荷氨基酸數(shù)量和H端疏水性強(qiáng)弱對外源蛋白的分泌有一定影響［2-4］，通過對信號肽的突變也能提高外源蛋白的表達(dá)量，見表2。一般采用3種方式改造信號肽的N端區(qū)域：將原有氨基酸突變成堿性氨基酸（K/R）［50，53，57］；在N端直接插入堿性氨基酸 （K/R）［53］和將原有氨基酸進(jìn)行飽和突變［50，58］。通過對信號肽的N端區(qū)域進(jìn)行改造實(shí)現(xiàn)了脂肪酶［50］、淀粉酶［53，55］、地衣聚糖酶［57］和角質(zhì)酶［58］表達(dá)量的提高。此外，也會采用N端和H端相結(jié)合的方式提高信號肽的分泌能力，如Fu等［57］和馬櫻芳等［53］在增加N端正電荷數(shù)量基礎(chǔ)上，進(jìn)一步將H端的極性氨基酸突變成非極性氨基酸，從而降低H端的疏水性，實(shí)現(xiàn)了提高淀粉酶［53］和地衣聚糖酶［57］的胞外酶活。此外，祝發(fā)明等［59］針對信號肽AmyX三個區(qū)域的同時突變使β-半乳糖苷酶胞外酶活提高了2.5倍。研究也發(fā)現(xiàn)信號肽N端所含正電荷數(shù)量也不是越多越好，F(xiàn)u等［57］在對信號肽H1進(jìn)行突變時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)N端有4個正電荷的堿性氨基酸時，其分泌能力反而大幅度降低，這與周勇［50］、袁林等［55］和馬櫻芳等［53］對信號肽N端區(qū)域突變時所得結(jié)論一致。Caspers等［58］在對信號肽（AmyE）N端區(qū)域進(jìn)行飽和突變時，突變體F2D和F2E雖然導(dǎo)致信號肽N端正電荷數(shù)量減少，但角質(zhì)酶胞外酶活卻提高了約3倍，也佐證了這一觀點(diǎn)。綜上，通過對信號肽N端和H端的氨基酸殘基進(jìn)行適當(dāng)?shù)耐蛔兒筒迦?，改變信號肽N端區(qū)域的帶正電數(shù)［50，53，55，57-58］和降低H端的疏水性［50，57］，進(jìn)一步改變了信號肽二級結(jié)構(gòu)和前體蛋白折疊方式，從而提高外源蛋白在枯草芽孢桿菌中的分泌能力［2-4，58］。綜合前人［57-58］的研究結(jié)果可知信號肽N端的正電荷數(shù)量+2或+3比較合適，具體原因有待進(jìn)一步探究。通過這種方式，較構(gòu)建信號肽文庫大大減少了工作量，相對于直接替換其他類型信號肽，也增加了準(zhǔn)確性，作者認(rèn)為這種方式將是未來對信號肽改造的一個熱門趨勢。

表2 基于對信號肽的突變提高外源蛋白表達(dá)的研究Table 2 Research on improving the expression of foreign protein based on mutation of signal peptide

3.3 基于構(gòu)建信號肽文庫提高外源蛋白的表達(dá)

為了構(gòu)建優(yōu)化異源蛋白分泌的有力策略，Brocmeier等［12］構(gòu)建了一個信號肽庫，結(jié)合高通量篩選的方法，可以篩選到分泌異源蛋白的最佳信號肽，這是目前應(yīng)用最為廣泛且成功的方式，見表3。其步驟總結(jié)如下：首先，通過PCR的方式從B. subtilis 168［12，60-65］或B. subtilis 1A427［63］基因組上擴(kuò)增出173種Sec信號肽目的片段，混合成一個信號肽雜合文庫，即使商業(yè)化的文庫［60，63-64］也是采用這種方式獲得；同時，構(gòu)建一個包含外源蛋白的表達(dá)載體骨架，研究表明，信號肽和外源蛋白之間多余的氨基酸（酶切位點(diǎn)），似乎并不影響外源蛋白的分 泌［12，60，66］，也可采用融合PCR的方式避免這一問題［65］。其次，通過酶切或PCR的方式將包含外源蛋白的載體骨架線性化，借助于無縫克?。?2-66］進(jìn)行信號肽文庫的構(gòu)建，這就需要在PCR擴(kuò)增信號肽片段時在兩端預(yù)留20 bp用于與載體重組的序列。由于枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化效率不如大腸桿菌，構(gòu)建好的信號肽文庫質(zhì)粒導(dǎo)入枯草芽孢桿菌之前，通常會選擇一個大腸桿菌亞文庫來介導(dǎo)［12，60，66］，這就要求表達(dá)載體必然是一個穿梭質(zhì)粒，至今，只有Fu等［65］實(shí)現(xiàn)了將構(gòu)建好的信號肽文庫質(zhì)粒直接導(dǎo)入枯草芽孢桿菌中。對于信號肽混合質(zhì)粒導(dǎo)入枯草芽孢桿菌的方式有spizizen法［12，60，62，64-65］、原生質(zhì)體法［61］和電轉(zhuǎn)化法［63，66］。最后，信號肽文庫的篩選，通常結(jié)合高通量篩選技術(shù)［12，60-61，63，65］或與透明 圈［61，65］一起進(jìn)行篩選。Tsuji等［62］也報道了直接采用透明圈的方式進(jìn)行篩選；Zhang等［66］則利用針對每一個信號肽，從構(gòu)建到篩選均是一一對應(yīng)，直接比較每一個胞外木聚糖酶活性的方式進(jìn)行篩選。目前已完成了角質(zhì)酶［12］、細(xì)胞質(zhì)酯酶［12］、α-麥芽淀粉酶［60］、蛋白酶［61］、植酸酶［62］、α-淀粉酶［63-65］和木聚糖酶［66］的最佳信號肽的篩選。本課題組也對來自解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶最佳信號肽進(jìn)行了篩選，使其胞外淀粉酶活力提高了3.8倍［63］。由于每一種外源蛋白在枯草芽孢桿菌的分泌方式均不同，構(gòu)建多種混合信號肽文庫的方法雖然復(fù)雜且工作量和篩選任務(wù)繁重，但能夠獲得一個真實(shí)的外源蛋白分泌最佳信號肽。此外，也有學(xué)者報道了利用枯草芽孢桿菌信號肽文庫在Escherichia coli［67-69］、Corynebacterium glutamicum［70］和Baclicus lincheniformis［61］宿主菌中實(shí)現(xiàn)提高外源蛋白表達(dá)量的應(yīng)用。

表3 基于構(gòu)建信號肽文庫提高外源蛋白表達(dá)的研究Table 3 Research on improving foreign protein expression based on constructing signal peptide library

3.4 基于信號肽中稀有密碼子提高外源蛋白的 表達(dá)

目前關(guān)于外源蛋白基因密碼子偏好性的研究主要集中在大腸桿菌和釀酒酵母5′端信號肽區(qū)域［71］。研究表明，大腸桿菌中信號肽的第二個氨基酸更偏好能保證高起始翻譯的賴氨酸（L）密碼子是AAA而不是AAG［72-73］；革蘭氏陽性菌Streptomyces coelicolor［74］同樣也發(fā)現(xiàn)稀有密碼子在信號肽序列中的高頻率使用，甚至信號肽區(qū)域使用稀有密碼子獲得的蛋白質(zhì)產(chǎn)物是使用普通密碼子的數(shù)倍［75-76］。通過分析其蛋白質(zhì)產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)信號肽使用不同密碼子得到的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)有顯著的差異，可能是由于使用通用密碼子時蛋白質(zhì)翻譯速度過快，信號肽序列區(qū)域的構(gòu)象和正常情況不同，導(dǎo)致后續(xù)成熟蛋白的折疊也出現(xiàn)錯誤而被降解［77］。信號肽區(qū)域的稀有密碼子對保證正確的共翻譯折疊具有重要作用［71］。因此，可在分泌蛋白基因5′端信號肽區(qū)域使用tRNA適應(yīng)指數(shù)（tRNA adaptation index，tAI）值低的密碼子減慢翻譯速度以幫助蛋白質(zhì)的跨膜、加工成熟和折疊［78］。此外，在SRP結(jié)合位點(diǎn)下游大約35-40個密碼子的區(qū)域內(nèi)存在較多的稀有密碼子，通過減緩翻譯速度，幫助信號肽序列與SRP的結(jié)合［79］。但至今，在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中沒有報道過改變外源蛋白信號肽中的稀有密碼子的方式來提高分泌量的研究。

3.5 基于信號肽分泌系統(tǒng)中相關(guān)蛋白的改造提高外源蛋白的表達(dá)

枯草芽孢桿菌將外源蛋白分泌到胞外培養(yǎng)基中，除了必須有信號肽引導(dǎo)外，還需要一系列相關(guān)蛋白的參與，包括靶向因子、轉(zhuǎn)運(yùn)酶、信號肽酶、分子伴侶和胞外蛋白酶，通過改造這些相關(guān)蛋白也可以提高外源蛋白在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)［80］。（1）靶向因子是將待分泌蛋白從細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)運(yùn)酶上的輔助蛋白，在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中有FtsY和CsaA這兩種輔助蛋白靶向因子［80］。研究表明過表達(dá)FtsY和CsaA蛋白，可以提高目標(biāo)蛋白在枯草芽孢桿菌中的分泌量（US 6410262），相反，抑制了這兩種蛋白的表達(dá)，目標(biāo)蛋白在枯草芽孢桿菌中的分泌量也會相應(yīng)的降低［80-82］。（2）分泌外源蛋白時跨膜是在轉(zhuǎn)運(yùn)酶復(fù)合體幫助下完成的，Kakeshtia等［83］刪除了SecA的C末端區(qū)域，成功的提高了堿性纖維素酶和干擾素在枯草芽孢桿菌中的胞外分泌量；另外，對SecA的C末端區(qū)的點(diǎn)突變也可以提高PhoB蛋白的分泌量（EP 1633873）。過表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)酶組分中的相關(guān)蛋白也是提高外源蛋白分泌量的有效措施之一，如Mulder等［84］首次人工構(gòu)建了SecYEG操縱子，并最終增加了枯草芽孢桿菌分泌淀粉酶的產(chǎn)量。Genecor公司通過SecA、SecDF和SecG的過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)可以增強(qiáng)某些異源蛋白在枯草芽孢桿菌中的分泌（EP 1003872、US 7807808、US 6258563）。（3）信號肽酶的不足可能會導(dǎo)致信號肽切割效率的下降，研究發(fā)現(xiàn)，ClpXP蛋白酶的缺失可以提高sipS、sipT和sipV信號肽酶基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而提高了信號肽的加工過程并增加了蛋白分泌速率［4］，同時還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)敲除sipS基因后，AmyQ信號肽的切割效率則有明顯提高；另一方面，過表達(dá)信號肽酶sipI也增強(qiáng)了宿主切割A(yù)myQ信號肽的能力［85］。所以對信號肽酶進(jìn)行過表達(dá)，或者解除某些信號肽酶相互之間的抑制有望增加某些異源分泌蛋白在枯草芽孢桿菌中的分泌表達(dá)量［80］。（4）分子伴侶能夠降低待分泌蛋白錯誤折疊的概率，增加被靶向因子的識別。Wu等［86］失活HrcA導(dǎo)致胞內(nèi)分子伴侶組成型表達(dá)，使得scFV的分泌量增加了60%，另外，過表達(dá)胞外分子伴侶prsA也導(dǎo)致了scFV總量增加，進(jìn)一步共表達(dá)胞內(nèi)和胞外伴侶則導(dǎo)致了scFV分泌量更加明顯的增加。這與Kontinen等［87］報道的過表達(dá)prsA后，淀粉酶和蛋白酶在枯草芽孢桿菌中的分泌量分別提高了6倍和2倍是一致的。因此，促進(jìn)外源蛋白在細(xì)胞膜外進(jìn)行快速折疊的手段，有望增加某些分泌蛋白的胞外分泌量。（5）敲除枯草芽孢桿菌宿主菌中的蛋白酶基因也能有效提高外源蛋白的分泌 量［2-4，26］。目前商業(yè)化的WB800就是敲除了8個胞外蛋白酶基因，但敲除過多的蛋白酶基因會帶來菌株生長活力下降的問題。

4 總結(jié)與展望

近年來，枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)因其在蛋白表達(dá)純化和分泌活性蛋白等方面要明顯優(yōu)于大腸桿菌，已成為比較熱門的表達(dá)體系之一。學(xué)者們經(jīng)過多年的不懈努力，如今雖建立了一套有效的外源蛋白枯草表達(dá)系統(tǒng)，并且在外源蛋白表達(dá)方面也取得了很大的進(jìn)展，但相比大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后的。外源蛋白在枯草芽孢桿菌中能否實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，信號肽是關(guān)鍵元件之一，適配的信號肽甚至能夠提高外源蛋白表達(dá)量高達(dá)數(shù)十倍。目前，國內(nèi)外學(xué)者主要針對枯草芽孢桿菌信號肽的Sec和Tat分泌途徑進(jìn)行研究，基于信號肽的簡單替換、突變、構(gòu)建高通量文庫和改造分泌途徑中相關(guān)蛋白的方式來提高外源蛋白的表達(dá)量，雖取得了一定的進(jìn)展，但仍有上升空間。作者認(rèn)為未來的研究方向應(yīng)該集中以下方面：（1）增加枯草芽孢桿菌信號肽的基礎(chǔ)研究與應(yīng)用，證明這種潛在的工業(yè)細(xì)菌將通過不斷優(yōu)化可成為超級分泌細(xì)胞工廠。在信號肽分泌途徑研究方面，尤其是Sec和Tat途徑，仍然需要進(jìn)一步研究了解每個信號肽和分泌途徑的功能及其相互作用，特別是Tat途徑信號肽，雖然在數(shù)量上較少，但似乎更能提高外源蛋白分泌量，這可能與其轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中參與蛋白有關(guān)。（2）可以基于生物信息學(xué)，針對信號肽的結(jié)構(gòu)，N端所帶正電荷數(shù)為+2或+3，降低H端的疏水性，模擬其在分泌途徑中的可行性，在一定理論基礎(chǔ)上，建立一套實(shí)用性的預(yù)測平臺，降低工作量的同時確保提高外源蛋白分泌效率的準(zhǔn)確性。（3）基于信號肽分泌途徑中相關(guān)蛋白的單個或多種基因的組合過表達(dá)，提高其在外源蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中的工作效率，使得外源蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)、加工、折疊和分泌更加高效，胞外分泌量也會相應(yīng)提高。 （4）結(jié)合其他蛋白表達(dá)優(yōu)化方法：如啟動子、稀有密碼子、代謝工程技術(shù)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)和基因編輯等技術(shù)，通過整體策略提高外源蛋白的分泌表達(dá)?？傊瑥谋举|(zhì)上研究分泌途徑的機(jī)制、信號肽優(yōu)選方式和影響因素是至關(guān)重要的，為未來進(jìn)一步擴(kuò)大枯草芽孢桿菌的高效工業(yè)應(yīng)用的范圍提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。