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    植物半胱氨酸蛋白酶在植物生長發(fā)育中的功能研究

    2021-08-11 02:46:02莫黎杰劉夏瞳李慧陸海
    生物技術(shù)通報 2021年6期
    關(guān)鍵詞:絨氈層擬南芥半胱氨酸

    莫黎杰 劉夏瞳 李慧,2 陸海,2

    (1. 北京林業(yè)大學生物科學與技術(shù)學院,北京 100083;2. 北京林業(yè)大學林木育種國家工程實驗室,北京 100083)

    植物蛋白酶廣泛參與蛋白質(zhì)的成熟、重建和降解,在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用,調(diào)節(jié)著細胞增殖、分化、衰老和程序性細胞死亡(programmed cell death,PCD)等多個生物學過程[1-2]。蛋白酶功能異常會導致植物正常的生長發(fā)育進程受到影響。

    蛋白酶通過水解肽鍵將底物裂解為小分子肽段。根據(jù)其催化位點分為4大類:半胱氨酸蛋白酶,絲氨酸蛋白酶,天冬氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶[3]。MEROPS蛋白酶數(shù)據(jù)庫(http://merops.sanger.ac.uk)中根據(jù)進化關(guān)系將蛋白酶分為253個家族和61個亞家族[4]。擬南芥植物基因組編碼約500-800蛋白酶,分布在60多個家族,30個不同亞家族中[2],其中半胱氨酸蛋白酶約有140種,可以將其分為5個家族的15個亞家族[5],本文將重點對半胱氨酸蛋白酶家族的蛋白酶進行綜述。植物半胱氨酸蛋白酶(cysteine proteases,CPs)分為木瓜蛋白酶家族(C1)、液泡加工酶(vacuolar processing enzyme,VPE)、天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶家族(C14)、鈣依賴半胱氨酸蛋白酶家族(C2)和其他半胱氨酸蛋白酶家族[3]。木瓜蛋白酶C1家族可分為C1A和C1B亞家族[6],其中C1A半胱氨酸蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶中數(shù)量最多的蛋白之一[7]。C1A亞家族的催化位點由高度保守的催化三聯(lián)體組成:Cys 25,His 159和Asn 175,此結(jié)構(gòu)域是區(qū)分該亞家族的重要分類標志[8]。根據(jù)功能和結(jié)構(gòu)特征,可進一步將C1A半胱氨酸蛋白酶分為9個亞類,分別是:RD21Alike、RD19A-like、CEP1-like、XCP2-like、XBCP3-like、THI1-like、SAG12-like、AALP-like及CTB3-like[9]。

    已有研究報道,植物半胱氨酸蛋白酶在調(diào)控植物生長發(fā)育中發(fā)揮著重要的功能。它們參與種子的貯藏蛋白的降解,根、莖、葉和花等器官的衰老和程序性死亡過程,對目前已經(jīng)研究的參與植物生長發(fā)育過程的主要半胱氨酸蛋白酶及物種進行統(tǒng)計 (表1)。本文對植物半胱氨酸蛋白酶在植物各組織生長發(fā)育中的功能研究及其進展進行綜述并展望,旨為進一步研究半胱氨酸蛋白酶的功能提供參考。

    表1 半胱氨酸蛋白酶參與植物生長發(fā)育過程Table 1 Cysteine proteases involved in plant growth and development processes

    1 葉衰老過程

    葉片衰老是植物自然的生理過程,在葉片衰老過程中,葉肉細胞中的蛋白質(zhì)被降解,半胱氨酸蛋白酶介導的蛋白質(zhì)降解在該過程中發(fā)揮重要作用。葉片中蛋白質(zhì)降解后,產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)(如氨基酸)被重新轉(zhuǎn)移到生長或儲存組織等部位,從而維持植物進一步的生長發(fā)育[10]。研究報道,通過對擬南芥[11]和大麥[12]葉片衰老過程中進行分析發(fā)現(xiàn)半胱氨酸蛋白酶的表達和酶活性在葉片衰老過程中會顯著增加。Bhalerao 等[13]對田間衰老的白楊葉片和溫室中幼嫩的葉片分別構(gòu)建cDNA文庫,并對其基因表達模式進行分析發(fā)現(xiàn),老葉中半胱氨酸蛋白酶的表達序列標簽(expressed sequence tag,EST)豐富,且相關(guān)基因上調(diào)。

    在多個植物中,半胱氨酸蛋白酶特別是木瓜蛋白酶類半胱氨酸蛋白酶C1A,參與葉片衰老過程中蛋白的降解[14]。例如,SAG12[15]、RD21A[16]、AtRD19A、RD19C、ALP / SAG2 / AALP / ALEU[17]、CTB1和CTB3等[18]。除擬南芥以外,其他植物種中發(fā)現(xiàn)與擬南芥AtSAG12同源的蛋白,編碼這些蛋白的基因在葉衰老過程中上調(diào)或在葉片衰老過程中被誘導,參與調(diào)控葉片的衰老過程[14,18]。例 如,油 菜(Brassica napus)BnSAG12(BnSAG12-1和BnSAG12-2)[19]、煙草NtCP1[20]和NtSAG12[21]、水稻OsSAG39[22]、橡膠樹HbSAG12H1[23]及辣椒CaCP[24]。

    1.1 SAG12(senescence-associated gene 12)參與調(diào)控葉片衰老過程

    半胱氨酸蛋白酶SAG12的表達模式與葉片衰老過程嚴格相關(guān),Lohman等[15]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)半胱氨酸蛋白酶SAG12蛋白酶在葉片衰老過程被誘導。SAG12啟動子上游-603和-571 bp處含有一段高度保守的區(qū)域[25],負責衰老特異調(diào)節(jié),被作為擬南芥葉片衰老標記基因使用[26-28]。Otegui等[29]對ProSAG12:GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥分析發(fā)現(xiàn)衰老葉片中的SAG12僅含SAV的葉肉和保衛(wèi)細胞中表達,將SAG12與GFP融合表達,發(fā)現(xiàn)SAG12定位于衰老葉片葉肉細胞和保衛(wèi)細胞中具有強烈蛋白水解活性的衰老相關(guān)的囊泡中(senescence associated vacuoles,SAVs)。雖然與野生型相比,擬南芥sag12純合突變體并無明顯的葉衰老表型[29]。但是,James等[30]發(fā)現(xiàn)sag12純合突變體中SAG12酶活性降低能夠誘導其他天冬氨酸蛋白酶CND41-like活性增加,來彌補SAG12活性的缺失,共同參與葉片衰老過程中的Rubisco降解。同樣,在油菜葉片衰老過程中,半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶等多種蛋白酶被激活,參與Rubisco蛋白降解和氮素轉(zhuǎn)移[31]。James 等[30,32]研究發(fā)現(xiàn),SAG12在葉片衰老過程中的氮素轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用。在低氮條件下,SAG12不僅能將葉片衰老過程中釋放的氮素轉(zhuǎn)移到種子中,還能將根中蛋白質(zhì)降解釋放出的氮素轉(zhuǎn)移到種子中,為其提供氮素,從而確保種子產(chǎn)量。

    水稻中存在與AtSAG12同源的蛋白,即Os-SAG12-1[33]和OsSAG12-2[34]。Singh等[34]對OsSAG12-2的生化功能進行研究,大腸桿菌中重組OsSAG12-2能夠自我水解成有功能的蛋白酶,該酶具有蛋白水解酶功能,能水解偶氮酪蛋白底物。OsSAG12-1與AtSAG12相似度最高,在衰老和病原體感染過程中,OsSAG12-1的表達被誘導,RNAi轉(zhuǎn)基因水稻株系中該基因表達下調(diào),誘導細胞死亡[33];在鹽和紫外線脅迫誘導條件下,OsSAG12-2在RNAi轉(zhuǎn)基因植株中表達下調(diào)會增強脅迫誘導的細胞死亡,過量表達OsSAG12-1 和OsSAG12-2可減緩死亡過程[33]。說明OsSAG12-1和OsSAG12-2都是脅迫誘導細胞死亡的負調(diào)節(jié)因子[34]。

    1.2 HvPap-14參與葉綠體蛋白的降解來介導葉片衰老過程

    作為單子葉植物,大麥被用于研究單子葉植物中葉片衰老的模式植物。大麥的C1A家族由41個成員組成(HvPap-1至HvPap-42),在黑暗誘導條件下,對大麥葉片衰老過程中C1A家族成員的蛋白酶基因表達模式分析發(fā)現(xiàn),HvPap-4、HvPap-7、HvPap-8、HvPap-13、HvPap-14、HvPap-15和 HvPap-22在衰老葉片中表達上調(diào)[18]。Díaz-Mendoza等[18]對黑暗誘導衰老葉片中的大麥半胱氨酸蛋白酶進行研究發(fā)現(xiàn),HvPap-1和HvPap-19定位于衰老葉片葉肉細胞的小囊泡(可能是SAV),它們參與葉綠體蛋白降解的過程。HvPap-1在黑暗和氮缺乏的條件下被誘導[12]。在自然衰老和黑暗誘導衰老過程中,過表達HvPap-1加速了葉片的衰老,而HvPap-1沉默則延遲了葉片衰老過程[12],說明HvPap-1參與調(diào)控葉片衰老過程。在干旱脅迫條件下,HvPap-1和HvPap-19表達上調(diào),HvPap-1和HvPap-19的敲除可減少干旱脅迫條件下葉片蛋白質(zhì)的降解[35]。HvPap-14基因在衰老的葉片中表達量最高[36]。Frank等[37]免疫電鏡分析發(fā)現(xiàn)其酶原存在于類囊體膜和類囊體腔中,而HvPap-14的成熟酶定位于葉綠體類囊體膜上;體外激活實驗證實HvPap-14酶原在pH<6條件下被激活為成熟酶;酶活分析發(fā)現(xiàn)HvPap-14的底物是LHCB(葉綠素a/b結(jié)合蛋白),PSBO(光系統(tǒng)II的外周蛋白)和葉綠體蛋白Rubisco大亞基,說明在葉片衰老過程中,大麥HvPap-14大量表達并被激活,通過參與葉綠體類囊體膜蛋白和Rubisco大亞基的降解,來介導葉片衰老的過程[12]。

    總之,半胱氨酸蛋白酶通過催化葉綠體中Rubisco蛋白的降解,實現(xiàn)氮素的轉(zhuǎn)移,是葉片衰老過程中蛋白質(zhì)降解的重要途徑。除了SAG12,越來越多的半胱氨酸蛋白酶被發(fā)現(xiàn)參與該過程,它們之間存在功能相似性,在不同衰老條件下,其酶學機制及蛋白質(zhì)降解底物和降解途徑是否也存在相似性,有待進一步研究。

    2 維管組織的PCD過程

    植物維管組織中木質(zhì)部細胞中導管分子和纖維細胞發(fā)生程序性細胞死亡(PCD)過程,其液泡破裂,并釋放出半胱氨酸蛋白酶和其他水解酶,內(nèi)容物降解并形成空腔,同時次生壁發(fā)生增厚,從而使導管分子(tracheary element,TE)具有輸水功能[38-39]。

    2.1 ZCP4參與導管分子PCD過程

    半胱氨酸蛋白酶在導管分子PCD過程中被誘導。體外培養(yǎng)百日草懸浮細胞可誘導形成導管分子,被廣泛用于研究導管分子分化的模式系統(tǒng)。百日草ZCP4編碼木瓜蛋白酶類的半胱氨酸蛋白酶,在TE早期分化過程的PCD中起作用[40-41]。ZCP4基因在TE分化早期[42-43]表達,在擬南芥中表達proZCP4∶GUS,觀察其在木質(zhì)部導管分子分化過程中的表達模式發(fā)現(xiàn),ZCP4在子葉、胚軸和根中早期分化的導管分子(TE)中特異表達,而且僅在未成熟的導管分子中表達,而不在成熟導管分子和其他細胞中表達,說明可作為導管分子早期分化的標記基因[44]。對ZCP4啟動子進行分析發(fā)現(xiàn),11 bp的導管分子順式作用元件TERE(tracheary-elementregulating cis-element)序 列(CTTNAAAGCNA)是TE特異表達所必須的,它決定了該基因在TE特異性表達模式。除ZCP4以外,TERE順式作用元件也存在于TE分化過程中與PCD相關(guān)的蛋白酶基因和與次生壁形成相關(guān)基因的啟動子中,說明TERE順式作用元件也決定了這些基因在TE中的表達特 異性[45]。

    2.2 AtXCP1(xylem cysteine protease 1)和AtXCP2參與木質(zhì)部導管分子PCD過程

    擬南芥半胱氨酸蛋白酶AtXCP1和AtXCP2為同源蛋白,二者在木質(zhì)部中特異性表達,并在木質(zhì)部導管分子(tracheary elements,TEs)PCD中發(fā)揮作用[46]。XCP1和XCP2編碼約40 kD的前體蛋白,在酸性條件下中,去除N端信號肽和和前體結(jié)構(gòu)域,XCP1和XCP2被激活,形成具有活性的成熟蛋白酶。利用XCP1和XCP2啟動GUS融合蛋白表達,研究其在擬南芥中的表達模式,發(fā)現(xiàn)二者均在分化的TE中表達[46]。XCP1和XCP2在根的TE自溶過程中發(fā)揮作用[47]。Avci等[47]將根中TE的自溶過程分為兩個步驟,第一步是微自溶(micro-autolysis)即中央大液泡完整時發(fā)生的自溶;第二步,大規(guī)模自溶(mega-antolysis)即中央大液泡破裂后引起的自溶。通過對xcp1、xcp2單突變體和 xcp1 xcp2雙突變體根中TE的自溶過程進行電鏡分析發(fā)現(xiàn),XCP1和XCP2主要參與中央液泡破裂前的微自溶過程,同時也與其他水解酶一起,參與了液泡膜破裂后細胞內(nèi)容物清除的過程。在xcp1單突變體和xcp1 xcp2雙突變體中,由于XCP1表達缺失,TE空腔中出現(xiàn)內(nèi)容物未完全降解的現(xiàn)象,而且xcp1 xcp2雙突變體中未降解的內(nèi)容物比xcp1更致密,而xcp2突變體的表型與野生型差不多,說明在微自溶過程中XCP1發(fā)揮的作用要大于XCP2的作用[47]。

    2.3 γVPE參與木質(zhì)部纖維細胞的PCD過程

    液泡加工酶(VPE)屬于一類新的半胱氨酸蛋白酶,在植物中調(diào)節(jié)液泡蛋白的成熟和活化,通過液泡降解來介導植物細胞的程序性細胞死亡過程(PCD)。在擬南芥中有αVPE、βVPE、γVPE和δVPE四個蛋白酶,根據(jù)其表達部位,可以分為營養(yǎng)性VPE和種子型VPE,其中αVPE和γVPE在營養(yǎng)器官表達,βVPE和δVPE在種子中表達[48]。研究表明,γVPE在營養(yǎng)組織中表達,且在莖的形成層,初級韌皮部和初級木質(zhì)部中特異性表達[49-50]。γVPE在木質(zhì)部細胞的PCD過程中發(fā)揮重要作用。在與野生型擬南芥相比,γvpe突變體中木纖維細胞內(nèi)容物降解延遲和細胞次生壁增厚。體外實驗表明,γVPE在pH 值為7.0時以酶原形式存在,在pH 值為5.5條件下可通過自催化轉(zhuǎn)化為40 kD成熟酶。半胱氨酸蛋白酶CEP1也與木質(zhì)部發(fā)育過程中PCD和次生壁增厚有關(guān)[51],與γVPE存在上下游酶原激活關(guān)系,共同調(diào)控木質(zhì)部細胞的PCD過程。體外實驗表明,γVPE能在體外催化CEP1酶原,使其轉(zhuǎn)化成成熟蛋白。在γvpe擬南芥突變體的莖發(fā)育過程中,利用Western能檢測大量CEP1酶原,但缺少CEP1成熟酶,說明γVPE的缺失導致CEP1蛋白酶的成熟受到抑制。表明γVPE通過激活CEP1酶原的成熟來調(diào)控莖木質(zhì)部細胞的發(fā)育,參與莖發(fā)育過程中木質(zhì)部纖維細胞的PCD過程[52]。

    半胱氨酸蛋白酶是調(diào)控維管組織PCD過程的關(guān)鍵酶類,參與該過程的蛋白酶存在普遍的冗余現(xiàn)象,多個酶擁有相似或相近的功能,卻隸屬于不同的半胱氨酸蛋白酶家族,它們?nèi)绾螀f(xié)調(diào)發(fā)揮作用有待進一步研究。

    3 種子萌發(fā)過程

    隨著谷物種子的發(fā)育和成熟,貯藏蛋白聚集于胚乳中;當谷物種子萌發(fā)時,蛋白酶從盾片上皮細胞和糊粉層釋放到胚乳中,降解胚乳中的貯藏蛋白,產(chǎn)生的氨基酸和小肽被盾片吸收,然后運輸?shù)秸谏L的幼苗中,為幼苗的生長和發(fā)育提供所需的氨基酸[53-54]。半胱氨酸蛋白酶的正常啟動是保證種子正常萌發(fā)和幼苗正常生長發(fā)育的關(guān)鍵[55],因此必須嚴格控制蛋白酶活性啟動時間節(jié)點,以避免蛋白質(zhì)在非萌發(fā)期被降解而影響種子萌發(fā)。

    醇溶蛋白是谷物種子中的主要儲存蛋白,在玉米和小麥種子種子萌發(fā)過程中,半胱氨酸蛋白酶能夠降解約90%醇溶蛋白。在大麥中,42種蛋白酶參與其種子萌發(fā),其中27種是半胱氨酸蛋白酶[56]。木瓜蛋白酶類的半胱氨酸蛋白酶(C1A)和液泡加工酶(VPE)是參與雙子葉植物和單子葉植物種子萌發(fā)的主要蛋白酶[3,55,57],負責降解種子存儲蛋白,為幼苗的生長提供營養(yǎng)。不同物種中多個半胱氨酸蛋白酶均參與種子萌發(fā)過程中的蛋白質(zhì)降解過程,如單子葉植物大麥EPA[58]、EPB[53-54]、HvPap-19和HvPap-20[59]、aleurain[60]、HvPap-1[61-62]、HvPap-4和HvPap-6[63]、WEB-1[64]、水稻OsVPE-1[65]和REP-1[66];雙子葉植物擬南芥AP2,PAP3和RD19A[9];紫云英pSK19[67],黑吉豆SH-EP[68]和菜豆PvCEP-1[69]等。

    3.1 半胱氨酸蛋白酶B(endoprotease B,EPB)參與儲存蛋白的降解

    體外實驗證實,半胱氨酸蛋白酶EPA和EPB均可降解醇溶蛋白。在黑小麥中發(fā)現(xiàn)的EP8是EPA的同源蛋白,在種子萌發(fā)過程中在糊粉層中合成,負責在種子發(fā)芽過程中動員存儲的蛋白質(zhì),其活性可被內(nèi)源性胱抑素TrcC-4抑制[54]。Koehler 等[70]從大麥中分離和鑒定出半胱氨酸蛋白酶B(EPB1和EPB2)。Mikkonen等[53]通過原位雜交發(fā)現(xiàn)EPB在種子發(fā)芽后24 h在上皮細胞中表達,然后定位于胚乳周圍的糊粉組織表達。種子萌發(fā)過程中,胚中赤霉素含量增加并轉(zhuǎn)移到糊粉層,誘導相關(guān)蛋白酶基因的表達。赤霉素能夠誘導EPB基因的表達,EPB-1啟動子中含有赤霉素順式作用GARE元件RTAACARANTCYGG,嘧啶盒(YCTTTTY)和Box I(TATCCAT)是GA誘導所必需的[71]。

    3.2 βVPE介導種子儲存蛋白的成熟和δVPE參與種皮發(fā)育過程

    βVPE和δVPE屬于種子型VPE,βVPE在種子發(fā)育晚期儲存蛋白形成時期表達,介導種子儲存蛋白的成熟過程,而且是儲存蛋白加工成熟過程所必需的,在βvpe突變體種子中,90%VPE活性喪失[48]。當βVPE缺失后,αVPE、γVPE和天冬氨酸蛋白酶起到部分彌補βVPE的作用[72]。在種子中,種皮緊緊包裹胚和胚乳,在休眠階段保護胚免受機械損傷、病蟲害侵襲及紫外線破壞,種皮還能為胚胎發(fā)育轉(zhuǎn)移母體營養(yǎng)的橋梁作用。在種子發(fā)育早期,種皮ii2和ii3兩層細胞會經(jīng)歷PCD過程。而δVPE僅在種子發(fā)育早期的種皮ii2和ii3兩層細胞中表達,參與種皮發(fā)育過程中特定細胞層的細胞死亡過程。免疫電鏡結(jié)果顯示,δVPE定位于PCD過程中的ii2和ii3細胞內(nèi)外細胞壁上。當δVPE缺失突變,這兩層細胞的PCD延遲[73]。

    3.3 HvPap-1參與種子萌發(fā)過程中蛋白質(zhì)動員

    對半胱氨酸蛋白酶41個成員在大麥種子萌發(fā)過程中的表達模式進行分析發(fā)現(xiàn)[18],HvPap-4,Hv-Pap-6和HvPap-10在發(fā)芽的種子中高水平表達而且具有種子特異性表達模式[63]。HvPap-1由GA誘導,定位于胚中的蛋白體和囊泡,負責胚乳中的蛋白質(zhì)降解,參與大麥種子萌發(fā)過程中蛋白質(zhì)動員作用[61]。過量表達HvPap-1減少了種子中的淀粉量并提高了發(fā)芽率,而抑制HvPap-1表達則增加種子中的淀粉量且降低發(fā)芽率[62]。大麥中HvPap-1,HvPap-6和HvPap-19 定位于胚中,但HvPap-1,HvPap-6和HvPap-19 蛋白酶積累存在差異,可能不同的C1A半胱氨酸蛋白酶具有特異降解存儲蛋白的能力。

    總之,半胱氨酸蛋白酶參與降解或動員種子中存儲蛋白,在種子發(fā)芽和幼苗生長中起重要作用,半胱氨酸蛋白酶的表達和活性受GA,ABA和胱抑素等的調(diào)節(jié)。

    4 根的發(fā)育過程

    研究表明,擬南芥中3種含KDEL基序的半胱氨酸蛋白酶[74-77],即AtCEP1、AtCEP2和AtCEP3,以及毛果楊半胱氨酸蛋白酶基因PtCP5[78]在根的發(fā)育過程中起作用。

    4.1 AtCEP2參與初生根的生長過程

    AtCEP2參與了初生根的生長并影響根的發(fā)育過程[77]。AtCEP1和AtCEP2均在根的表皮層根尖細胞和側(cè)根尖的頂端(PCD位點)以及在側(cè)根生長期表達[74-75]。AtCEP2定位于根冠表皮細胞壁,無活性的AtCEP2酶原被運輸或擴散到細胞壁,在pH值低于6.5時通過自催化轉(zhuǎn)化為成熟酶[74,79]。從即將發(fā)生PCD的根冠細胞釋放出的有活性AtCEP2可能擴散到鄰近的質(zhì)外體和細胞壁,參與蛋白質(zhì)降解,進而影響表皮細胞伸長。AtCEP2的缺失,導致LR原基延遲出現(xiàn)。說明AtCEP2是根細胞生長所必需的,這可能影響了細胞壁的重塑能力[77]。

    4.2 PtCP5參與主根生長過程

    研究發(fā)現(xiàn),毛果楊半胱氨酸蛋白酶PtCP5影響根的發(fā)育過程,如張強[78]克隆獲得了毛果楊半胱氨酸蛋白酶基因PtCP5,通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn),PtCP5屬于木瓜類半胱氨酸蛋白酶家族中B類組織蛋白酶。利用實時定量PCR技術(shù)對PtCP5進行了組織表達定位分析,PtCP5主要在根部和葉部表達。構(gòu)建了半胱氨酸蛋白酶基因PtCP5的正義植物表達載體,并通過花序侵染法對野生型擬南芥進行侵染,成功獲得PtCP5正義轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。通過對PtCP5正義轉(zhuǎn)基因的擬南芥進行了主根長度分析,結(jié)果顯示,與野生型相比,PtCP5正義轉(zhuǎn)基因擬南芥主根長度明顯長于野生型。說明PtCP5參與主根生長影響根的發(fā)育過程。

    目前檢測到AtCEP1、AtCEP2和AtCEP3以及 PtCP5等半胱氨酸蛋白酶在根中表達量較高,且對根的生長發(fā)育有一定的影響,但是這些酶如何調(diào)節(jié)根的發(fā)育機制仍需進一步研究。

    5 花藥絨氈層PCD過程

    花藥是花粉的發(fā)育場所,為花粉的發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)。絨氈層是花藥囊最內(nèi)層細胞,在花藥發(fā)育后期會經(jīng)歷PCD,絨氈層細胞降解不正常會導致花粉敗育。半胱氨酸蛋白酶在絨氈層的PCD過程中起著重要作用[80-81]。在多種植物中發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶類半胱氨酸蛋白酶參與了絨氈層的PCD過程。例如,煙草中的NtCP56[80];擬南芥半胱氨酸蛋白酶51(CP51)和AtCP56[82]、CEP1[83]、βVPE[84];甘 藍型油菜BnaC.CP20.1[85];水稻OsCP1[86],這些蛋白酶基因的異常表達影響了絨氈層PCD進程,導致了不同程度的花粉敗育。

    5.1 CEP1參與絨氈層PCD過程

    半胱氨酸蛋白酶CEP1在擬南芥絨氈層細胞的程序化死亡和花粉發(fā)育的過程中起重要作用[83]。CEP1的表達量與花粉的可育程度相關(guān),CEP1的表達量過高或者過低,都會造成花粉不同程度的敗育。根據(jù)形態(tài)變化可將擬南芥花藥的發(fā)育分為14個時期,絨氈層在第5時期開始形成,同時小孢子母細胞分化,隨后通過減數(shù)分裂形成四分體;到第9-10時期絨氈層細胞開始降解,單倍體小孢子從四分體中釋放,然后進行不對稱的有絲分裂形成雙核小孢子;到第11-12時期絨氈層細胞急劇降解完成,此時雙核小孢子中的生殖細胞核經(jīng)歷一次有絲分裂形成三核花粉[87]。CEP1通過參與絨氈層降解,從而影響花粉發(fā)育。免疫組化顯示擬南芥半胱氨酸蛋白酶CEP1基因特異地的在花藥發(fā)育的第5-11時期的絨氈層中表達。免疫電鏡和western共同證實,CEP1花粉發(fā)育早期第5階段,無活性的CEP1酶原儲存于液泡中,在絨氈層細胞的PCD起始之前第6-8時期,在酸性的環(huán)境下,CEP1前體酶自催化去除信號肽和前肽,部分酶原轉(zhuǎn)化成有活性的成熟酶。在絨氈層細胞PCD過程中第9-11時期CEP1成熟酶從破裂的液泡中釋放,參與細胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)的降解。在cep1突變體中,絨氈層細胞壁的降解,絨氈層分泌結(jié)構(gòu)的形成和細胞核的降解被抑制,不能給花粉發(fā)育提供足夠的營養(yǎng)和組分,導致花粉外壁發(fā)育不正常,大部分花粉敗育。研究發(fā)現(xiàn),CEP1酶原一方面可自催化轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒煨问剑?3];另一方面,CEP1酶原成熟還需要βVPE的參與[84]。

    5.2 βVPE激活其他蛋白酶共同參與絨氈層PCD 過程

    Cheng等[84]利用Proβvpe:GUS檢測βVPE的表達模式,發(fā)現(xiàn)βVPE在擬南芥花藥發(fā)育的5-8時期高水平的表達,且在絨氈層中特異性表達。體外激活實驗顯示51 kD的βVPE酶原在pH5.2條件下可自催化轉(zhuǎn)化為27 kD成熟形式,免疫雜交顯示在花藥發(fā)育的βVPE在5-6時期以原酶和少量成熟酶的形式存在,在7-8時期完全轉(zhuǎn)化為成熟酶形式。說明花藥發(fā)育過程中βVPE在酸性條件下自催化形成有活性的成熟蛋白。在花發(fā)育過程中,βVPE酶原激活時間早于CEP1,同時βvpe與cep1突變體的花藥表型類似,表現(xiàn)出液泡裂解的延遲和花粉育性的降低。免疫雜交實驗證明,在βvpe突變體中花藥發(fā)育過程中,CEP1和RD19A的成熟受到嚴重抑制,RD19C完全不能被催化成成熟酶不能完全轉(zhuǎn)化為成熟酶[84]。說明βVPE作為一個早期被激活的半胱氨酸蛋白酶,處于蛋白酶激活網(wǎng)絡(luò)的上游,催化絨氈層發(fā)育過程中CEP1和其他半胱氨酸蛋白酶的成熟,從而參與絨氈層降解并且影響花粉發(fā)育[84]。

    總之,花藥絨氈層PCD對于花粉發(fā)育至關(guān)重要,目前一些與花藥絨氈層PCD發(fā)育相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶被報道,這些半胱氨酸蛋白酶在此過程中發(fā)揮直接或者間接作用,但是這些半胱氨酸蛋白酶在PCD過程中如何被激活;不同蛋白酶之間否存在上下游激活關(guān)系;它們之間的酶學調(diào)控網(wǎng)絡(luò)需要進行深入研究。

    6 總結(jié)與展望

    半胱氨酸蛋白酶在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用,不僅參與種子萌發(fā),根生長及葉片衰老過程,還參與莖中導管分子及花藥中絨氈層細胞的細胞程序性死亡過程。半胱氨酸蛋白酶在這些組織中發(fā)揮蛋白質(zhì)的降解作用,為新細胞的生長提供營養(yǎng)和組分,保證植物生長發(fā)育順利進行。有些半胱氨酸蛋白酶如δVPE在特定組織表達,影響特定組織的蛋白質(zhì)降解及生長發(fā)育過程。但是越來越多的研究發(fā)現(xiàn),某些半胱氨酸在多個組織中表達,影響多個組織的發(fā)育進程,而且半胱氨酸蛋白酶在不同組織功能不一樣,如SAG12除了參與葉片衰老,還與根發(fā)育相關(guān)[88]。βVPE除了參與種子中儲存蛋白的合成[48],還與花藥發(fā)育中絨氈層的細胞PCD有關(guān)[84]。CEP1不僅參與花藥絨氈層PCD過程,也參與莖中導管分子和纖維細胞的PCD過程,其他半胱氨酸蛋白酶是否在不同的植物組織中參與不同的功能,或者同一蛋白酶在不同組織中是否發(fā)揮著類似功能,還需要進一步深入研究。

    絕大多數(shù)的半胱氨酸蛋白酶以酶原形式存在,并且在特定的時間和地點被激活而發(fā)揮作用。體外實驗表明,不同的半胱氨酸蛋白酶激活條件不同,pH值是蛋白酶激活的重要條件,有些蛋白能夠在特定pH值條件下發(fā)生自激活,而有些蛋白酶的激活需要其他蛋白酶的參與,半胱氨酸蛋白酶在植物發(fā)育過程中如何被激活以及蛋白酶與蛋白酶之間的激活調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也值得進一步研究。

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