高原城市室內(nèi)灰塵對(duì)人角膜上皮細(xì)胞損傷研究

畢 玨,張振寧,劉雨佳,楊丹蕾,鄭欽象,崔道雷,向 萍* (1.西南林業(yè)大學(xué)濕地學(xué)院,國家高原濕地研究中心,云南 昆明 6504；.西南林業(yè)大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院,環(huán)境修復(fù)與健康研究院,云南 昆明 6504；.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院,浙江 溫州 507)

灰塵作為一種復(fù)雜、多相的粒子混合物,異質(zhì)性強(qiáng)[1],來源廣泛(土壤、大氣沉積顆粒物以及家居材料的磨損脫落等)[2-4],化學(xué)成分復(fù)雜[5].室內(nèi)灰塵被認(rèn)為是人體攝入和積累污染物的途徑之一[6-8].據(jù)統(tǒng)計(jì),人們有超過 85%的時(shí)間在室內(nèi)度過[9],且由于室內(nèi)環(huán)境的密閉性,室內(nèi)灰塵中的污染物濃度是室外灰塵中污染物濃度的數(shù)十倍[10].作為室內(nèi)灰塵中負(fù)載的有毒污染物,重金屬因其濃度高、檢出率高[11],以及暴露后可對(duì)人類造成嚴(yán)重危害而被廣泛研究.

近年,國內(nèi)外已開展室內(nèi)灰塵中重金屬的研究,結(jié)果顯示室內(nèi)灰塵中重金屬含量、富集程度高于室外灰塵[12-13].不同國家地區(qū)、不同功能區(qū)室內(nèi)環(huán)境之間的差異,導(dǎo)致灰塵中重金屬含量差異較大,而污染來源和影響因素也各不相同[14-15].粒徑作為影響灰塵中重金屬含量分布的原因之一.國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)室內(nèi)灰塵中的As、Zn、Cu、Pb、Ni易富集在90～150μm粒徑范圍,而Cd和Mn易富集在45μm以下[16],但 Csavina等[17]認(rèn)為重金屬易分布在小粒徑范圍.此外,Rashed[18]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)灰塵中可溶性金屬易被植物和生物體獲得,應(yīng)引起人們的重視.目前,針對(duì)室內(nèi)灰塵重金屬的研究,主要集中在其含量、來源、人體健康風(fēng)險(xiǎn)、不同粒徑和空間分布特征等方面[19-23],研究較為單一,而國內(nèi)目前較少關(guān)注灰塵中可溶性重金屬對(duì)人體健康暴露的影響.

目前,干眼、角膜炎的發(fā)病率逐年上升[24].有證據(jù)顯示,環(huán)境污染與眼表疾病的產(chǎn)生有關(guān)[25].流行病學(xué)也發(fā)現(xiàn),灰塵暴露可引起眼部疾病的發(fā)生[26].眼表作為人體持續(xù)暴露于外界環(huán)境的組織之一[27],極易受外界污染物暴露的影響.研究證實(shí),當(dāng)人眼長時(shí)間暴露在辦公室灰塵內(nèi),會(huì)導(dǎo)致人淚液中炎癥細(xì)胞顯著降低,即使人眼暴露在正常灰塵濃度(<0.001～3.2mg/m3)下,也可能誘導(dǎo)人角膜上皮細(xì)胞損傷[28].但目前仍缺乏室內(nèi)環(huán)境污染對(duì)眼表疾病的系統(tǒng)認(rèn)識(shí),而灰塵作為有毒重金屬匯集及遷移的媒介[29-30],當(dāng)前已有研究發(fā)現(xiàn) Pb暴露能夠?qū)е掳變?nèi)障等蛋白質(zhì)聚集性眼部疾病的發(fā)生[31],從而影響人眼健康.

目前室內(nèi)重金屬污染研究區(qū)域多集中在沿?；蚱皆^發(fā)達(dá)地區(qū),昆明市屬于典型低緯度高海拔區(qū)域,年平均輻射量可達(dá) 260.75MJ/m2[32],高強(qiáng)度紫外輻射中,會(huì)使人群眼表功能更加敏感和脆弱.本文以高原城市昆明的室內(nèi)灰塵為介質(zhì),考察不同功能區(qū)(辦公室、家庭住宅、學(xué)生宿舍)重金屬的含量水平,評(píng)估高原室內(nèi)灰塵對(duì)人眼角膜上皮細(xì)胞損傷的健康風(fēng)險(xiǎn),旨在為有效防控高原居民眼表健康風(fēng)險(xiǎn)提供參考.

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

儀器:等離子發(fā)射光譜儀(ICP-OES, Agilent 710,美國安捷倫科技公司);總有機(jī)碳分析儀(Vario,德國元素);臺(tái)式恒溫?fù)u床(TS-211HSGZ,上海天星);干燥培養(yǎng)兩用箱(GPX-9162,上海躍進(jìn));二氧化碳培養(yǎng)箱(371,賽默飛世爾);實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀(Roche LightCycler?480 Ⅱ,瑞士羅氏);梯度 PCR 儀(Mastercycler Nexus Gradient, Eppendorf公司);酶標(biāo)儀(SpectraMax? Plus 384, Molecular Devices公司,美國);低溫高速離心機(jī)(5804R, Eppendorf公司);Mastersizer 3000激光粒度分析儀(Malvern公司,英國);試劑: CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自碧云天生物科技有限公司;抗菌-抗真菌劑(Antibiotic-Antimycotic)、胎牛血清(FBS)購自美國 GIBCO 公司;0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液購自武漢普諾賽生命科技有限公司;表皮生長因子EGF購自美國Life Technologies公司; RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司; PBS磷酸鹽緩沖溶液購自北京索萊寶科技有限公司; SYBR green qPCR master mix、總 RNA快速提取試劑、牛血清蛋白(CAS:9048-46-8)、溶菌酶(CAS:12650-88-3)購于南京翼飛雪生物科技有限公司、無水氯化鈣(CAS:10043-52-4)購于上海麥克林生化科技有限公司;定量 PCR所用引物序列信息來源于哈佛大學(xué) Primer Bank(http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/),由上海生工生物公司合成.

1.2 樣品的采集與處理

利用ArcGIS 10.2進(jìn)行采樣點(diǎn)布設(shè),按昆明不同功能區(qū)劃,供試樣品于2019年4～12月期間使用真空吸塵器(Panasonic, MC-WGE61)采集樣品,一共 41個(gè)室內(nèi)灰塵樣品,其中辦公區(qū) 6個(gè),學(xué)生宿舍及家庭住宅分別為16和19個(gè),不同功能區(qū)采樣點(diǎn)樣品均為多點(diǎn)采集并分別混合成 1個(gè)樣品,樣品總量不少于2～5g.樣品帶回實(shí)驗(yàn)室除去毛發(fā)、絮狀物、煙頭等雜物,冷凍干燥后分別過 325 目(45μm)、250 目(63μm)、200目(75μm)、150目(100μm)、10目(2000μm)尼龍篩,放置于清潔的鋁箔紙中,裝入玻璃小瓶于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?

灰塵重金屬含量測定:按照美國 EPA的 USEPA 3050B方法[33],每個(gè)樣點(diǎn)設(shè)置3個(gè)平行,分別稱取4個(gè)不同粒徑及<100μm的200mg灰塵樣品于消解管內(nèi),加入10mL 1:1硝酸浸泡24h,放入消解爐內(nèi)105℃下回流加熱蒸發(fā)至2mL,冷卻后加入2mL 30%濃度的過氧化氫,再次在105℃下消解至近干, 0.1mol/L的硝酸定容至50mL,使用0.45μm濾頭過濾至離心管中,最后利用ICP-OES測定灰塵中重金屬Pb, Cu, Cd, Zn, Cr,Ni, Co, As, Mn的含量.為保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性,玻璃器皿用25%硝酸溶液浸泡24h以上,自來水、去離子水各清洗 3遍以上; ICP-OES加標(biāo)回收率為(93.5%～110.6%),測定結(jié)果均達(dá)到質(zhì)量控制要求.分析測試過程中重金屬標(biāo)準(zhǔn)品購于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心,所用水均為二次去離子水,試劑均為分析純.

灰塵粒徑測定:將收集的不同功能區(qū)灰塵分別通過2mm的尼龍篩,除去毛絮狀和其他雜物,使用激光散射方法[34],通過Mastersizer 3000激光粒度分析儀分別測定3次,并計(jì)算平均直徑.

灰塵中目標(biāo)重金屬生物可給性測定:考慮到粒徑小于 100μm的灰塵更容易被人體吸附[35],各稱取上述不同功能區(qū)<100μm 室內(nèi)灰塵 0.70g,并設(shè)置 3個(gè)平行,將灰塵加入到裝有 35mL模擬人工淚液(配方改自Weng等[36]磷酸緩沖鹽溶液0.01mmol/L、氯化鈣 0.01mmol/L、牛血清蛋白 0.1mg/mL、溶菌酶0.1mg/mL)的聚丙烯(polypropylene)離心管中,并同時(shí)加入抗菌-抗真菌溶液(終濃度 3%),渦旋振蕩5min,混勻后,使用搖床分別振蕩6h, 12h, 24h,振蕩完成后將離心管放入超聲波清洗機(jī)中,低溫連續(xù)超聲4次,15min/次,超聲功率為90%,用0.22μm的一次性濾頭過濾超聲后的灰塵混合液,通過ICP-OES測定灰塵中可溶性目標(biāo)重金屬含量.灰塵中目標(biāo)重金屬生物可給性由下式計(jì)算[37]:

式中: BA為室內(nèi)灰塵重金屬在模擬人工淚液中的生物可給性, %; DS為室內(nèi)灰塵重金屬在模擬人工淚液中溶解態(tài)含量, mg/kg; TS為室內(nèi)灰塵中重金屬總含量, mg/kg.

1.3 灰塵暴露液配置

稱取粒徑<100μm 辦公室灰塵 0.064g溶解于50mL人工淚液中,同時(shí)加入抗菌-抗真菌溶液(終濃度 3%),渦旋振蕩 5min,使其充分混勻后放入搖床振蕩 24h,之后將離心管放入超聲波清洗機(jī)中,低溫連續(xù)超聲提取 4次, 15min/次,超聲功率為 90%,用0.22μm 的無菌一次性濾頭過濾超聲后的灰塵母液(1280μg/mL),錫箔紙包裹于 4℃冰箱備用.據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道正常室內(nèi)灰塵濃度在<0.001～3.2mg/m3范圍內(nèi)[28],相關(guān)室內(nèi)灰塵對(duì)人眼角膜上皮細(xì)胞損傷研究中,灰塵暴露濃度在1～1000[38], 10～500[39], 50～3200[35]μg/mL不等,因此本文將灰塵暴露液濃度設(shè)置為20, 40,80, 160, 320, 640μg/mL.

1.4 人角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞形態(tài)和活力檢測

在測定細(xì)胞活力之前,使用 DMEM 高糖培養(yǎng)基稀釋灰塵母液.人角膜上皮細(xì)胞(HCECs)來自于浙江省溫州大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院.HCECs細(xì)胞生長于含有10%胎牛血清、1%抗菌-抗真菌劑和10ng/mL的表皮生長因子的高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中, 37℃、5% CO2條件下培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到 80%以上進(jìn)行傳代,按照不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康?分別接種到 96/6孔板中.細(xì)胞活力測定:以 1×104個(gè) cells/100μL/孔的密度將HCECs細(xì)胞接種到 96孔板中.待細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí),依次加入0(對(duì)照組, DMEM), 20, 40, 80,160, 320, 640μg/mL灰塵暴露液, 37 ℃ 5% CO2條件下暴露 24h后,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形貌,并拍照.隨后吸出灰塵暴露液,加入 CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑,在二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育 4h,完成后用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定OD值,計(jì)算細(xì)胞活力以及半數(shù)致死濃度值(LC50),實(shí)驗(yàn)時(shí)每種處理設(shè)置5個(gè)平行孔,并重復(fù)CCK-8細(xì)胞活力檢測實(shí)驗(yàn)3次取平均值.

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析炎癥基因表達(dá)

待6孔板中細(xì)胞鋪滿約80%皿底面積時(shí)進(jìn)行不同濃度20, 40, 80, 160, 320, 640μg/mL灰塵暴露液染毒,染毒24h后進(jìn)行總RNA提取.待總RNA提取完成后,使用翼飛雪生物科技 cDNA第一鏈快速合成試劑盒(去基因組)進(jìn)行 cDNA 的合成,步驟如下:取1000ng RNA,配制20μL反應(yīng)體系.反應(yīng)條件: 37℃15min, 85℃ 5秒(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)), 4℃下保溫.待逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完成后,將cDNA稀釋5倍后按照試劑盒說明配制 20μL的 PCR反應(yīng)體系.檢測目的基因IL-1β, TNF-α的表達(dá)水平,引物序列如表1所示,反應(yīng)平臺(tái)為Roche LightCycler?480 Ⅱ,平行孔設(shè)置同1.4.中CCK-8細(xì)胞活力檢測相一致.

表1 促炎癥基因qRT-PCR引物序列分析Table 1 qRT-PCR primer sequences for pro-inflammatory genes analysis

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示, GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,灰塵中重金屬總含量、不同粒徑重金屬含量以及目標(biāo)重金屬溶出率實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用 Two-way ANOVA法, CCK-8細(xì)胞活力、細(xì)胞炎癥因子 IL-1β和 TNF-α實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用One-way ANOVA法比較有無顯著性差異,以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果若P<0.05,則認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與討論

2.1 昆明室內(nèi)灰塵中重金屬含量特征

如表2所示,分別對(duì)昆明地區(qū)居民住宅(簡稱 R)、辦公室(簡稱O)及學(xué)生宿舍(簡稱D)<100μm 的混合灰塵中重金屬總量分別進(jìn)行測定,其中居民住宅灰塵中目標(biāo)金屬平均總含量為Cd (8.36mg/kg) < Co (13.6mg/kg)< As (15.7mg/kg) < Cr (47.5mg/kg) < Pb (114.5mg/kg)

表2 不同類型室內(nèi)灰塵中重金屬總量及可溶解率Table 2 Total concentration and solubility of heavy metals in three indoor dust samples

昆明室內(nèi)灰塵中重金屬Cd, Ni, Zn的平均總含量分別是云南省昆明市土壤背景值[40]的(R:52.3、O:39.3、D:28.8 倍); (R:4.5、O:9.5、D:5.9 倍); (R:10.7、O:12.3、D:11.2倍).經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析(Two-way ANOVA法),昆明市辦公室灰塵中Ni, Mn, Zn顯著高于居民住宅及學(xué)生宿舍(P<0.01),而其余金屬元素在各類型室內(nèi)灰塵間的含量無顯著差異.此外,辦公室灰塵中的Cr和Pb都高于家庭和宿舍.相比其他兩個(gè)區(qū)域,辦公室空間更為密閉,空氣流動(dòng)性差,同時(shí)該區(qū)域經(jīng)常使用電腦和打印機(jī)[41],這些行為可能導(dǎo)致其灰塵中的重金屬 Cr, Pb含量高于家庭和宿舍.本文還比較了國內(nèi)外各城市地區(qū)不同類型室內(nèi)灰塵重金屬含量(表3),由于Co, As的相關(guān)研究較少,因此重點(diǎn)關(guān)注其余7種重金屬.Cr, Cu, Pb, Mn和Zn含量水平高于中國河北[22]及蘭州[42](除去Cr)、加拿大Toronto[43](除去Cu)等國內(nèi)外城市.宿舍灰塵中Cr含量低于中國北京、蘭州,馬來西亞及印度等地[13,44-46].此外,本文區(qū)室內(nèi)灰塵中Ni含量高于表3中所列國家和地區(qū).有研究者認(rèn)為不銹鋼器皿的使用和驅(qū)蚊線圈的燃燒可能是室內(nèi)Ni濃度升高的原因之一[47-48].同時(shí),粒徑也可能影響Ni在灰塵中的分布,例如Doyi等[16]發(fā)現(xiàn)Ni易富集在150μm粒徑以下.此外,家庭灰塵中Pb和 Zn含量水平低于中國合肥[14]、澳大利亞Sydney[30]、埃及 Alexandria[49]和俄羅斯Chelyabinsk[50]等地.以上 4個(gè)城市人口密度均大于昆明,大量的人口以及繁忙的交通可能會(huì)導(dǎo)致重金屬含量的增加.Alexandria是埃及最大的海港,該地區(qū)道路灰塵中 Pb的濃度達(dá) 260mg/kg.盡管埃及自2000年開始逐步淘汰含鉛汽油,但土壤中沉積的鉛可能會(huì)通過再懸浮進(jìn)入該城市灰塵中.此外澳大利亞和埃及研究者[30,49]均認(rèn)為房屋使用年限能夠影響室內(nèi)灰塵重金屬含量分布.Sydney市中心房屋老舊,室內(nèi)灰塵中 Pb濃度隨房齡增加而增加(r=0.510,P<0.001),同樣的Alexandria房屋居住年限在15～30a之間,舊房子內(nèi)的油漆、地板及混凝土磨損風(fēng)化可能導(dǎo)致重金屬的釋放.Praveena等[51]發(fā)現(xiàn),墻壁油漆的顏色能夠顯著影響室內(nèi)重金屬的含量,例如黃色油漆可能會(huì)導(dǎo)致Cd、Cu、Pb和Zn的含量增加,而綠色涂料則導(dǎo)致 Zn含量升高.問卷和實(shí)地調(diào)查發(fā)現(xiàn),本文進(jìn)行灰塵采樣房屋使用年限小于 5a,多為新建筑且墻體均為白色乳膠漆,因此昆明室內(nèi)灰塵Zn含量低可能與此有關(guān).

表3 昆明市室內(nèi)灰塵中重金屬含量與國內(nèi)外其他城市對(duì)比(mg/kg)Table 3 Comparison of heavy metals in indoor dust of Kunming and other cities from the published data (mg/kg)

續(xù)表3

2.2 灰塵人工淚提取液中重金屬溶出率

研究發(fā)現(xiàn),被人體吸收的重金屬能夠造成細(xì)胞膜脂及蛋白質(zhì)的氧化損傷,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[52].前期研究發(fā)現(xiàn),灰塵中并非所有的重金屬均會(huì)被人體利用和吸收[25].淚液是覆蓋于眼球前表面的一層液體,灰塵中的重金屬污染物可能通過淚液這一介質(zhì)最終接觸到角膜上皮細(xì)胞,從而誘發(fā)潛在的毒性效應(yīng),然而尚未見灰塵中可溶出重金屬對(duì)人眼表健康影響的報(bào)道,且大多數(shù)針對(duì)灰塵毒性的研究均以重金屬總含量作為參考[53].為進(jìn)一步了解金屬元素在淚液中的溶出率,本文測定了灰塵中重金屬在人工淚提取液中的可溶出濃度,結(jié)果如表2所示.3種不同類型灰塵中Cd、Cr、Cu、Mn、Ni在人工淚提取液中含量最高,且宿舍灰塵中的重金屬在人工淚模擬液中的溶出率隨著提取時(shí)間的增加而增加.通過分析每種目標(biāo)金屬的生物可給性發(fā)現(xiàn),宿舍灰塵提取24h后目標(biāo)重金屬可溶解率由高到底依次為Mn(36.0%) > Cr (22.3%) > Cd (21.2%) > As (16.4%) >Zn (14.5%) > Cu (7.58%) > Ni (4.93%) > Co (3.42%)> Pb (2.54%).與宿舍不同,辦公室灰塵中目標(biāo)重金屬的可溶解率分別為As (16.1%) > Cd (5.3%) > Co(3.99%) > Cr (3.92%) > Cu (3.88%) > Ni (2.71%) >Mn (1.86%) > Zn (0.02%) = Pb (0.02%).此外,灰塵提取24h后,居民住宅除As、Pb未溶出外,其余金屬元素溶出率為Co (10.6%) > Cr (7.82%) > Cu (7.62%) >Ni (4.12%) > Mn (2.34%) > Cd (1.41%) > Zn (0.67%),其趨勢與辦公室相似.此外,與相似研究作對(duì)比發(fā)現(xiàn),辦公室和家庭灰塵人工淚提取液中 Ni、Cd、Cu、Zn等過渡金屬溶出量低于灰塵Hank’s水提取液[54],可能是由于溶出介質(zhì)差異導(dǎo)致.可見本文中灰塵重金屬元素生物可給性均低于 36%,且可能以不同化學(xué)形態(tài)存在,如果以重金屬總含量進(jìn)行相關(guān)毒性或健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)可能會(huì)高估其風(fēng)險(xiǎn).

2.3 不同粒徑室內(nèi)灰塵中重金屬含量分布規(guī)律

通過激光粒度儀對(duì)昆明室內(nèi)灰塵粒徑進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),辦公室灰塵中<63μm 粒徑占比為 61%,而500～150μm、150～63μm 各占 10%和 29%.居民住宅在 500～150μm、150～63μm 粒徑范圍占比相近(25.1%, 26.3%),<63μm 粒徑占 48.6%.然而宿舍粒徑分布與其他功能區(qū)有所區(qū)別,最大粒徑占比在500～150μm 范圍(39.3%),而 150～63μm 和 63μm 以下各占26.6%及34.1%.居民住宅、辦公室及學(xué)生宿舍灰塵中值粒徑分別為67.5, 53.6, 122μm.此外,據(jù)前人研究發(fā)現(xiàn),室內(nèi)灰塵的粒徑范圍從>2μm 到<63μm 不等,其中約三分之一的灰塵<500μm[41],本文結(jié)果與之相似.考慮到室內(nèi)灰塵粒徑在100μm以下易被人體吸附[35],并可能對(duì)人體健康產(chǎn)生危害.鑒于此,本文將粒徑分為4個(gè)范圍(F1:100～2000μm,F2:75～100μm, F3:63～ 75μm, F4:45～63μm),并探討昆明市不同粒徑范圍室內(nèi)灰塵中重金屬含量分布規(guī)律.粒徑作為表征灰塵理化性質(zhì)的重要指標(biāo)之一,粒徑間的差異可能會(huì)影響灰塵中重金屬含量的分布[58].通過 ICP-OES對(duì)不同粒徑灰塵中重金屬進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn), 9種重金屬在4個(gè)粒徑中均有檢出.由圖 1可看出,重金屬在各粒徑之間的分布規(guī)律較為多變,這與其他研究相一致[59],同時(shí)部分重金屬在不同粒徑上的分布呈現(xiàn)不規(guī)則的波動(dòng).居民住宅灰塵中的 Zn、Mn、Ni、Pb、Cr、Cd、Cu 在不同粒徑范圍差異不顯著.經(jīng)分析可能由于本文中灰塵粒徑范圍之間相差較小,因此可能造成各重金屬元素在不同粒徑間含量差異不顯著.宿舍和辦公室灰塵中的Cr隨灰塵粒徑的減小而升高,這與曹治國等[44]對(duì)北京市海淀區(qū)室內(nèi)灰塵中重金屬的研究結(jié)果相一致.辦公室及宿舍灰塵中Zn (857.7, 737.1mg/kg)、Mn(634.8, 367.6mg/kg)、Pb (163.51, 102.1mg/kg)、As(19.7, 18.5mg/kg) 4種元素易在 F2粒徑(75～100μm)上富集.而宿舍灰塵中 Cu (209.8mg/kg)和Ni(402.0mg/kg)則在 63～75μm 粒徑段達(dá)到峰值.本文結(jié)果還與McKenzie等[60]研究相一致,其認(rèn)為地球化學(xué)組分中, 63μm 以下的灰塵易富集重金屬,同時(shí)在該粒徑范圍內(nèi)觀察到Cr、Ni、Cu、Zn和Pb顯著富集.此外,<100μm 的灰塵顆粒易再懸浮到空氣中,由于人角膜上皮位置特殊,使得其長時(shí)間持續(xù)暴露在空氣中,容易受環(huán)境污染物,如大氣顆粒物、化學(xué)物質(zhì)、病原微生物等因素影響,并引起一系列的并發(fā)癥(角膜炎、紅腫、角膜潰瘍、異物感等),嚴(yán)重情況下能夠?qū)е率鱗61].因此,選擇粒徑<100μm 室內(nèi)灰塵進(jìn)行角膜上皮細(xì)胞毒性效應(yīng)研究.

圖1 重金屬在不同類型室內(nèi)灰塵中的粒徑分布特征Fig.1 Heavy metals concentrations across 4size fractions of three types of indoor dust samples

2.4 辦公室灰塵人工淚提取液對(duì)角膜上皮細(xì)胞形態(tài)及活力影響

細(xì)胞形態(tài)改變是反映細(xì)胞生理功能紊亂和毒性的重要指標(biāo)[62].本文發(fā)現(xiàn), HCECs經(jīng)辦公室灰塵人工淚提取液暴露后,通過顯微鏡觀察到隨暴露液濃度的增大,細(xì)胞形態(tài)由多邊形變?yōu)樗笞有?圖2(a)～(d),可能導(dǎo)致上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生, HCECs轉(zhuǎn)化為更具移動(dòng)能力的間質(zhì)細(xì)胞[63].同時(shí)由圖 2(d)可看出細(xì)胞在 1280μg/mL濃度下,細(xì)胞縮小且部分細(xì)胞出現(xiàn)透明懸浮,提示細(xì)胞出現(xiàn)了死亡,有研究證明過度的炎癥會(huì)導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡[64].鑒于此,本文借助CCK-8細(xì)胞活力試劑盒分析了HCECs經(jīng)灰塵人工淚提取液暴露24h后對(duì)其活力的影響.結(jié)果如圖2(e)所示,隨暴露液濃度的增加細(xì)胞活力呈濃度依賴性.低濃度下(20μg/mL, P<0.05)灰塵人工淚提取液能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖,可能原因是低濃度下能夠引起細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng),并激活了細(xì)胞增殖的相關(guān)分子通路[65-67].然而在40～320μg/mL濃度下,細(xì)胞活力未受到明顯影響,可能原因是細(xì)胞受到刺激,激活了細(xì)胞的抵御機(jī)制,細(xì)胞通過自我調(diào)控來抵御外界不利刺激,處于動(dòng)態(tài)平衡過程[25].而當(dāng)暴露液濃度增加至1280μg/mL 時(shí),細(xì)胞活力顯著降低(86.2±7.3)%, P<0.01,這可能是因?yàn)橥饨缁覊m濃度過大,產(chǎn)生的不利刺激遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了細(xì)胞的自身抵御能力,從而出現(xiàn)細(xì)胞活力降低[68].類似地, Huang等[52]比較了室內(nèi)灰塵(250～2000μg/100μL)水提取液對(duì)肝癌細(xì)胞(HepG2)、人皮膚角質(zhì)層細(xì)胞(KERTr)和肺上皮細(xì)胞(A549)毒性的影響,發(fā)現(xiàn)隨著灰塵水提取物濃度的升高,細(xì)胞活力逐漸降低,并且對(duì) KERTr細(xì)胞的抑制作用比HepG2和A549細(xì)胞更早出現(xiàn).此外,有研究將PM2.5暴露于小鼠角膜上皮細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞數(shù)呈濃度依賴性下降,當(dāng)濃度為 25～200μg/mL 時(shí),細(xì)胞存活率為80%～90%.即使在實(shí)驗(yàn)最高濃度為 1200μg/mL 時(shí),仍有60%的細(xì)胞存活[69].本文將細(xì)胞存活率與灰塵濃度進(jìn)行非線性擬合,其中半數(shù)致死濃度(LC50)為2410μg/mL見圖2 (f).本文前期研究了南京室內(nèi)灰塵水提取液對(duì)人角膜上皮細(xì)胞的毒性,其Hank’s灰塵水提取液暴露細(xì)胞24h后LC50為1278μg/mL[35],本文中LC50要大于其結(jié)果.灰塵中水溶性較好的重金屬能夠?qū)?xì)胞產(chǎn)生毒性作用[70],例如在細(xì)胞水平上,灰塵中包含Ni、Cd、Cu、Zn等過渡金屬,可能通過誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生,破壞膜脂、蛋白質(zhì)和 DNA,從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡.由于本文中模擬人工淚提取液所溶出的重金屬低于Hank’s水提取液,因此誘導(dǎo)的毒性效應(yīng)程度相對(duì)較低[35].也提示進(jìn)行角膜毒性研究時(shí),選擇接近角膜組織的人工淚液較其他介質(zhì)提取更為合理準(zhǔn)確.

圖2 辦公室灰塵提取液對(duì)人角膜上皮細(xì)胞形貌和活力的影響Fig.2 Effects of office dust extract on morphology and viability of Human corneal epithelialcells

2.5 辦公室灰塵人工淚提取液激活炎癥基因 IL-1β和TNF-α的表達(dá)

空氣污染物通過誘導(dǎo)炎癥因子基因過表達(dá),從而引起眼表炎癥疾病,如角膜炎、結(jié)膜炎等[25-26].灰塵暴露細(xì)胞后也能夠引起促炎癥反應(yīng)[71].然而人工淚液中生物可給態(tài)重金屬是否會(huì)激活炎癥基因表達(dá)仍然未知.本文將不同濃度 20,40,80,160,320,640,1280μg/mL辦公室灰塵人工淚提取液暴露 HCECs,并利用實(shí)時(shí)定量 PCR技術(shù)檢測分析典型眼表炎癥因子白介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的基因表達(dá)水平變化.如圖3所示, IL-1β的mRNA相對(duì)表達(dá)量呈濃度依賴性,在40～640μg/ mL,分別增加3, 1.7和2.2倍.1280μg/mL濃度下其mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)并達(dá)到最大值(16.68),與對(duì)照相比增加了16倍.而TNF-α在> 40μg/mL時(shí)出現(xiàn)濃度依賴性降低,分別降低 0.75～0.82倍,在最高濃度(1280μg/mL)時(shí)顯著增加至對(duì)照組的 2.4倍.本文中引起炎癥因子 IL-1β和TNF-α基因上調(diào),可能是生物有效態(tài)重金屬誘發(fā)了細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng),從而激活了下游的炎癥相關(guān)信號(hào)通路[72].IL-1β作為先天免疫反應(yīng)的最重要的促炎因子,在眼科疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用,其能促進(jìn)細(xì)胞炎癥、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞外基質(zhì)的積累[73].此外,灰塵中重金屬誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激通常會(huì)激活NF-κB和AP-1等轉(zhuǎn)錄因子,誘導(dǎo)炎癥因子(如 IL-1β)和趨化因子(如 TNF-α)的表達(dá),從而引起炎癥反應(yīng)[74].本文結(jié)果和以往報(bào)道有所差異, Xiang等[35]發(fā)現(xiàn),灰塵水提液暴露人角膜上皮細(xì)胞后,僅在50μg/mL濃度時(shí)TNF-α的mRNA顯著升高,而 200,800,3200μg/mL 均下調(diào).可能由于所用的提取液及灰塵樣品的不同,造成所溶出的污染物濃度間有差異,最終導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)對(duì)污染物刺激的分子機(jī)制也有所差別.

圖3 辦公室灰塵提取液暴露后誘導(dǎo)人角膜上皮細(xì)胞炎癥相關(guān)基因表達(dá)Fig.3 Expression of inflammatory genes after office dust extracts exposure

3 結(jié)論

3.1 昆明市居民住宅、辦公室及學(xué)生宿舍室內(nèi)灰塵中重金屬Zn(717.6, 825.5, 748.6mg/kg)平均含量最高, Cd平均含量最低(8.4, 6.3, 4.6mg/kg).辦公室灰塵中 Ni, Mn, Zn顯著高于居民住宅及學(xué)生宿舍(P<0.01),但其余6種金屬元素含量無明顯差異.此外,3種類型灰塵中Cd, Ni, Zn的含量均超過云南省昆明市土壤背景值.

3.2 室內(nèi)灰塵中重金屬在人工淚提取液中的溶出率低于36%,居民住宅中Co (10.6%)、辦公室中As(16.1%)及學(xué)生宿舍中的Mn (36%)平均溶出率最高.宿舍灰塵中的重金屬溶出率隨提取時(shí)間的增加而增加,而居民住宅及辦公室灰塵中Co, As, Cr, Pb的溶出率無明顯的一致性規(guī)律.

3.3 Zn、Mn、Ni、Pb、Cr、Cd、Cu 在不同粒徑范圍(F1:100～2000μm, F2:75～100μm, F3:63～75μm,F4:45～63μm)差異不顯著.辦公室及宿舍灰塵中的Zn(857.7, 737.1mg/kg)、Mn(634.8, 367.6mg/kg)、Pb(163.51, 102.1mg/kg)、As(19.7, 18.5mg/kg)在75～100μm 粒徑段達(dá)到最高值,宿舍灰塵中 Cu(209.8mg/kg)和Ni(402.0)在63～75μm達(dá)到最高值.

3.4 灰塵人工淚提取液暴露人角膜上皮細(xì)胞 24h后,能夠引起HCECs細(xì)胞形貌由多邊形變?yōu)樗笞有?灰塵暴露液濃度為 1280μg/mL時(shí),細(xì)胞活力顯著降低(86.2±7.3)%,P<0.01,同時(shí)炎癥因子IL-1β和TNF-α基因出現(xiàn)上調(diào).