β-伴大豆球蛋白通過上調(diào)NOD樣受體蛋白-3表達誘導豬小腸上皮細胞焦亡

王 蕾 孫智峰 劉羽佳 李思婷 謝維娜 單興根 田 朋 楊 悅 丁紅研 李 玉 王希春 吳金節(jié)

(安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，合肥 230061)

β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin，7S)是大豆中貯藏的一種主要蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量為140～180 ku，為大豆總蛋白質(zhì)含量的10.0%～12.7%，由α′亞基、α亞基和β亞基組成三聚體結(jié)構，分子質(zhì)量分別為68、72和52 ku，易引起幼齡動物免疫球蛋白E(IgE)型過敏反應[1]。動物吸收大豆球蛋白的主要部位在小腸，小部分見于胃和大腸中[2-3]。幼齡動物采食β-伴大豆球蛋白后，腸道出現(xiàn)明顯炎癥浸潤，使小腸通透性升高，損壞腸黏膜屏障，引起小腸炎癥性疾病，嚴重損傷機體健康，降低動物生產(chǎn)性能[4-5]。腸上皮細胞(IEC)層暴露于腸腔內(nèi)容物中，參與營養(yǎng)物質(zhì)的選擇性吸收，并通過相鄰IEC之間的緊密連接(TJ)的表達，對腸腔內(nèi)容物的被動細胞旁通透性起到屏障作用。本課題組前期研究證實，β-伴大豆球蛋白降低豬小腸上皮細胞(IPEC-J2)TJ的表達，提高細胞通透性，降低細胞線粒體膜電位，抑制細胞增殖，引起IPEC-J2損傷和凋亡[6-8]；在前期用透射電鏡觀察β-伴大豆球蛋白引起IPEC-J2損傷和凋亡的過程中，常發(fā)現(xiàn)高濃度(10 mg/mL)的β-伴大豆球蛋白組中細胞形態(tài)異常腫脹、細胞膜破裂、細胞質(zhì)流出、線粒體結(jié)構異常，細胞形態(tài)高度疑似細胞焦亡的外部形態(tài)。

細胞焦亡又稱細胞炎性壞死，是一種程序性細胞死亡，表現(xiàn)為細胞不斷脹大直至細胞膜破裂，導致細胞內(nèi)容物的釋放進而激活強烈的炎癥反應。NOD樣受體蛋白-3(NLRP-3)是細胞內(nèi)的一種蛋白質(zhì)復合體，主要功能是活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)進而間接調(diào)控白細胞介素-1β(IL-1β)的成熟及分泌，誘導細胞焦亡，引起炎癥反應。因此，本試驗擬通過構建慢病毒靶向siRNA-NLRP-3干擾載體轉(zhuǎn)染IPEC-J2后再添加10 mg/mL的β-伴大豆球蛋白，分析β-伴大豆球蛋白是否通過NLRP-3/Caspase-1/消皮素D(GSDMD)信號通路引起仔豬小腸上皮細胞焦亡，介導過敏性炎癥的發(fā)生，有助于認識其在仔豬腸道過敏反應發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中的作用，為臨床防治β-伴大豆球蛋白誘導的仔豬過敏性腸道疾病提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

β-伴大豆球蛋白購自中國農(nóng)業(yè)大學食品工程學院，并進一步提純至95%；IPEC-J2由武漢市農(nóng)業(yè)科學院細胞庫提供；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Thermo公司；二辛可寧酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自Biosharp；β-肌動蛋白(β-actin)由愛必信(上海)生物科技有限公司提供；辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗和山羊抗鼠二抗購自Biosharp；NLRP-3-shRNA慢病毒干擾載體及其陰性對照NC-shRNA慢病毒載體由廣州易錦生物技術公司構建合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

將對數(shù)生長期的IPEC-J2以5×105個/孔的密度接種在6孔細胞板，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞融合度達到30%～40%時，隨機分為A、B、C組，每組3個重復。A組(對照組，無添加)每24 h更換新鮮培養(yǎng)液。依據(jù)預試驗參數(shù)[感染復數(shù)(MOI)=100]進行病毒懸液的感染，B組(陰性對照組)添加慢病毒空載體，C組(干擾組)添加攜帶NLRP-3干擾片段的慢病毒載體，并加入5 μg/mL的聚凝胺輔助轉(zhuǎn)染，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h后更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。72 h后收集各組IPEC-J2，并通過實時熒光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)驗證攜帶NLRP-3干擾片段的慢病毒載體是否沉默NLRP-3基因。

1.2.2 RT-qPCR、Western blot驗證目的基因NLRP-3沉默效果

收集A、B、C組細胞，并加入Trizol試劑提取總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為模板，利用PCR儀擴增，以2-ΔΔCt法計算各組細胞中NLRP-3 mRNA相對表達量。NLRP-3 PCR引物序列為F:5′-GACCTCAGCCAAGATGCAA-3′,R: 5′-GACCTCAGCCAAGATGCAA-3′;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)PCR引物序列為F:5′-TGACCCCTTCATTGACCTCC-3′,R:5′-CCATTTGATGTTGGCGGGAT-3′。

收集A、B、C組細胞，進行Western blot檢測。每個聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(12%)泳道加入20 μg的總蛋白電泳并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上。PVDF膜4 ℃下與一抗孵育過夜后用Tris-HCl緩沖鹽溶液+吐溫(TBST)溶液清洗3次，進行二抗孵育。洗膜3次，放入凝膠成像系統(tǒng)顯影拍攝，以β-actin作為內(nèi)參蛋白校正試驗誤差。

1.2.3 試驗分組與設計

依據(jù)RT-qPCR和Western blot結(jié)果得知轉(zhuǎn)染攜帶NLRP-3干擾片段的慢病毒載體成功沉默目的基因NLRP-3后，將對數(shù)生長期的IPEC-J2以5×105個/孔的密度接種在6孔細胞板，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞融合度達到30%～40%時，隨機將細胞分為4組：A組為對照組(未轉(zhuǎn)染)，B組為陰性對照組(轉(zhuǎn)染慢病毒空載體)，C組為干擾組(轉(zhuǎn)染攜帶NLRP-3干擾片段的慢病毒載體)，D組為β-伴大豆球蛋白調(diào)節(jié)組(轉(zhuǎn)染攜帶NLRP-3干擾片段的慢病毒載體后添加10 mg/mL的β-伴大豆球蛋白，繼續(xù)培養(yǎng)24 h)，每組設置3個重復，轉(zhuǎn)染方法參照1.2.1。

1.2.4 細胞活性測定

按照6 000個/孔的密度將對數(shù)生長期中的IPEC-J2懸液(100 μL/孔)接種在96孔板中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞融合度達到30%～40%時，隨機分為A、B、C、D組，按照試驗分組與設計將B、C和D組分別進行慢病毒轉(zhuǎn)染(MOI=100)處理后，在D組添加10 mg/mL的β-伴大豆球蛋白。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL的細胞增殖毒性檢測試劑盒溶液，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育至出現(xiàn)明顯的顏色反應。用酶標儀測定450 nm處的光密度(OD)值，檢測細胞活性。

1.2.5 末端標記法(TUNEL)染色法觀測細胞陽性表達

收集A、B、C和D組細胞用10%中性甲醛固定，按照脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口TUNEL檢測試劑盒說明書檢測細胞死亡方式。采用紅色熒光標記TUNEL陽性細胞，4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(DAPI)染色細胞核，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.6 Caspase-1和IL-1β含量測定

收集A、B、C和D組細胞至離心管,1 000 r/min離心5 min,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次。隨后在每組樣品中加入500 μL含0.1% TritonX-100的0.1 mol/L Tris-HCl(pH=7.4),冰水中超聲裂解各組樣品。收集細胞裂解液，1 000 r/min離心10 min后，吸取上清液，依據(jù)ELISA試劑盒說明進行試驗，檢測Caspase-1和IL-1β含量。

1.2.7 透射電子顯微鏡觀察細胞形態(tài)

收集A、B、C和D組細胞至離心管,1 000 r/min離心5 min,棄上清液，每管加入1 mL的4%多聚甲醛4 ℃下固定12 h后，PBS洗滌3次(4 ℃，5 000×g，15 min)，之后用2%鋨酸滲透酸固定4 h。PBS沖洗后，用30%～100%酒精梯度脫水，滲透包埋，切割超薄切片染色，JEM-1230透射電子顯微鏡觀察并拍攝圖片。

1.2.8 RT-qPCR檢測NLRP-3、ASC、Caspase-1、IL-1β和GSDMDmRNA相對表達量

表1 基因引物序列參數(shù)

1.2.9 Western blot檢測NLRP-3、ASC、Caspase-1、IL-1β和GSDMD蛋白表達水平

收集A、B、C和D組細胞,進行Western blot檢驗，以β-actin作為內(nèi)參蛋白校正試驗誤差。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，采用SPSS 17.0軟件的ANOVA進行方差分析，最小顯著差異(LSD)法進行顯著性比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。使用Graph Pad Prism 7.0軟件繪制柱狀圖，使用Image J軟件分析Western blot蛋白條帶灰度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染IPEC-J2后成功沉默NLRP-3的表達

如圖1、圖2所示，與A組相比，B組細胞中NLRP-3 mRNA相對表達量和蛋白表達水平無顯著差異(P>0.05)，C組細胞中的NLRP-3 mRNA相對表達量和蛋白表達水平均極顯著降低(P<0.01)；與B組相比，干擾組細胞中的NLRP-3 mRNA相對表達量和蛋白表達水平均極顯著降低(P<0.01)。結(jié)果表明，慢病毒轉(zhuǎn)染IPEC-J2后成功沉默目的基因NLRP-3。

*表示與A組相比差異顯著(P<0.05),**表示與A組相比差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

圖2 Western blot檢測NLRP-3蛋白表達水平

2.2 β-伴大豆球蛋白降低IPEC-J2的細胞活性

如圖3所示，與A組相比，B、C組細胞活性無顯著差異(P>0.05)；與B組相比，C組細胞活性無顯著差異(P>0.05)；與C組相比，D組細胞活性極顯著下降(P<0.01)。

#表示與C組相比差異顯著(P<0.05),##表示與C組相比差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

2.3 β-伴大豆球蛋白促進IPEC-J2的陽性表達

如圖4所示，與A組細胞相比，B、C組細胞無明顯變化。與B組細胞相比，C組細胞無明顯變化。與C組細胞對比，D組細胞密度降低，數(shù)量明顯減少，細胞陽性表達明顯增強。

圖4 TUNEL染色法觀察各組IPEC-J2陽性表達

2.4 β-伴大豆球蛋白上調(diào)IPEC-J2細胞內(nèi)Caspase-1和IL-1β的含量

如圖5所示，與A組相比，B組細胞Caspase-1和IL-1β含量無顯著差異(P>0.05)，C組細胞Caspase-1含量顯著降低(P<0.05)，IL-1β含量極顯著降低(P<0.01)；與B組相比，C組細胞Caspase-1和IL-1β含量顯著降低(P<0.05)；與C組相比，D組細胞Caspase-1和IL-1β含量極顯著升高(P<0.01)。

圖5 β-伴大豆球蛋白對IPEC-J2細胞Caspase-1和IL-1β含量的影響

2.5 β-伴大豆球蛋白損傷IPEC-J2細胞的內(nèi)部結(jié)構

如圖6所示，與A組相比，B、C組細胞內(nèi)部結(jié)構無明顯變化；與B組相比，C組細胞內(nèi)部結(jié)構無明顯變化；與C組相比，D組細胞形態(tài)腫脹，細胞膜破裂出現(xiàn)孔洞、胞質(zhì)疏松、胞質(zhì)流出細胞膜，線粒體變性腫脹。

紅色箭頭所示：線粒體變性腫脹，細胞膜破裂出現(xiàn)孔洞、胞質(zhì)流出。

2.6 β-伴大豆球蛋白上調(diào)IPEC-J2細胞NLRP-3、ASC、Caspase-1、IL-1β和GSDMD mRNA相對表達量

如圖7所示，與A組相比，B組細胞NLRP-3、ASC、Caspase-1、IL-1β和GSDMDmRNA相對表達量無顯著差異(P>0.05)；C組細胞NLRP-3、Caspase-1和GSDMDmRNA相對表達量極顯著降低(P<0.01)，ASC和IL-1βmRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)。與B組相比，C組細胞IL-1βmRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)，NLRP-3、ASC、Caspase-1和GSDMDmRNA相對表達量極顯著降低(P<0.01)；與C組相比，D組細胞NLRP-3、ASC、Caspase-1、IL-1β和GSDMDmRNA相對表達量極顯著升高(P<0.01)。

圖7 β-伴大豆球蛋白對IPEC-J2中NLRP-3、ASC、Caspase-1、IL-1β和GSDMD mRNA相對表達量的影響

2.7 β-伴大豆球蛋白上調(diào)IPEC-J2細胞NLRP-3、ASC、Caspase-1、IL-1β和GSDMD蛋白的表達水平

如圖8所示，與A組相比，B組細胞NLRP-3、ASC、Caspase-1、IL-1β和GSDMD蛋白表達水平無顯著差異(P>0.05)；C組細胞NLRP-3、ASC、Caspase-1、GSDMD和IL-1β蛋白表達水平極顯著降低(P<0.01)。與B組相比，C組細胞Caspase-1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，NLRP-3、ASC、GSDMD和IL-1β蛋白表達水平極顯著降低(P<0.01)。與C組相比，D組細胞NLRP-3、ASC、Caspase-1、GSDMD和IL-1β蛋白表達水平極顯著升高(P<0.01)。

NLRP-3：NOD樣受體蛋白-3 nod-like receptor pyrin domain-3；ASC：凋亡相關斑點樣蛋白 apoptosis-associated speck-like protein;Caspase-1:半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1 cysteine-containing aspartate-specific proteases-1;IL-1β:白細胞介素-1β interleukin-1β;GSDMD:消皮素D gsdermin D。

3 討 論

消化免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善的仔豬采食β-伴大豆球蛋白后，小部分未分解的β-伴大豆球蛋白通過腸上皮細胞進入機體，引發(fā)由特異性抗體IgE介導的急性過敏反應，提高腸道通透性，損傷腸黏膜[1]。IPEC-J2位于仔豬小腸第1層，在構成完整的腸道管腔環(huán)境過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，β-伴大豆球蛋白破壞IPEC-J2細胞骨架和緊密連接蛋白，降低IPEC-J2活性，抑制細胞生長增殖，誘導細胞凋亡[8-9]。IECs焦亡是區(qū)別于細胞凋亡、鐵死亡、壞死和自噬的炎癥性細胞死亡形式，并在急、慢性腸道損傷的發(fā)病過程中發(fā)揮關鍵作用[10]。NLRP-3是廣泛存在于上皮細胞的炎性復合體，是引發(fā)細胞焦亡的關鍵因子[11-12]，被激活后通過其N端的熱蛋白結(jié)構域(PYD)與凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)的PYD域相連，誘導ASC的胱天蛋白酶募集結(jié)構域(CARD)招募并激活Caspase-1[13-15]。激活的Caspase-1切割GSDMD蛋白引發(fā)細胞焦亡[16]。

NLRP-3/Caspase-1在過敏性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[17-18]。本試驗利用慢病毒轉(zhuǎn)染IPEC-J2后，與A組相比，B組細胞的NLRP-3 mRNA相對表達量和蛋白表達水平無顯著差異，而C組細胞的NLRP-3 mRNA相對表達量和蛋白表達水平極顯著降低，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染慢病毒空載體對IPEC-J2的NLRP-3 mRNA相對表達量無顯著影響，而攜帶NLRP-3干擾片段的慢病毒載體轉(zhuǎn)染IPEC-J2可以顯著提高基因的轉(zhuǎn)染效率并能夠成功沉默目的基因NLRP-3。利用RT-PCR和Western blot驗證慢病毒轉(zhuǎn)染成功沉默目的基因NLRP-3后將樣本分為4組(A、B、C、D組)的試驗中，B組細胞的Caspase-1含量以及NLRP-3、ASC、Caspase-1 mRNA相對表達量和蛋白表達水平與A組相比無顯著差異；C組細胞的Caspase-1含量以及NLRP-3、ASC和Caspase-1 mRNA相對表達量和蛋白表達水平顯著低于A組及B組細胞；這說明沉默IPEC-J2的NLRP-3基因后，可以顯著下調(diào)NLRP-3通路下游的ASC和Caspase-1基因的表達量。與C組相比，D組細胞(在沉默NLRP-3基因的IPEC-J2培養(yǎng)液中加入10 mg/mL的β-伴大豆球蛋白)的Caspase-1含量顯著升高，NLRP-3、ASC和Caspase-1 mRNA相對表達量和蛋白表達水平顯著升高。本試驗結(jié)果說明，10 mg/mL的β-伴大豆球蛋白上調(diào)IPEC-J2NLRP-3的表達，上調(diào)的NLRP-3通過炎性復合體銜接蛋白ASC招募并激活Caspase-1。Zhang等[19]用卵蛋白誘導小鼠建立過敏性呼吸道炎癥模型發(fā)現(xiàn)，致敏組小鼠NLRP-3、ASC和Caspase-1 mRNA相對表達量和蛋白表達水平顯著上升；加入NLRP-3特異性抑制劑后NLRP-3、ASC和Caspase-1 mRNA相對表達量和蛋白表達水平顯著升高下降，這與本試驗結(jié)果相符合。

GSDMD是細胞焦亡的執(zhí)行蛋白，被活化的Caspase-1切割后，釋放其具有結(jié)合膜磷脂上膜打孔活性的N端結(jié)構域，在細胞膜上形成活性的孔隙，使得水分子等物質(zhì)進入細胞內(nèi)而引起細胞腫脹、細胞膜破裂，導致細胞焦亡[20-21]。Gan等[22]研究發(fā)現(xiàn)，NLRP-3特異性抑制劑可以抑制GSDMD的活化，并抑制IL-1β的過度釋放，緩解細胞焦亡。本試驗中，C組細胞IL-1β含量，GSDMD和IL-1βmRNA相對表達量和蛋白表達水平均顯著低于A、B組細胞，說明沉默IPEC-J2的NLRP-3基因能夠顯著抑制GSDMD和IL-1β的表達，這與Liu等[23]通過敲除NLRP3基因顯著減少IL-1β分泌和抑制呼吸道上皮細胞焦亡的結(jié)果一致。Song等[24]研究表明，Caspase-1切割GSDMD蛋白后釋放炎性介質(zhì)IL-1β，進一步級聯(lián)擴大炎癥反應，導致細胞焦亡和腸組織損傷。本試驗中，與C組相比，D組細胞IL-1β含量，GSDMD和IL-1βmRNA相對表達量和蛋白表達水平顯著升高，細胞活性顯著降低，TUNEL染色IPEC-J2呈陽性表達，透射電鏡觀察可見細胞膜出現(xiàn)孔洞、細胞腫脹裂解、細胞質(zhì)外溢、線粒體腫脹病變、線粒體嵴消失，細胞外部形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構呈現(xiàn)典型的細胞焦亡狀態(tài)。Kim等[25]發(fā)現(xiàn)NLRP-3炎性小體的激活與過敏性重癥/難治性哮喘的發(fā)生顯著相關，進一步研究發(fā)現(xiàn)塵螨等過敏源通過NLRP-3/Caspase-1/GSDMD信號通路誘導人支氣管上皮細胞焦亡，本試驗結(jié)果與此一致。這表明β-伴大豆球蛋白顯著上調(diào)NLRP-3 mRNA相對表達量，上調(diào)的NLRP-3激活其下游的Caspase-1/GSDMD信號通路，進而過度釋放炎性介質(zhì)IL-1β，誘導IPEC-J2焦亡。

4 結(jié) 論

β-伴大豆球蛋白通過上調(diào)IPEC-J2的NLRP-3表達，激活NLRP-3/Caspase-1/GSDMD信號通路，誘導IPEC-J2焦亡。