大豆球蛋白提取條件優(yōu)化及7S和11S 亞基的鑒定

彭 棋，阮記明，黃冬艷，王自蕊，黃柳梅，熊平文，黃建珍

(江西農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院，江西 南昌 330045)

大豆是動物重要的蛋白質(zhì)資源，與谷類作物蛋白相比，大豆蛋白質(zhì)具有含量高、氨基酸平衡性好，以及乳化性、吸油性等優(yōu)良的理化性質(zhì)而被廣泛應用于食品業(yè)、醫(yī)藥業(yè)和動物飼料等多個領域［1-3］。而在大豆蛋白質(zhì)中，大豆球蛋白占50%～90%。大豆蛋白主要由2S、7S、11S、15S 這4 種組分組成，其中7S球蛋白和11S 球蛋白是大豆蛋白的主要成分［4］。研究表明，11S 和7S 組分在理化性質(zhì)、營養(yǎng)功能特性方面均有很大差異［5］。7S 大豆球蛋白與11S 球蛋白一樣含有低量的含硫氨基酸，這相對降低了大豆貯藏蛋白的營養(yǎng)價值;與11S 球蛋白相比，7S 大豆球蛋白含有的巰基和二硫鍵較少導致其凝膠保水性和黏結性較差，而含有的賴氨酸和疏水性氨基酸較多導致其具有較強的表面活性、較好的溶解性、乳化性與穩(wěn)定性。然而，11S 大豆球蛋白與7S 球蛋白在液泡型蛋白體的共同蓄積狀態(tài)增加了該類蛋白的提純難度［6］，因此對大豆球蛋白的分離提取分析對于大豆蛋白質(zhì)營養(yǎng)品質(zhì)的研究具有重要意義。

截至目前，一些學者報道了一些關于大豆球蛋白提取分離的方法［7］，如超速離心、低溫沉淀、等電點沉淀、鹽析、膜分離和層析分離等，但試驗步驟比較繁瑣，不太適合大規(guī)模生產(chǎn)。本研究以大豆為原材料，探討了在不同提取液、不同pH、不同溫度、不同濃度及不同料液比對大豆球蛋白提取的影響，并參考Xiao Ru［8］介紹的方法將大豆球蛋白7S 和11S 亞基進行分離提取及進一步分析。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及材料

1.1.1 試驗材料與試劑 大豆由江西某飼料公司惠贈;丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉、過硫酸銨、四甲基乙二胺、考馬斯亮藍G-250 均購自Amresco;低分子量標準蛋白購自中科院上海生化研究所;無水丙酮等試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器 24DN 制膠器購自北京市六一儀器廠;DYY-7C 型電泳儀購自北京市六一儀器廠;透析袋購自上海生物化學研究所;PHS-3C 型精密pH 計購自上海雷磁儀器廠;TGL-16G-A 高速冷凍離心機購自上海儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 大豆脫脂豆粉的制備 豆粕采用PolymixA10 高速粉碎機粉碎，并過80 目篩，用丙酮脫脂3 次，抽濾，風干，即得脫脂豆粉，-20 ℃保存。

1.2.2 大豆球蛋白及2S 和11S 亞基的提取(1)不同種類提取液對大豆球蛋白提取的影響。采用pH8.5 的PBS 溶液和0.05 mol/L、pH9.0 的Tris-HCl 溶液作為大豆球蛋白的提取液，料液比為1∶10提取大豆球蛋白，在55 ℃的條件下放置2 h 后，以9 000×g 離心30 min，提取上清液。

(2)不同pH 提取液對大豆球蛋白提取的影響。采用0.05mol/L 的Tris-HCl，使用pH 計，濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH，分別為6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0 在55 ℃料液比為1∶10 的條件下放置2 h，以9 000×g 離心30 min，提取上清液。

(3)不同溫度對大豆球蛋白提取的影響。采用0.05 mol/L、pH9.0 的Tris-HCl 溶液作為大豆球蛋白的提取液，料液比為1∶10 提取大豆球蛋白，在25、35、45、55 ℃的條件下分別放置2 h 后，以9 000×g 離心30 min，提取上清液。

(4)不同濃度的Tris-HCl 提取液對大豆球蛋白提取的影響。采用0.01、0.03、0.05、0.10、0.20 mol/L，pH9.0 的Tris-HCl 溶液作為大豆球蛋白的提取液，料液比為1∶10，在55 ℃的保溫箱內(nèi)放置2 h，9 000×g 離心30 min，提取上清液。

(5)不同料液比對大豆球蛋白提取的影響。采用0.05 mol/L、pH9.0 的Tris-HCl 溶液作為大豆球蛋白的提取液，料液比為1∶10、1∶12、1∶15、1∶18、1∶20 提取大豆球蛋白，在55 ℃的保溫箱中放置2 h 后，9 000×g 離心30 min，提取上清液。

(6)7S 伴大豆球蛋白和11S 球蛋白的分離提取方法參考文獻［8］。

1.2.3 大豆球蛋白的檢測 采用SDS-PAGE 電泳鑒定分離大豆球蛋白。取20 μL 上清液進行上樣電泳，濃縮膠濃度為5%，分離膠的濃度為10%。恒壓電泳(濃縮膠80 V、分離膠115 V)，當溴酚藍距膠底部5 mm 時，停止電泳。用考馬斯亮藍染色液對膠進行染色8 h，脫色2 h，直至背景無色后，用凝膠成像系統(tǒng)對凝膠進行掃描并分析。

2 結果與分析

2.1 不同種類提取液對大豆球蛋白提取的影響

從圖1 可以看出，用這兩種提取液地提取效果都比較好，pH9.0 的PBS 溶液能夠更好的解離出大亞基，而pH9.0 的Tris-HCl 溶液對大、小亞基的溶解效果都比較好，所以本試驗采用的是Tris-HCl 作為大豆球蛋白的提取液。

圖1 不同提取液的SDS-PAGE 電泳圖譜Fig.1 SDS-PAGE pattern of soybean GLObulin extracted by different extracting solution

圖2 不同PH 提取液提取大豆球蛋白的SDS-PAGE 電泳圖譜Fig.2 SDS-PAGE pattern of soybean GLObulin extracted by the solution of different extracting pH

2.2 不同pH 提取液對大豆球蛋白提取的影響

從圖2 可以看出，隨著Tris-HCl 的pH 逐漸增大，電泳的條帶越深，說明大豆球蛋白的提取程度提高了。在pH 為9.0 時，再繼續(xù)提高溶液的pH，大豆球蛋白的溶解度沒有增高，說明提取大豆球蛋白比較適合的pH 為9.0。

2.3 不同料液比對大豆球蛋白提取的影響

從圖3 可以看出料液比為1∶18 和1∶20 基本上沒有提取到多少球蛋白，料液比為1∶15、1∶12、1∶10能夠提取到大部分的球蛋白，綜合分析合適料液比為1∶10。

圖3 不同料液比提取大豆球蛋白的SDS-PAGE 的電泳圖譜Fig.3 SDS-PAGE pattern of soybean GLObulin extracted by solution of different sample-solution ratio

圖4 不同濃度提取液提取大豆球蛋白的SDS-PAGE 的電泳圖譜Fig.4 SDS-PAGE pattern of soybean GLObulin extracted by solution of different solution concentration

2.4 不同濃度的Tris-HCl 提取液對大豆球蛋白提取的影響

從圖4 可以看出，隨著提取液濃度的升高，大豆球蛋白的溶解度也升高。在提取液為0.01 mol/L和0.03 mol/L 的情況下，基本上沒有提取到大豆球蛋白，0.05 mol/L 對大豆大小亞基提取量都比較高，0.1 mol/L 和0.2 mol/L 的提取液對小亞基的提取程度比較高而對大亞基的提取量比較低。綜合分析提取大豆球蛋白的Tris-HCl 合適體積分數(shù)為0.05 mol/L。

2.5 不同溫度對大豆球蛋白提取的影響

從圖5 可以看出，25 ℃～55 ℃溫度段，隨著溫度的提高大豆球蛋白的溶解度逐漸增大，所以綜合各因素考慮可得在55 ℃時提取率比較高。

圖5 不同溫度提取液提取大豆球蛋白的SDS-PAGE 的電泳圖譜Fig.5 SDS-PAGE pattern of soybean GLObulin extracted by solution of different temperature

圖6 7S 伴大豆球蛋白和11S 球蛋白粗提物的SDS-PAGE 電泳圖譜Fig.6 SDS-PAGE pattern of extraction of 7-conglycinin GLObulin and 11S GLObulin

2.6 7S 伴大豆球蛋白和11S 球蛋白粗提物的SDS-PAGE

將伴大豆球蛋白和11S 球蛋白回收液與樣品緩沖液1∶1 混合，上樣電泳(電泳條件如1.2.3)，電泳結果見圖6。從圖6 可以看出，7S 伴大豆球蛋白和11S 球蛋白得到了較好的分離。

2.7 7S 伴大豆球蛋白和11S 球蛋白分子量的確定

根據(jù)(圖6)標準蛋白的相對分子質(zhì)量與遷移率呈線性關系，我們通過Excel2003 軟件做了以下曲線(圖7):

圖7 標準蛋白質(zhì)的分子量(Mr)與相對遷移率(Rf)的關系曲線Fig.7 Relationship between Rf and lgMr of stander protein

根據(jù)標準蛋白的相對分子質(zhì)量與遷移率的線性關系曲線得到:y=-0.909 3x+5.054 3(R2=0.99)。根據(jù)相對遷移率計算后得出7S 伴大豆球蛋白的三個亞基α’、α、β 的分子量分別是60 466 Da、55 029 Da、49 043 Da;11S 球蛋白的3 個亞基A3、A、B 的分子量分別為44 634 Da、39 779 Da 和17 952 Da。

3 結論與討論

綜合大豆球蛋白得率、蛋白含量、純度和亞基含量以及相互作用等分析結果，大豆球蛋白在55 ℃、0.05 mol/L、pH9.0 的Tris-HCl 溶液且料液比為1∶10 浸提2 h 能夠提取較多的球蛋白，并且7S 伴大豆球蛋白由3 個亞基組成，其分子量分別為60 466 Da，55 029 Da 和49 043 Da，11S 球蛋白也由3 個亞基組成，其分子量分別44 634 Da，39 779 Da 和17 952 Da。這與之前學者所得到的結果略有出入［9］，由于對7S 伴大豆球蛋白和11S 球蛋白的分離、提純是相對的，再加上測定方法和測試材料的差異性，使得7S 伴大豆球蛋白和11S 球蛋白組分各個亞基的相對分子質(zhì)量尚缺乏統(tǒng)一的結論，但仍然可以作為后續(xù)研究作參考。許多試驗研究發(fā)現(xiàn)大豆球蛋白溶解性的影響因素是大豆球蛋白與蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)與水之間的相互作用的平衡［8］。其中內(nèi)在因素包括疏水作用力［10］，氫鍵作用等［11］;外在因素包括pH［12］、鹽的種類［12］和離子強度［13］等。本試驗也發(fā)現(xiàn)，雖然本試驗采用pH 都為9.0 的PBS 溶液和Tris-HCl 溶液作為大豆球蛋白的提取液，雖然PBS 溶液對球蛋白大亞基的提取程度稍微高一點，這可能是PBS 溶液當中一定濃度離子增加了亞基的溶解度的原因，但是Tris-HCl 對大豆球蛋白的大小亞基的提取程度都比較高。

影響球蛋白溶解的一個重要的原因包括溶液的pH，本實驗觀察到pH 從7.0 升高到9.0 時，大豆球蛋白的溶解度不斷增加，當增加到9.0 時，溶解度不再增加，所以本實驗認為大豆球蛋白浸提液pH 為9.0的提取效果比較好。一些研究表明，大豆球蛋白浸提液Tris-HCl 的合適pH 為8.5［6］，原因可能是不同地區(qū)的大豆本身有一定的差別，但本實驗與其他的實驗結果相差不是很大，仍可以為今后的研究提供重要的參考依據(jù)。

本實驗按照3.1 及3.2 得到的實驗結果確定提取液為pH9.0 的Tris-HCl，再改變提取液的料液比。從圖3 可以看出，料液比為1∶18 和1∶20 提取率低，而料液比為1∶15、1∶12、1∶10 提取率高，并且1∶10的料液比大豆球蛋白的提取率最高。而且過高的料液比在實際生產(chǎn)和實驗室操作中會降低處理能力，綜上本試驗認為料液比為1∶10 提取效果最佳。

一些研究表明0.03～0.06 mol/L 的Tris-HCl 緩沖系統(tǒng)能夠提取到大量的球蛋白［6］，因為大豆球蛋白會因溶液的離子強度變化發(fā)生分子聚合解離作用，即大豆球蛋白具有締合—解離反應。在0.1 mol/L 離子強度和中性pH 值下，大豆球蛋白會聚合成其他蛋白;而在低離子濃度和弱堿性條件下，能解離成其他組分，即增加了溶解度［5-6］。本實驗結果也表明在Tris-HCl 的濃度為0.05 mol/L 時球蛋白大小亞基的提取率最高。當提取液體積分數(shù)繼續(xù)增加到0.1 mol/L 時，雖然球蛋白的小亞基提取率增加，但對球蛋白大亞基的溶解有一定的抑制作用，同時還增加了浸提液的成本。

研究表明，在大豆球蛋白的分離過程中，在溫度為80 ℃以下，得率會隨溫度上升皆呈上升趨勢［14］。但是，本試驗所得的結果是在25 ℃～55 ℃時，隨著溫度的升高，大豆球蛋白的得率也會不斷增加，在55 ℃時最高，所以認為在55 ℃時提取效果比較好。本試驗認為雖然隨著溫度的升高，大豆蛋白的溶解度會適當增加，但是溫度太高的話，會使得蛋白質(zhì)發(fā)生變性，這樣大豆蛋白的得率會降低。

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