雞肉粉替代秘魯魚粉對大口黑鱸生長性能、血清生化指標、腸道及肝臟組織結構的影響

馬 利 穆 苑 李 維 耿 旭 蔣 明 文 華 王國霞 李 勇*

(1.中糧飼料有限公司，北京 100020；2.中國水產科學研究院長江水產研究所，武漢 430223；3.廣東省農業(yè)科學院動物科學研究所，農業(yè)部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣州 510640)

魚粉具有平衡的氨基酸模式和適口性好等優(yōu)點，是水產飼料的首選蛋白質源，在水產養(yǎng)殖中被大量利用，特別是肉食性魚類飼料中魚粉占比一般在30%以上[1]。我國每年水產用魚粉消耗量在150萬t以上，然而近年來魚粉供應有限及價格高，制約了水產養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和海洋食品的健康增長[2]。因此，為水產動物特別是肉食性養(yǎng)殖對象尋找開發(fā)新的蛋白質資源是飼料發(fā)展的必然趨勢，也是保護海洋資源的必然選擇[3]。

雞肉粉是畜禽屠宰廠副產品經提煉油脂和粉碎后所得到的粉狀產品，其粗蛋白質和粗脂肪含量與魚粉相近，氨基酸平衡較好，已成為一種常規(guī)的魚粉替代蛋白質原料[4]。國內外已有研究表明，雞肉粉可適量替代金鯧魚(Trachinotusovatus)[4]、黃鱔(Monopterusalbus)[5]、海鱸(Lateolabraxjaponicas)[6]、烏鱧(Channastriata)[7]、駝背鱸(Cromileptesaltivelis)[8]、卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)[9]、凡納濱對蝦(Litopenarusvannamei)[10]、羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)[11]和大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[12]等飼料中的魚粉。

大口黑鱸(Micropterussalmoides)，又名加州鱸，為肉食性溫水性魚類，具有生長快、肉質鮮美、抗病力強等優(yōu)點。近年來，已經開發(fā)出大口黑鱸全程養(yǎng)殖投喂飼料的技術，使其養(yǎng)殖規(guī)模得到迅速擴大[13]。大口黑鱸的營養(yǎng)需求和飼料配制技術已經得到初步研究[14-16]，其對蛋白質需求較高(45.0%～51.6%)[17-18]，在商品飼料中的魚粉含量為40%～50%。因此，亟需開展該養(yǎng)殖品種的魚粉替代技術研究，以降低該養(yǎng)殖品種對魚粉資源的依賴。目前文獻資料顯示大口黑鱸飼料中南極磷蝦粉[19]、發(fā)酵豆粕[20]等可部分替代魚粉。鑒于雞肉粉在其他肉食性魚類飼料中良好的表現，我們推測大口黑鱸飼料中雞肉粉也可部分替代魚粉。因此，本試驗以實用飼料配方為基礎，研究雞肉粉(寵物級)替代秘魯魚粉對大口黑鱸生長性能、血清生化指標、腸道及肝臟組織結構的影響，為雞肉粉在大口黑鱸飼料中的應用提供理論依據和技術參數。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

本試驗以寵物級雞肉粉替代秘魯魚粉，試驗配方組成以秘魯魚粉、墨西哥魚粉、越南魚粉、寵物級雞肉粉、血球蛋白粉和豆粕為蛋白質源，面粉和木薯淀粉為糖源，魚油、豆油和大豆卵磷脂為脂肪源，按照表1配比配制5種試驗飼料，分別記作T1、T2、T3、T4和T5。T1含有秘魯魚粉30%和寵物級雞肉粉10%，T2～T5中的雞肉粉以7.5%(占比飼料)的梯度增加，秘魯魚粉和寵物級雞肉粉的干物質、粗蛋白質體外消化率分別為55.52%和59.38%、61.80%和63.96%，試驗飼料組成見表1，營養(yǎng)水平和氨基酸組成見表2。飼料制備前，將飼料原料粉碎后過80目篩，按照試驗設計配方混合、制粒直徑2.0 mm的顆粒飼料，在陰涼處風干，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗飼料組成(干物質基礎)

表2 試驗飼料營養(yǎng)水平和氨基酸組成(干物質基礎)

1.2 養(yǎng)殖管理

養(yǎng)殖試驗在廣東省農業(yè)科學院動物科學研究所水產研究室循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行，每個玻璃鋼桶水體有效容積300 L。試驗用大口黑鱸來自廣東省清遠市大口黑鱸繁殖場，運回后經檢疫消毒后，暫養(yǎng)于水泥池中，用T1～T5等質量混合飼料馴養(yǎng)2周后分組，挑選700尾體表健康、活力強的試驗魚，隨機分為5組，每組4個重復，每個重復35尾，初始體質量約為6.88 g。養(yǎng)殖期間每天表觀飽食投喂2次(08:00—08：30；17:00—17：30)。養(yǎng)殖期間自然光照，水溫為23.0～30.0 ℃，pH為7.6±0.3，溶解氧含量>5.5 mg/L，氨氮含量<0.2 mg/L，亞硝酸鹽含量<0.05 mg/L。養(yǎng)殖周期56 d。

1.3 樣品采集與指標測定

生長性能、形態(tài)學指標和腸道消化酶活性：養(yǎng)殖試驗開始時和結束后稱重每個養(yǎng)殖桶大口黑鱸總重，并記錄總尾數，用于計算增重率(WGR)、飼料系數(FCR)、成活率(SR)和特定生長率(SGR)。養(yǎng)殖試驗結束后，禁食24 h，從養(yǎng)殖桶中隨機選取6條魚，測定體長、體質量后，分離出內臟團、肝臟、腸道、腹腔脂肪并分別稱重，用于計算肥滿度(CF)、臟體比(VSI)、肝體比(HSI)、腸體比(II)和腹脂指數(IPR)，并分離出全腸用于消化酶活性指標測定，包括脂肪酶(LPS)、淀粉酶(AMS)和胰蛋白酶(TPS)，腸道用0.9%的生理鹽水清洗、剪碎，按照組織∶生理鹽水=1∶9(W/V)，冰浴勻漿后離心(4 ℃，5 000 r/min，20 min)，取上清液作為酶粗提液；TPS活性用試劑盒中專用的勻漿介質按試劑盒要求進行測定，LPS和AMS活性采用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定。

飼料和全魚營養(yǎng)成分：養(yǎng)殖試驗結束后，禁食24 h后從每個養(yǎng)殖桶中隨機選取3尾魚烘干粉碎，置于-20 ℃冰箱中保存，用于全魚營養(yǎng)成分分析。飼料和全魚水分含量采用105 ℃烘箱烘干至恒重的方法(GB/T 6435—2014)檢測，粗蛋白質含量采用凱氏定氮法(GB/T 6432—1994)檢測，粗脂肪含量采用石油乙醚抽提法(GB/T 6433—2006)檢測，粗灰分含量采用550 ℃高溫灼燒法(GB/T 6438—2007)檢測；原料、飼料中氨基酸(除色氨酸外)含量采用高速氨基酸自動分析儀(Model 835-50，日本日立公司)進行測定。

原料干物質胃仿生消化試驗：稱取1 g樣品，置于裝有透析袋的模擬消化器中，再往透析袋中加入20 mL模擬小腸液，將模擬消化器置于單胃動物仿生消化儀(SDS)單胃動物仿生消化系統(tǒng)中，仿生消化結束后，用注射器(約5 mL去離子水)將透析袋中的未消化殘渣無損失地轉移到已知絕干重的90 mm培養(yǎng)皿中，在65 ℃烘干至無水痕(約12 h)，再105 ℃烘干至恒重，留樣待測粗蛋白質含量。

血清生化指標：停食24 h后，每個養(yǎng)殖桶隨機取6尾魚，尾靜脈取血混合后4 ℃下4 000 r/min離心10 min制備血清樣品，-80 ℃冰箱中保存，用于血清生化和抗氧化能力指標分析，包括總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、膽固醇(cholesterol，CHOL)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterin，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterin，HDL-C)、尿素氮(urea nitrogen，UN)、球蛋白(globulin，GLO)、葡萄糖(glucose，GLU)含量及谷丙轉氨酶(glutamic pyruvic transaminase，ALT)、谷草轉氨酶(aspartate transaminase，AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase ，ALP)活性，采用全自動生化分析儀(日立7600，日本)進行測定；酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)活性和總抗氧化能力(total antioxidization capacity，T-AOC)采用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定。

腸道和肝臟組織切片：養(yǎng)殖試驗結束后，禁食24 h后從每個養(yǎng)殖桶中隨機選取3尾魚，分離出腸道和肝臟置于10%福爾馬林中固定，室溫保存，用于腸道和肝臟組織切片制作。固定好的腸道樣品嚴格按照武漢賽維爾生物科技有限公司病理試驗檢測SOP程序進行，修剪、脫水、包埋、切片、染色、封片，最后制成鏡檢合格的樣片，每張切片挑選40倍視野進行拍照，應用Image-Pro Plus 6.0軟件以右下角40倍標尺為標準，每張切片選取5根完整的絨毛，分別測量絨毛高度、絨毛寬度、肌層厚度、杯狀細胞數；固定好的肝臟樣品嚴格按照武漢賽維爾生物科技有限公司病理試驗檢測SOP程序進行，修剪、脫水、包埋、切片、染色、封片，最后制成鏡檢合格的樣片，使用CaseViewer2.2瀏覽數字切片，在不同倍數下詳細觀察組織結構，對切片中典型病理改變如炎癥、壞死、變性、增生以及纖維化等情況進行文字描述，并反映出片子之間的差異，使用成像顯微鏡拍攝或使用CaseViewer2.2截取對應不同的典型病變部位圖，并在Word文檔中用箭頭標識說明。

1.4 計算公式

干物質消化率(%)=[(Wt-Wdt)/Wt]×100；
粗蛋白質消化率(%)=[(Wp-Wdp)/Wp]×100；
成活率(%)=(Nt/N0)×100；
增重率(%)=100×(Wt/Nt-W0/N0)/(W0/N0)；
特定生長率(%/d)=[(lnWt/Nt-lnW0/N0)/t]×100；
飼料系數=Wt/(Wt-W0)；
肥滿度(g/cm3)=(W/L3)×100；
臟體比(%)=(Wv/W)×100；
肝體比(%)=(Wh/W)×100；
腸體比(%)=(Wi/W)×100；
腹脂指數(%)=(Waf/W)×100；
粗蛋白質沉積率(%)=[(Wt×Wtp-
W0×W0p)/(Wf×Wp)]×100；
粗脂肪沉積率(%)=[(Wt×Wtl-
W0×W0l)/(Wf×Wl)]×100；
粗灰分沉積率(%)=[(Wt×Wta-
W0×W0a)/(Wf×Wa)]×100。

式中：Wt為飼料樣品重(g)；Wdt為消化后濾渣重(g)；Wdp為消化后濾渣粗蛋白質含量(%)；Nt為終末魚尾數；N0為初始魚尾數；t為試驗天數(d)；Wh為魚肝臟重(g)；W為魚體質量(g)；Wv為魚內臟重(g)；L為魚體長(cm)；Waf為魚腹部脂肪重(g)；Wi為魚腸道重(g)；Wt為終末魚體質量(g)；W0為初始魚體質量(g)；Wtp為終末魚體的粗蛋白質含量(%)；W0p為初始魚體的粗蛋白質含量(%)；Wf為攝入飼料量(g)；Wp為飼料中的粗蛋白質含量(%)；Wtl為終末魚體的粗脂肪含量(%)；W0l為初始魚體的粗脂肪含量(%)；Wl為飼料中的粗脂肪含量(%)；Wta為終末魚體的粗灰分含量(%)；W0a為初始魚體的粗灰分含量(%)；Wa為飼料中的粗灰分含量(%)。

1.5 數據統(tǒng)計分析

試驗數據用“平均值士標準誤”表示，采用SPSS 18.0軟件對數據進行統(tǒng)計學分析，先對數據作單因素方差分析(one-way ANOVA)，若有顯著差異，再用Duncan氏法進行多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 大口黑鱸生長性能、飼料系數和形態(tài)學指標

由表3可知，試驗組(T1～T5組)間的終末體量、成活率、增重率、特定生長率和飼料系數差異不顯著(P>0.05)，各組間肥滿度、臟體比、肝體比和腸體比沒有顯著性差異(P>0.05)，T4組腹指指數顯著高于T3和T5組(P<0.05)。

表3 寵物級雞肉粉替代秘魯魚粉對大口黑鱸生長性能、飼料系數和形態(tài)學指標的影響

2.2 大口黑鱸魚體成分和營養(yǎng)素沉積率

由表4可知，雞肉粉替代秘魯魚粉對大口黑鱸全魚的水分、粗脂肪和粗灰分含量均沒有顯著影響(P>0.05)，對粗蛋白質沉積率和粗脂肪沉積率也沒有顯著影響(P>0.05)，T4組的粗灰分沉積率顯著高于T1和T2組(P<0.05)。

表4 寵物級雞肉粉替代秘魯魚粉對大口黑鱸體成分和營養(yǎng)素沉積率的影響(濕物質基礎)

2.3 大口黑鱸血清生化指標和抗氧化能力

由表5可知，雞肉粉替代魚粉對大口黑鱸血清總蛋白、白蛋白、球蛋白、膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高低密度蛋白膽固醇、尿素氮、葡萄糖含量及谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、酸性磷酸酶活性和總抗氧化能力均無顯著影響(P>0.05)。

表5 寵物級雞肉粉替代秘魯魚粉對大口黑鱸血清生化指標和抗氧化能力的影響

2.4 大口黑鱸腸道消化酶活性

由表6可知，各組間大口黑鱸腸道的脂肪酶和胰蛋白酶活性均無顯著差異(P>0.05)，T4和T5組腸道的淀粉酶活性顯著低于T1組(P<0.05)。

表6 寵物級雞肉粉替代秘魯魚粉對大口黑鱸腸道消化酶活性的影響

2.5 大口黑鱸腸道組織結構

由表7可知，各組間大口黑鱸腸道絨毛長度、肌層厚度和杯狀細胞數沒有顯著差異(P>0.05)，T5組腸道絨毛寬度顯著高于T2和T3組(P<0.05)。

表7 寵物級雞肉粉替代秘魯魚粉對大口黑鱸腸道組織結構的影響

2.6 大口黑鱸肝臟組織結構

如圖1所示，各組肝臟組織未見壞死，T1組肝細胞體積正常，細胞膜較圓，細胞核大而圓，且細胞間界線明顯，T2、T3和T4組的肝細胞輪廓都明顯，細胞核居中，T5組肝細胞輪廓界限不清，細胞核偏向細胞一側較多。

肝細胞空泡變性，如黑色箭頭所示；細胞核偏向細胞一側，如黃色箭頭所示；細胞界限不清，如藍色箭頭所示。

3 討 論

3.1 寵物級雞肉粉替代秘魯魚粉對大口黑鱸生長性能、飼料利用和形態(tài)學指標的影響

本試驗結果表明，隨著寵物級雞肉粉含量從10%增加到40%，秘魯魚粉含量從30%降低到0，對大口黑鱸的成活率、增重率、特定生長率、飼料系數、臟體比、肝體比、腸體比和肥滿度沒有顯著影響。本試驗的增重率均達到792.69%以上，特定生長率達到4.29或以上，這一結果與類似的大口黑鱸養(yǎng)殖試驗結果[14-20]相比，本試驗魚生長較好。這說明本試驗中的試驗魚均處于較好的生長狀態(tài)，在本試驗條件下，40%的寵物級雞肉粉對大口黑鱸生長無明顯負面影響。這與易新文等[21]對卵形鯧鲹的研究結果相似，試驗飼料中進口雞肉粉含量從6%增加到18%，魚粉含量從34%降低到22%，對卵形鯧鲹的生長性能未造成顯著影響。Zhu等[22]在軍曹魚(Rachycentroncanadum)上的研究發(fā)現，寵物級雞肉粉替代30.75%的魚粉蛋白質而不影響軍曹魚的生長性能。曹曉莉等[5]在黃鱔上的研究發(fā)現寵物級雞肉粉替代魚粉比例不超過45%時，對黃鱔的生長性能無負面影響。

Shapawi等[8]在駝背鱸中的研究發(fā)現，飼料級雞肉粉54.2%替代75.0%魚粉蛋白質對生長性能和飼料利用沒有顯著影響，而寵物級雞肉粉74.0%能替代100.0%的魚粉蛋白質。但是李宗升等[12]在研究雞肉粉替代魚粉對大菱鲆生長的影響中發(fā)現，隨著雞肉粉含量從20%增加到80%，魚粉含量從80%降低到20%時，對大菱鲆的生長性能和飼料利用率有顯著影響。以上替代結果的不同可能是由于雞肉粉的品質等級的不同，會對試驗魚消化吸收造成較大影響，從而導致替代比例的差異；另外試驗魚的種間差異、基礎飼料組成差異，也是導致替代比例不同的可能因素。本試驗條件下，大口黑鱸總的動物性蛋白質含量相近，以生長性能為評價指標，大口黑鱸飼料中寵物級雞肉粉可替代部分或者全部秘魯魚粉。

3.2 寵物級雞肉粉替代秘魯魚粉對大口黑鱸體成分和營養(yǎng)素沉積的影響

本研究發(fā)現，隨著寵物級雞肉粉替代比例的增加，對大口黑鱸的全魚體成分沒有顯著變化，這與在海鱸[6]、烏鱧[7]和卵形鯧鲹[9]上的研究結果相似。曹曉莉等[5]報道寵物級雞肉粉替代魚粉對黃鱔體粗脂肪含量有顯著影響，對水分、粗蛋白質和粗灰分含量沒有顯著影響；而易魁等[23]的研究發(fā)現，雞肉粉替代魚粉后使凡納濱對蝦體粗脂肪含量顯著降低，對水分、粗蛋白質和粗灰分含量沒有顯著影響。這些差異可能與試驗動物種類不同有關。

本試驗中隨著雞肉粉替代比例的增加，大口黑鱸魚體粗蛋白質沉積率和粗脂肪沉積率逐漸減少，而T4組粗灰分沉積率最高，為42.64%，飼料中粗灰分含量卻是最低值，為10.31%，這可能是由于大口黑鱸沉積了飼料中的粗灰分，從而抑制大口黑鱸對蛋白質和脂肪的沉積所致。

3.3 寵物級雞肉粉替代秘魯魚粉對大口黑鱸血清生化指標和抗氧化能力的影響

魚類血液生化和抗氧化能力指標是反映魚類生理機能及代謝狀況的重要指標，也是衡量魚類健康標準的指標[24]。本研究發(fā)現，寵物級雞肉粉替代秘魯魚粉對大口黑鱸血清生化指標和總抗氧化能力均無顯著影響，說明替代秘魯魚粉后大口黑鱸的生理和代謝狀況沒有受到顯著影響。但是與其他學者的研究結果不同，雞肉粉替代魚粉后對金鯧魚[4]、黃鱔[5]、卵形鯧鲹[9]的血清生化指標產生了顯著影響，說明不同水產動物對攝食不同含量的雞肉粉飼料后，抗應激能力反映不同，養(yǎng)殖品種和基礎飼料配方的不同可能是引起這種差異的主要因素。

3.4 寵物級雞肉粉替代秘魯魚粉對大口黑鱸腸道消化酶活性的影響

本研究發(fā)現，雞肉粉替代秘魯魚粉對大口黑鱸腸道脂肪酶和胰蛋白酶活性均無顯著影響，但是對淀粉酶活性產生了顯著影響，這可能與雞肉粉中的角蛋白和纖維蛋白難以消化有關；而易新文等[21]研究結果與此不同，雞肉粉替代魚粉對卵形鯧鲹的前腸、中腸和后腸的淀粉酶活性都沒有顯著影響，這與黃文慶等[25]對草魚中腸淀粉酶活性的結果類似。這與魚類的不同食性、生長在不同鹽度的環(huán)境有關。

3.5 寵物級雞肉粉替代秘魯魚粉對大口黑鱸肝臟、腸道組織結構的影響

蘇木精-伊紅染色技術是觀察肝細胞形狀、細胞核的移動以及細胞膜完整性的方法，還需要根據病變魚數量多少來判斷整體魚群魚體肝臟結構是否健康[26]。本試驗發(fā)現雞肉粉全部替代秘魯魚粉后肝細胞形狀發(fā)生變化，細胞核偏向一側，細胞界限不清，說明全部替代秘魯魚粉對大口黑鱸肝臟結構有一定程度的影響。

本試驗發(fā)現雞肉粉全部替代秘魯魚粉T5組的腸道絨毛長度最短和絨毛寬度最寬，說明腸道絨毛排列疏而短，這2個檢測指標低于歐紅霞[27]對大口黑鱸投喂冰鮮魚組所測值，植物蛋白質源對大口黑鱸腸道健康研究有報道[28]，但是關于雞肉粉替代魚粉對水產動物腸道結構影響的研究較少報道。

4 結 論

在本試驗條件下，飼料中可以添加32.5%或以下的雞肉粉對大口黑鱸生長性能、血清生化指標沒有不利影響；添加40.0%的雞肉粉對大口黑鱸的肝臟和腸道有負面影響。