海南三亞鹿回頭蟲黃藻(Effrenium voratum)的形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究*

龍超, 羅肇河, 韋章良, 楊芳芳, 李茹, 龍麗娟

1. 中國(guó)科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所), 廣東 廣州 510301;

2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049;

3. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室(廣州), 廣東 廣州 511458;

4. 自然資源部第三海洋研究所, 福建 廈門 361005;

5. 海南省熱帶海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(三亞中科海洋研究院), 海南 三亞 572024

珊瑚白化是一個(gè)全球性的生態(tài)環(huán)境問題, 近年來(lái)受到越來(lái)越多的關(guān)注(Berkelmans et al, 2006),造成這一問題的關(guān)鍵因素可能與珊瑚共生的蟲黃藻密切相關(guān)。這種內(nèi)共生關(guān)系是珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的一個(gè)重要特征, 珊瑚、?？?、硨磲貝、海綿等珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)重要功能生物均與蟲黃藻共生互惠(Jones et al, 2008; LaJeunesse et al, 2009, 2010;Fisher et al, 2012)。蟲黃藻可通過(guò)自身的光合作用,吸收海洋無(wú)脊椎動(dòng)物代謝產(chǎn)生的二氧化碳、磷酸鹽、硝酸鹽等, 進(jìn)而轉(zhuǎn)化為無(wú)脊椎動(dòng)物所需要的營(yíng)養(yǎng), 同時(shí)還能促進(jìn)部分宿主鈣質(zhì)骨骼的生成(Furla et al, 1998)。然而, 這種關(guān)鍵的互利共生關(guān)系對(duì)環(huán)境壓力非常敏感, 一旦關(guān)系破裂, 宿主將失去蟲黃藻, 并逐漸白化(Glynn, 1993), 甚至死亡。盡管蟲黃藻對(duì)珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的生態(tài)意義重大, 但有關(guān)其分類信息卻鮮有報(bào)道, 極大地限制了人們對(duì)珊瑚-蟲黃藻共生關(guān)系的基本理解。因此, 明確蟲黃藻種類, 將有利于判斷其在海洋無(wú)脊椎動(dòng)物應(yīng)對(duì)全球氣候變化過(guò)程中的作用, 可為保護(hù)和恢復(fù)珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)提供科學(xué)依據(jù)。

蟲黃藻是一個(gè)非分類學(xué)意義上的名稱, 過(guò)去泛指任何呈黃褐色的內(nèi)共生藻, 包括甲藻、硅藻、隱藻、金藻、紅藻和其他鞭毛藻類, 甲藻是其中最常見的類群(Trench et al, 1987; Rowan, 1998), 現(xiàn)特指與海洋無(wú)脊椎動(dòng)物共生的類似于裸甲藻的一類甲藻。共生藻科蟲黃藻是最廣泛存在的一類內(nèi)共生藻,部分藻類具有營(yíng)自由生活、附生等多種生活方式,宿主包括刺胞動(dòng)物、有孔蟲、放射蟲、纖毛蟲、軟體動(dòng)物和海綿等(Baker, 2003)。起初, 共生藻科僅包含一屬, 即共生藻屬(Symbiodinium), 該屬在系統(tǒng)發(fā)育上包含9大分支, 每個(gè)大分支又細(xì)分為不同的小支系(Finney et al, 2010; LaJeunesse et al, 2011)。研究者將這9大分支定義為9個(gè)系群(Clades A-I)(Pochon et al, 2010)。由于共生藻屬在系統(tǒng)發(fā)育上包含豐富的基因多樣性, 且各系群間的遺傳差異接近甚至大于其他甲藻中的屬、科、目間的遺傳差異, 已超出了屬所能定義的范疇。因此, LaJeunesse等(2018)結(jié)合分子生物學(xué)、形態(tài)學(xué)以及宿主專一性等數(shù)據(jù), 提出了將共生藻屬提升為共生藻科的建議, 將原來(lái)的9個(gè)系群重新細(xì)分為15個(gè)不同的譜系(lineages), 將進(jìn)化上不同的譜系定義為屬, 并對(duì)其中7個(gè)屬進(jìn)行了正式的描述。

Effrenium屬(原E系群)蟲黃藻具有裸甲藻的形態(tài), 且在培養(yǎng)過(guò)程中有很高比例的細(xì)胞處于運(yùn)動(dòng)狀態(tài), 以前常被研究者誤認(rèn)為是裸甲藻(Shao et al,2004; Fan et al, 2007)。目前, 研究者已從太平洋溫帶地區(qū)的不同海域分離培養(yǎng)得到了大量Effrenium屬蟲黃藻, 其中大多數(shù)分離自海水中或大型藻類表面(Gou et al, 2003; Shao et al, 2004; Santos, 2004;Jeong et al, 2012; Yamashita et al, 2013), 少數(shù)分離自美國(guó)南加州的?？?Anthopleura elegantissima)(LaJeunesse et al, 2000)和韓國(guó)濟(jì)州島的珊瑚(Alveopora japonica)(Jeong et al, 2012)。然而, 目前Effrenium屬蟲黃藻中僅有Effrenium voratum一個(gè)正式命名種, 該種作為模式種推進(jìn)了Effrenium屬的建立(LaJeunesse et al, 2018)。

共生藻科蟲黃藻在系統(tǒng)發(fā)育上包含了數(shù)百個(gè)分支, 而正式命名的只有24種, 其中僅10種具有正式的形態(tài)學(xué)描述(LaJeunesse et al, 2018)。造成這一現(xiàn)狀的主要原因在于蟲黃藻難以培養(yǎng), 且掃描電鏡(Scanning electron microscopy, SEM)樣品制備困難,因此部分蟲黃藻的鑒定僅能依靠遺傳信息, 而缺少形態(tài)特征描述(Parkinson et al, 2015; Wham et al,2017)。Jeong等(2014)通過(guò)行為學(xué)、形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)方法, 對(duì)采集于西北、西南和東北溫帶太平洋海域的Effrenium屬蟲黃藻株進(jìn)行了分析, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同區(qū)域的Effrenium屬蟲黃藻之間的差異甚微, 所有證據(jù)均表明Effrenium屬蟲黃藻藻株實(shí)為同一物種, 并將其命名為E. voratum。

我國(guó)研究人員曾在膠州灣(Gou et al, 2003; 朱霞 等, 2011)和珠江口(Shao et al, 2004)的海水樣品以及西沙海域的鱗硨磲(張躍環(huán) 等, 2018)中發(fā)現(xiàn)了Effrenium屬蟲黃藻, 趙振魯?shù)?2019)利用E.voratum開展了相關(guān)的生理學(xué)研究, 但均未進(jìn)行系統(tǒng)的分類和全面的形態(tài)學(xué)及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)描述。此外,國(guó)外研究表明,Effrenium屬蟲黃藻僅分布于太平洋的溫帶水域以及大西洋的地中海(Jeong et al, 2014),而本文中的兩個(gè)藻株分別分離自南海三亞鹿回頭海域的叢生盔形珊瑚(Galaxea fascicularis)和柔枝鹿角珊瑚(Acropora tenuis), 屬太平洋熱帶株系, 與當(dāng)前國(guó)外研究者對(duì)Effrenium屬蟲黃藻地理分布的說(shuō)法不一致。因此, 本文擬通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法, 對(duì)兩株熱帶株系Effrenium屬蟲黃藻進(jìn)行分類鑒定, 并對(duì)比世界其他溫帶海域藻株, 以明確不同地理株系Effrenium屬蟲黃藻的形態(tài)和遺傳差異, 以期為蟲黃藻的分類和珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)等共性問題提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種分離與培養(yǎng)

于2017年8月在海南省三亞鹿回頭海域(109°28′26.013″E, 18°12′43.556″N ), 水深1～2m處(大潮低潮位), 采集叢生盔形珊瑚和柔枝鹿角珊瑚樣品。珊瑚樣品用過(guò)濾滅菌海水沖洗后, 刮取珊瑚骨骼表面組織, 震蕩離心去上清, 獲得蟲黃藻沉淀。用毛細(xì)管分離法挑取單個(gè)蟲黃藻細(xì)胞至96孔板中,建立蟲黃藻純系。蟲黃藻在f/2培養(yǎng)液、鹽度為32‰、溫度為25℃、光照強(qiáng)度為40μmol·m-2·s-1、明暗周期為14 h: 10 h的環(huán)境條件下培養(yǎng)。叢生盔形珊瑚和柔枝鹿角珊瑚中分離出的藻株編號(hào)分別為SYSC-14-11和SYSC-2-8。

1.2 形態(tài)學(xué)觀察

1.2.1 光學(xué)顯微鏡觀察

取1mL指數(shù)生長(zhǎng)期藻株SYSC-14-11細(xì)胞培養(yǎng)液, 置于光學(xué)顯微鏡(Nikon, T-100, Japan)下觀察并拍照, 使用Image-Pro Plus 6.0圖像測(cè)量細(xì)胞的大小。

1.2.2 掃描電子顯微鏡觀察

取10mL指數(shù)生長(zhǎng)期藻株SYSC-14-11細(xì)胞培養(yǎng)液, 用孔徑為5μm的濾膜富集, 加入2%的鋨酸, 終濃度為0.3%～0.5%, 4℃過(guò)夜, 棄上清; ddH2O清洗兩次, 重復(fù)此步驟三遍以去除鋨酸。按乙醇10%、30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%(重復(fù)2次)的比例各浸泡10min進(jìn)行脫水處理后, 進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥。干燥后小心地將藻粉撒到金屬平臺(tái)進(jìn)行噴金,置于掃描電鏡(Zeiss/LEO, Oberkochen, Germany)下觀察。

1.3 DNA提取和PCR擴(kuò)增

離心收集指數(shù)生長(zhǎng)期蟲黃藻細(xì)胞培養(yǎng)液, 采用DNA提取試劑盒(OMEGA HP Plant DNA Kit), 按照使用說(shuō)明對(duì)蟲黃藻DNA進(jìn)行提取。核糖體大亞基(LSU)基因片段利用引物28Sforward (5′-CCCG CTGAATTTAAGCATATAAGTAAGCGG-3′)和28Sreverse (5′-GTT AGA CTC CTTGGTCCGTGTT TCAAGA-3′)進(jìn)行擴(kuò)增, 反應(yīng)程序?yàn)? 90℃預(yù)變性5min, 94℃變性1min, 60℃退火1min, 72℃延伸1min,30個(gè)循環(huán), 72℃延伸5min(Zardoya et al, 1995)。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS2)基因片段利用引物ITS intfor2(5′-GAATTGCAGAACTCCGTG-3′)和ITS2 CLAMP(5′-GGGATCCATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′)進(jìn)行擴(kuò)增, 反應(yīng)程序?yàn)? 94℃預(yù)變性5min, 94℃變性30s, 55℃退火1min, 72℃延伸1min, 30個(gè)循環(huán), 72℃延伸5min (Xiang et al, 2013)。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色檢測(cè), 切膠純化后送至美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

將測(cè)得的序列用Blast進(jìn)行同源搜索, 獲得同源性較高的已知物種序列。應(yīng)用Mega 7.0基于Kimura雙參數(shù)法計(jì)算遺傳距離, 采用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)和最大似然法(Maximum Likelihood, ML)建立系統(tǒng)發(fā)育樹。以自舉檢驗(yàn)(Bootstrap test)估計(jì)系統(tǒng)樹分支節(jié)點(diǎn)的置信度, 檢測(cè)1000次(Kimura, 1980)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲黃藻的形態(tài)特征

藻株SYSC-14-11為單細(xì)胞藻(圖1), 不動(dòng)細(xì)胞為球形, 運(yùn)動(dòng)細(xì)胞呈葫蘆狀, 體長(zhǎng)10.4～15.6μm(13.5±1.1μm,n=97), 寬 8.5～12.8μm(10.8±0.8μm,n=97)。細(xì)胞上殼略大于下殼, 兩者之間由橫溝相連, 細(xì)胞整體呈不對(duì)稱結(jié)構(gòu)。葉綠體呈棕黃色, 排列在細(xì)胞內(nèi)壁邊緣。每個(gè)細(xì)胞中央都有一個(gè)明顯的球狀蛋白核(圖1b、1c), 細(xì)胞核位于上殼、下殼或兩者之間的赤道上。對(duì)數(shù)期的蟲黃藻大多數(shù)處于運(yùn)動(dòng)狀態(tài), 以上殼頂點(diǎn)為中心, 在固定位置進(jìn)行高速旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng), 偶爾游動(dòng)一小段距離后又開始旋轉(zhuǎn)。

藻株SYSC-14-11在白天光線充足條件下可在水體中均勻分布, 具有趨光性; 晚間部分細(xì)胞進(jìn)入不動(dòng)期, 呈球狀。偶爾可見二分裂現(xiàn)象(圖1a)。

圖1 藻株SYSC-14-11的光鏡照片a. 不動(dòng)的球狀細(xì)胞和運(yùn)動(dòng)的葫蘆狀細(xì)胞, 可見二分裂現(xiàn)象; b. 細(xì)胞背面觀和側(cè)面觀, 可見蛋白核及細(xì)胞核分布; c. 細(xì)胞腹面觀, 可見蛋白核及細(xì)胞核分布。N: 細(xì)胞核; PY: 球狀蛋白核Fig.1 Light microscope (LM) images of strains SYSC-14-11. a) Immobile globular cells and moving gourd-like cells,including binary dividing cells; b) dorsal view and side view, with pyrenoid and nucleus; and c) ventral view, with pyrenoid and nucleus. N: nucleus; PY: pyrenoid

藻株SYSC-14-11的甲板方程為: x, EAV, 4-5′,5a, 8′′, 9s, 17-20c, 6′′′, 2′′′′。細(xì)胞上殼腹側(cè)有一個(gè)單線長(zhǎng)甲板型頂溝復(fù)合體(Elongate Apical Vesicle,EAV), 復(fù)合體長(zhǎng)約2.2μm, 寬約0.2μm, 其上約有11個(gè)呈線型排列的瘤狀凸起(圖2a、2b)。從甲板排列來(lái)看, 頂溝復(fù)合體與細(xì)胞腹側(cè)的x板以及第二至第五頂板(2′-5′)相連。頂板一般有5塊, 第一頂板(1′)為七邊形, 第二頂板(2′)和第五頂板(5′)為四邊形,第三頂板(3′)和第四頂板(4′)為五邊形(圖2a)。第一頂板(1′)相對(duì)較大, 殼板間連接相對(duì)復(fù)雜, 與小連接板(x)、第二頂板(2′)、第一間插板(1a)、第五間插板(5a)、第一溝前板(1′′)、第八溝前板(8′′)以及2個(gè)縱溝板(S)相連(圖2a—2d)。此外, 樣品中出現(xiàn)了具有4塊頂板的細(xì)胞(圖2b)。間插板連接頂板和橫溝前板,共有5塊。其中, 第一間插板(1a)、第二間插板(2a)、第三間插板(3a)為六邊形, 第四間插板(4a)為七邊形,第五間插板(5a)為五邊形, 第四間插板(4a)和第五間插板(5a)相對(duì)較大(圖2a—2d)。橫溝前板共8塊, 其中第一橫溝前板(1′′)、第四橫溝前板(4′′)、第六橫溝前板(6′′)和第八橫溝前板(8′′)為四邊形, 第二橫溝前板(2′′)、第三橫溝前板(3′′)、第五橫溝前板(5′′)和第七橫溝前板(7′′)為五邊形(圖2a—2d)。橫溝圍繞細(xì)胞一周, 由2排五邊形的板塊交錯(cuò)連接而成, 數(shù)量尚不確定(圖2c、2d)。橫溝后板有6塊, 除第三橫溝后板(3′′′)為五邊形外, 其他均為四邊形。底板兩塊,均為六邊形, 其中第一底板(1′′′′)與第一至第三橫溝后板(1′′′～3′′′)、第二底板(2′′′′)、溝后板(S.p.)和縱溝板(S)相連, 第二底板(2′′′′)與第三至第六橫溝后板(3′′′～6′′′)、第一底板(1′′′′)、溝后板(S.p.)相連(圖2e、2f)。

圖2 藻株SYSC-14-11的掃描電鏡照片a. 頂面觀, 可見單線長(zhǎng)甲板型頂溝復(fù)合體(Elongate Apical Vesicle, EAV)和5塊頂板, 可見連接板(x); b. 頂面觀, 可見4塊頂板; c. 頂側(cè)腹面觀, 可見橫溝與橫溝板(C)、縱溝與縱溝板(S); d. 背面觀, 可見上錐部、橫溝和下錐部; e. 底側(cè)腹面觀, 可見橫溝和縱溝; f. 底面觀, 可見下錐部、縱溝板(S)和溝后板(S.p.)Fig.2 Scanning electron microscope (SEM) images of strains SYSC-14-11. a) Apical view showing Elongate Apical Vesicle,five apical plates and x plate; b) apical view showing four apical plates; c) apical-ventral view showing cingulum, cingulum plates, sulcus and sulcus plates; d) dorsal view showing episome, cingulum and hyposome; e) antapical-ventral view showing cingulum and sulcus; and f) antapical view showing hyposome, sulcus plates and posterior sulcal plate

2.2 蟲黃藻的系統(tǒng)發(fā)育分析

將LSU和ITS2序列進(jìn)行Blast同源檢索, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 與藻株SYSC-2-8和SYSC-14-11序列相似性最高的已正式命名的藻株為Effrenium voratum, 其他相似性更高的藻株序列多數(shù)來(lái)源于中國(guó)海域, 但均未正式命名, 多為環(huán)境樣本。

基于對(duì)藻株SYSC-14-11和SYSC-2-8的LSU和ITS2序列進(jìn)行Blast同源檢索, 獲得了A、B、C、D、E共5個(gè)系群的DNA序列, 其中包含已發(fā)表的26個(gè)LSU序列和27個(gè)ITS2序列。利用Mega建立系統(tǒng)發(fā)育樹, 選取Polarella glacialis作為外群參考(圖3、圖4)。LSU和ITS2的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果均顯示, 系群A～E形成了5個(gè)大的分支, 其中藻株SYSC-14-11和SYSC-2-8屬于Effrenium屬?；贚SU的系統(tǒng)發(fā)育樹中, 本研究的兩個(gè)藻株與世界其他地理區(qū)系的Effrenium屬藻株聚成一支, 支持度為100%, 堿基組成差異為1～2個(gè), 相似度高達(dá)99.33%～99.66%?；贗TS2的系統(tǒng)發(fā)育樹中, 本研究的兩個(gè)藻株與世界其他地理區(qū)系的Effrenium屬藻株聚成一支, 支持度為100%。藻株SYSC-14-11和SYSC-2-8與珠江口藻株zhao01及中國(guó)膠州灣藻株G15序列堿基組成無(wú)差異, 與中國(guó)膠州灣藻株ZX11、新西蘭藻株CCMP421、美國(guó)藻株rt-383、日本藻株TSP-C2-Sy及韓國(guó)已命名藻株E. voratum序列堿基差異為2～3個(gè), 相似度達(dá)98.28%～100%。

圖3 基于核糖體大亞基(LSU)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹采用最大似然法(ML)和鄰接法(NJ)建立, 左側(cè)node value值為ML, 右側(cè)node value值為NJ。P. beii為外類群, 可信度檢測(cè)1000次Fig.3 Maximum likelihood and neighbor-Joining phylogenetic tree based on LSU sequences with P. beii as outgroup.Bootstrap test (1000 replicates) are shown next to the branches as ML/NJ. For ML, mode/method: Kimura 2-parameter model; Rate among Sites: Gamma distributed with Invariant sites (G + I); No of Discrete Gamma Categories: 5; Gaps/Missing Data Treatment: Partial deletion; Site coverage cutoff: 95%; Select codon positions: 1st + 2nd + 3rd + Noncoding sites; ML Heuristic Method:nearest-neighbor-interchange (NNI). For NJ, mode/method: Kimura 2-parameter model; Substitutions to Include: d Transition +Transversions; Rate among Sites: Gamma Distributed (G); Gamma Parameter: 5, Pattern among Lineages: Same (Homogeneous);Gaps/Missing Data Treatment: Partial deletion; Site coverage cutoff: 95%; Select codon positions: 1st + 2nd + 3rd + Noncoding sites

圖4 基于核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS2)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹采用最大似然法(ML)和鄰接法(NJ)建立, 左側(cè)node value值為ML, 右側(cè)node value值為NJ。P. beii為外類群, 可信度檢測(cè)1000次Fig.4 Maximum likelihood and neighbor-Joining phylogenetic tree based on ITS2 region with P. beii as outgroup. Bootstrap test (1000 replicates) are shown next to the branches as ML/NJ. For ML, mode/method: Kimura 2-parameter model; Rate among Sites: Gamma distributed with Invariant sites (G + I); No of Discrete Gamma Categories: 5; Gaps/Missing Data Treatment: Partial deletion; Site coverage cutoff: 95%; Select codon positions: 1st + 2nd + 3rd + Noncoding sites; ML Heuristic Method: nearest-neighbor-interchange (NNI). For NJ, mode/method: Kimura 2-parameter model; Substitutions to Include: d Transition + Transversions; Rate among Sites: Gamma Distributed (G); Gamma Parameter: 5; Pattern among Lineages: Same (Homogeneous); Gaps/Missing Data Treatment: Partial deletion; Site coverage cutoff: 95%; Select codon positions: 1st + 2nd + 3rd + Noncoding sites

3 討論

當(dāng)前已報(bào)道的可培養(yǎng)共生藻科蟲黃藻在形態(tài)特征上極其相似, 通過(guò)光學(xué)顯微鏡難以辨識(shí)其形態(tài)差異, 但不同系群蟲黃藻的大小存在一定的差異。如Effrenium屬中的E. voratum細(xì)胞個(gè)體明顯大于其他系群蟲黃藻, 藻株SvFL1和CCMP421細(xì)胞的平均長(zhǎng)度分別為13.1μm和12.8μm(Jeong et al, 2014), 而其他系群蟲黃藻細(xì)胞的平均長(zhǎng)度多在10μm以內(nèi)(LaJeunesse et al, 2018), 最小的Breviolumendomadracis細(xì)胞長(zhǎng)度僅為6.1～7.2μm(Parkinson et al, 2015)。本研究中藻株SYSC-14-11的細(xì)胞個(gè)體大小范圍與E. voratum相當(dāng), 表明藻株SYSC-14-11是E. voratum的可能性較大。在基因證據(jù)出現(xiàn)以前, 研究者主要依靠形態(tài)學(xué)對(duì)物種進(jìn)行分類描述, 其中甲板排列是具甲甲藻最主要的分類手段(Fensome et al,1993)。目前, 研究者采用Kofioidian系統(tǒng)甲板方程對(duì)共生藻科中的10種蟲黃藻進(jìn)行了形態(tài)描述。從甲板排列來(lái)看, 藻株SYSC-14-11的甲板排列方式與E. voratum基本一致, 其典型的甲板方程均為x,EAV, 5′, 5a, 8′′, 9s, 17-20c, 6′′′, 2′′′′。但部分板塊存在變化, 如藻株SYSC-14-11的絕大多數(shù)藻細(xì)胞具有5塊頂板, 極少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)了4塊頂板。板塊變化在甲藻分類中十分常見, 在人工培養(yǎng)條件下,E.voratum(CCMP 421和SvFL 1)細(xì)胞的頂板、橫溝后板和底板在數(shù)量上均出現(xiàn)了不同程度的變化(Jeong et al, 2014)。共生藻科蟲黃藻甲板的數(shù)量、形態(tài)、排列方式非常相似, 使得依賴形態(tài)學(xué)方法難以區(qū)分種間差異, 同時(shí)在不同營(yíng)養(yǎng)和光照培養(yǎng)條件下, 同種蟲黃藻的表型超微結(jié)構(gòu)也存在差異(Muller-Parker et al, 1996)。因此, 基于大多數(shù)蟲黃藻難以培養(yǎng)的前提下, 利用比較形態(tài)學(xué)方法對(duì)未知蟲黃藻進(jìn)行正式的物種描述是有限的。

蟲黃藻基因組包含著許多可變的序列, 但通常只有1個(gè)或2個(gè)基因通過(guò)協(xié)同進(jìn)化的方式在數(shù)量上占據(jù)優(yōu)勢(shì)(Dover, 1982), 這些基因組內(nèi)豐富的序列變異已成為蟲黃藻種類鑒定的重要手段(Sampayo et al, 2009)。本研究中藻株SYSC-14-11和SYSC-2-8的LSU序列和ITS2序列無(wú)差異, 與世界其他地理區(qū)系的Effrenium屬藻株僅有1～3個(gè)堿基差異, 藻株之間遺傳差異很小。因此, 根據(jù)目前公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)(Haywood et al, 2004; Stern et al, 2012), 推測(cè)本文中的兩株Effrenium屬蟲黃藻均為E. voratum。隨著更多藻株的獲得和更高分辨率遺傳標(biāo)記(如微衛(wèi)星)的應(yīng)用, 未來(lái)對(duì)蟲黃藻多樣性的環(huán)境調(diào)查可能會(huì)發(fā)現(xiàn)Effrenium屬蟲黃藻中的其他成員。值得注意的是,本研究中藻株SYSC-14-11和SYSC-2-8與我國(guó)膠州灣藻株 G15(朱霞 等, 2011)和珠江口藻株zhao01(Shao et al, 2004)的ITS2序列堿基組成一致,且細(xì)胞大小相似, 表明這4株藻可能為同一物種。相比之下, 本研究的兩個(gè)藻株與Gou等(2003)報(bào)道的藻株ZX11的ITS2序列有3個(gè)堿基差異, 且藻株ZX11的細(xì)胞大小僅為6～8μm, 顯著小于E. voratum細(xì)胞, 因此藻株ZX11有可能是Effrenium屬蟲黃藻中的新成員。遺憾的是, Gou等(2003)并未對(duì)藻株ZX11的分類地位作進(jìn)一步確認(rèn)。

截至目前, 已報(bào)道的E. voratum藻株多來(lái)源于環(huán)境樣品, 如海水和大型海藻表面, 極少數(shù)源于生物樣品, 即使取自生物樣品中, 也未能證明E.voratum與樣品生物之間存在共生關(guān)系。Jeong等(2012)通過(guò) qPCR技術(shù), 在孔穴珊瑚(Alveopora japonica)中發(fā)現(xiàn)了E. voratum, 但含量極低(含量＜0.06%), 僅僅稱得上是背景種。而Rodriguez-Lanetty等(2003)在遍布于韓國(guó)各海域的孔穴珊瑚中也未發(fā)現(xiàn)E. voratum, 僅含有F系群, 未發(fā)現(xiàn)Effrenium屬及其他系群蟲黃藻。因此, 目前尚不清楚E. voratum與孔穴珊瑚是否互為共生關(guān)系, 也不能準(zhǔn)確認(rèn)定E. voratum是否作為一種優(yōu)勢(shì)的穩(wěn)定共生體存在于其他宿主中。本研究中的兩株藻雖然分離于叢生盔形珊瑚和柔枝鹿角珊瑚的組織液, 但不能完全排除珊瑚表面附生藻類和海水中營(yíng)自由生活藻類的污染。因此, 藻株SYSC-14-11和SYSC-2-8與珊瑚是否存在內(nèi)共生關(guān)系仍須進(jìn)一步深入研究。

綜上所述, 本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)分離自三亞鹿回頭海域的兩株Effrenium屬蟲黃藻進(jìn)行了描述, 填補(bǔ)了我國(guó)蟲黃藻地理分布的空缺, 進(jìn)一步加深了人們對(duì)熱帶Effrenium屬蟲黃藻的認(rèn)識(shí), 為我國(guó)蟲黃藻物種多樣性及系統(tǒng)分類學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。