南海軟珊瑚共附生真菌Aspergillus sp. EGF15-0-3苯甲醛類化合物研究*

劉炳新, 韋霞, 肖細(xì)姬, 張琪, 張翠仙

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院, 廣東 廣州 510006;

2. 康美藥業(yè)股份有限公司, 廣東 廣州 510627

苯甲醛類化合物(圖1)廣泛分布于自然界(Li et al, 2008; 黃玉玲 等, 2012), 結(jié)構(gòu)的1位為醛基取代,2位常為直鏈庚烷取代, 5位常為異戊烯基取代, 3位和6位存在羥基。當(dāng)2位側(cè)鏈為直鏈時(shí), 常與苯環(huán)形成1～3個(gè)共軛與非共軛雙鍵(圖1a), 或者與3位羥基形成呋喃(圖1b)或吡喃環(huán)(圖1c、1d)。此類物質(zhì)主要來源于曲霉屬, 且具有較高的生物活性(Umeda et al, 1974; Nazar et al, 1984; Miyake et al,2010; Smetanina et al, 2007; Gao et al, 2012; Kim et al, 2014), 如抗氧化、細(xì)胞毒活性和抑菌活性, 是國內(nèi)外學(xué)者們的重要研究課題。本文作者所在課題組一直在尋找海洋生物中結(jié)構(gòu)新穎的次生代謝產(chǎn)物, 在OSMAC(One strain many compounds)和GNPS(Global Natural Product Social Molecular Networking)的共同指導(dǎo)下, 繼續(xù)對(duì)南海軟珊瑚共附生真菌Aspergillussp. EGF15-0-3 PDA (Potato Dextrose Agar (Medium))培養(yǎng)基次生代謝產(chǎn)物具有克服腫瘤活性的苯甲醛部位(濃度為 200ug·ml-1時(shí)克服腫瘤耐藥活性為56.89%)進(jìn)行研究(李秀婷 等, 2016; Feng et al, 2020;Wei et al, 2020), 并分離得到9個(gè)苯甲醛類化合物(圖2)。通過核磁共振和質(zhì)譜等現(xiàn)代波譜研究, 確定了這9個(gè)苯甲醛類化合物的結(jié)構(gòu)為: flavoglaucin(1)、tetrahydroauroglaucin(2)、 isoaspergin (3)、isotetrahydroauroglaucin (4)、dihydroauroglaucin (5)、isodihydroauroglaucin (6)、2-(1',5'-heptadienyl)-3,6-dihydroxy-5-(3''-methyl-2''-butenyl) benzaldehyde(7)、auro-glaucin (8)和 2-(2',3-epoxy-1'-heptenyl)-6-hydroxy-5-(3''methyl-2''-butenyl) benzal-dehyde(9)。體外克服耐藥腫瘤H1975/GR細(xì)胞株的活性研究表明, 在濃度為50μg·mL-1時(shí), 化合物3具有較弱的細(xì)胞毒活性, 抑制率62.66%; 而化合物9具有較強(qiáng)細(xì)胞毒活性, 抑制率為93.71%。

圖1 海洋微生物中苯甲醛類衍生物常見結(jié)構(gòu)類型圖c中的R為H或OHFig.1 Common structural types of benzadehyde derivatives in marine microorganisms

圖2 來源于軟珊瑚共附生真菌Aspergillus sp.EGF15-0-3的苯甲醛類化合物化合物2～8后的Δ代表雙鍵Fig.2 The benzadehyde compounds derived from soft coral-associated symbiotic fungus Aspergillus sp. EGF15-0-3

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器: GZX-9070MBE恒溫培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司); HYG-A全溫?fù)u瓶柜(常州市三盛儀器制造有限公司); 超凈工作臺(tái)(單人)(蘇州凈化設(shè)備廠); DZ-900振蕩器(太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠); LXB75L型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器(合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司); YLD-2000烘箱(上海索譜儀器有限公司); 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)的SHZ-DIII循環(huán)水真空泵、XHDLSB-5/25低溫冷卻循環(huán)泵、XHRE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和KQ-500DB超聲波清洗機(jī); QuikSep高效液相色譜儀(北京慧德易科技有限責(zé)任公司); AVANCE AV400超導(dǎo)核磁共振儀(瑞士Bruker公司); AB SCIEX三重四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(美國ABSciex公司); POLARTRONIC HH W5旋光儀(德國SCHMIDT+ HAENSCH公司)。

試劑: 土豆(市場購買); 葡萄糖(AR, 天津市大茂化學(xué)試劑廠); 速溶海水晶(江西鹽通科技有限公司); 甲醇、乙酸乙酯、石油醚、氯仿、正丁醇、乙酸、濃硫酸、二甲基亞砜(AR, 廣州東巨精細(xì)化工有限公司); 色譜甲醇、乙腈和乙醇(上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司); 開放性O(shè)DS柱層析(12nm, S-50μm,日本分光株式會(huì)社); Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(General Electrics醫(yī)療集團(tuán)); 柱層析硅膠(200～300目, 青島海洋化工廠); GF254薄層層析(青島海洋化工廠)。

PDA培養(yǎng)基: 葡萄糖2.0%, 土豆200g·L-1(土豆汁用陳海水作溶劑配制), 鹽度35‰, pH自然。

1.2 微生物材料

菌種: 菌株EGF15-0-3由采集于中國南海三亞海域的軟珊瑚分離而來, 根據(jù)其形態(tài)特征和分子協(xié)議, 對(duì)rRNA基因ITS區(qū)域的DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增和測序, 種屬鑒定為曲霉屬真菌Aspergillussp., 菌種樣本保存在廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院海洋微生物實(shí)驗(yàn)室(編號(hào)EGF15-0-3)。

細(xì)胞株: 吉非替尼耐藥株(H1975/GR, 由暨南大學(xué)藥學(xué)院張冬梅教授提供)。

1.3 菌株EGF 15-0-3規(guī)模發(fā)酵

種子液活化: 將菌種管從冰箱取出解凍后用接種環(huán)蘸取適量的菌液, 接種到含有PDA固體培養(yǎng)基的平板上(共5塊平板), 置恒溫培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)2～3d。待平板長出單菌落后, 用接種環(huán)挑取單菌落轉(zhuǎn)移至裝有200mL PDA培養(yǎng)基的1L培養(yǎng)瓶中, 置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中28℃、165r·min-1培養(yǎng)2～3d, 獲得EGF15-0-3的種子培養(yǎng)液。

發(fā)酵: 吸取該種子液3.0mL, 分別加入裝有400mL PDA培養(yǎng)基的1L培養(yǎng)瓶中, 在28℃下靜置培養(yǎng)60d, 與空白培養(yǎng)基對(duì)比并觀察是否有明顯的菌株生長, 生長完畢停止發(fā)酵。共培養(yǎng)菌株EGF15-0-3 100L。

1.4 菌株EGF 15-0-3次生代謝產(chǎn)物的提取分離

提取: 培養(yǎng)基的菌株成長完畢后, 用少量甲醇滅活后停止發(fā)酵, 經(jīng)紗布過濾, 得到菌絲體和發(fā)酵液兩部分。發(fā)酵液在85℃水浴條件下濃縮至10L, 依次用等體積的EtOAc和n-BuOH進(jìn)行分配萃取, 各萃取3次, 分別合并EtOAc和n-BuOH后減壓濃縮,得到發(fā)酵液的EtOAc相浸膏(17.5g)及n-BuOH相浸膏(67.5g)。菌絲體用甲醇浸泡提取3次(每次3d), 所得提取液經(jīng)合并及減壓濃縮后再用水涅溶, 依次用等量的EtOAc和n-BuOH進(jìn)行分配萃取, 分別萃取3次, 萃取液減壓濃縮后得到菌絲體的EtOAc相浸膏(36.5g)和n-BuOH相浸膏(50.8g)。

分離: 根據(jù)TLC和LC-MS情況, 將PDA菌絲體的EtOAc相浸膏(36.5g)經(jīng)硅膠柱層析, 以石油醚-乙酸乙酯體系0～100%洗脫后再用氯仿-甲醇體系0～100%梯度洗脫, TLC薄層跟蹤并合并流分得到12個(gè)不同極性的流分(標(biāo)記為Fr.1～Fr.12)。通過NMR和LC-MS共同分析后, 選擇目標(biāo)組流分進(jìn)行下一步分離, 其中Fr.2(14.5g)經(jīng)硅膠柱層析和石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫, 分離后重結(jié)晶得到化合物8(250mg)。Fr.2-2(1.5g)甲醇溶解, 經(jīng)半制備 HPLC純化(Kromasil色譜柱, 5μm, 250mm×10mm)和純甲醇洗脫(6mL·min-1), 分離出8個(gè)峰, 通過與化合物8的UV對(duì)照后確定3個(gè)目標(biāo)峰, 分別為peak 4(201.3mg,τR=26.82min)、peak 5(534.6mg,τR=28.38min)、peak 8(153.9mg,τR=39.08min)。peak 4進(jìn)行二次半制備 HPLC 純化(ACE色譜柱,250mm×10mm C18-PFP ), 經(jīng)甲醇水體系(V甲醇:V水=8:2, 3mL·min-1)洗脫后獲得化合物 3(32.2mg,τR=49.43min); peak 5進(jìn)行二次半制備HPLC純化(YMC色譜柱, 250mm×10mm ), 經(jīng)甲醇水體系(V甲醇:V水=8:2, 3mL·min-1)洗脫后獲得化合物4(68.2mg,τR=47.26min)和5(45.1mg,τR=50.19min); peak 8進(jìn)行二次半制備 HPLC純化(YMC色譜柱,250mm×10mm ), 經(jīng)甲醇水體系(V甲醇:V水=8.8:1.2,3mL·min-1)洗 脫 后 獲 得 化 合 物 9(3.8mg,τR=52.95min)。Fr.2-3(500mg)甲醇溶解, 經(jīng)半制備HPLC純化(Kromasil色譜柱, 5μm, 250mm×10 mm)和甲醇水體系(V甲醇:V水=85:15, 8mL·min-1)洗脫后,依次獲得化合物1(10mg,τR=13.28min)、2(20mg,τR=20.03min)、6(10mg,τR=21.39min)和 7(7mg,τR=17.15min)。

1.5 物理常數(shù)和波譜數(shù)據(jù)

化合物1: 黃色針晶(甲醇), 分子式為C19H28O3,UV 254nm下有暗斑, 香草醛-濃H2SO4顯棕藍(lán)色,HRESIMSm/z: 303.1280[M-H]-;1H NMR(CDCl3,500MHz)δHppm: 11.9 (1H, s, 6-OH), 10.25 (1H, s,H-14), 6.89 (1H, s, H-4), 5.28 (1H, t, H-16), 4.4 (1H, s,3-OH), 3.28 (2H, d, H-15), 2.88 (2H, brt, H-7),1.76(3H, s, H-19), 1.7 (3H, s, H-18), 1.58 (2H, m,H-8), 1.39 (2H, m, H-9), 1.29 (2H, m, H-10), 1.29 (2H,m, H-11), 1.29 (2H, m, H-12), 0.88(3H, m, H-13) 和13C NMR (CDCl3,125MHz)δCppm: 14.04 (q, C-13),17.76 (q, C-18), 22.61 (t, C-12), 23.94 (t, C-7),25.77 (q, C-19), 27.01(t, C-15), 29.11(t, C-10), 29.59(t, C-9), 31.77 (t, C-11), 31.99 (t, C-8), 133.79 (s,C-17), 117.34 (s, C-1), 121.21 (d, C-16), 125.69 (d,C-4), 128.59 (s, C-2), 128.59 (s, C-5), 144.59 (s, C-3),155.82 (s, C-6), 195.52 (d, C-14).

化合物 2: 黃色塊晶(甲醇), 分子式為C19H26O3, UV 254nm下有暗斑, 香草醛-濃H2SO4顯棕藍(lán)色, HR-ESI-MSm/z: 301.1808[M-H]-;1H NMR(Pyr-d5,400MHz)δHppm: 11.18 (1H, s, 6-OH),10.41(1H, s, H-14), 7.36 (1H, s, H-4), 7.01(1H, td,H-7), 6.0 (1H, td, H-8), 5.43 (1H, t, H-16), 4.91 (1H, s,3-OH), 3.5 (2H, d, H-15), 2.24(2H, m, H-9), 1.65(3H,s, H-19), 1.62 (3H, s, H-18), 1.41 (2H, m, H-10), 1.26(2H, m, H-11), 1.26 (2H, m, H-12), 0.84(3H, m, H-13)和13C NMR(Pyr-d5,100MHz)δCppm: 14.56 (q, C-13),18.04 (q, C-18), 23.11 (t, C-12), 26.09 (q, C-19),28.04(t, C-15), 29.55(t, C-10), 32.08 (t, C-11), 34.4(t,C-9), 118.97(s, C-1), 122.6 (d, C-7), 122.71 (d, C-16),126.1(s, C-2), 127.53 (d, C-4), 129.31(s, C-5), 133.78(s, C-17), 141.52(d, C-8), 148.84(s, C-3), 154.92 (s,C-6), 198.09 (d, C-14) .

化合物3: 黃色針晶(甲醇), 分子式為C19H26O3,HR-ESI-MSm/z: 301.1808 [M-H]-(Cal. 301.1804);1H NMR (CDCl3, 400 MHz)δHppm: 11.92 (1H, s,6-OH), 10.21 (1H, s, H-14), 6.91 (1H, s, H-4), 5.45 (H,m, H-9), 5.42 (H, m, H-10), 5.28 (1H, brt, H-16), 4.5(1H, s, 3-OH), 3.3 (2H, d, H-15), 2.96 (2H, t, H-7),2.28 (2H, m, H-8), 1.95 (2H, m, H-11), 1.76(3H, s,H-18), 1.69(3H, s, H-19), 1.34 (2H, m, H-12), 0.86(3H, d, H-13) 和13C NMR (CDCl3, 100MHz)δCppm:13.8 (q, C-13), 17.9 (q, C-18), 22.6 (t, C-12), 24.4 (t,C-7), 26 (q, C-19), 27.2(t, C-15), 34.3 (t, C-11), 34.7 (t,C-8), 117.4 (s, C-1), 121.3 (d, C-16), 126 (d, C-4),127.7 (s, C-5),128.4 (d, C-9), 129 (s, C-2), 132.8 (d,C-10), 134 (s, C-17),145.2 (s, C-3), 156.0 (s, C-6),195.7 (d, C-14).

化合物4: 黃色針晶(甲醇), 分子式為C19H26O3,HRESIMSm/z: 301.1808 [M-H]-(Cal. 301.1804);1H NMR (CDCl3, 400MHz)δHppm: 11.91 (1H, s, 6-OH),10.23 (1H, s, H-14), 6.89 (1H, s, H-4), 5.4 (1H, m,H-12), 5.38 (H, m, H-11), 5.27 (1H, t, H-16), 3.49 (1H,s, 3-OH), 3.27 (2H, d, H-15), 2.88 (2H, t, H-7), 2.02(2H, q, H-10), 1.75 (3H, s, H-18), 1.69 (3H, s, H-19),1.63 (3H, m, H-13), 1.57 (2H, m, H-9), 1.45 (2H, m,H-8) 和13C NMR (CDCl3,100MHz)δCppm: 17.9 (q,C-13), 18.1 (q, C-18), 23.8 (t, C-7), 25.9 (q, C-19),27.2(t, C-15), 29.4 (t, C-9), 31.4 (t, C-8), 32.4(t, C-10),117.4 (s, C-1), 121.3 (d, C-16), 125.4(d, C-4), 125.8 (s,C-5), 128.6 (d, C-11), 128.7(s, C-2), 131.1 (d, C-12),134 (s, C-17), 145.2 (s, C-3), 155.8 (s, C-6), 195.5 (d,C-14).

化合物5: 黃色針晶(甲醇), 分子式為C19H24O3,HR-ESI-MSm/z: 299.1650 [M-H]-(Cal. 299.1647);1H NMR (CDCl3, 400MHz)δHppm: 11.77 (1H, s,6-OH), 10.08 (1H, s, H-14), 6.99 (1H, s, H-4), 6.54(1H, d, H-7), 6.43 (1H, m, H-9), 6.27 (1H, m, H-8),5.88 (1H, m, H-10), 5.29 (1H, brt, H-16), 3.49 (1H, s,3-OH), 3.32 (2H, d, H-15), 2.13 (2H, q, H-11),1.75(3H, s, H-18), 1.69(3H, s, H-19), 1.45 (2H, m,H-12), 0.94 (3H, t, H-13) 和13C NMR (CDCl3,100MHz)δCppm: 13.9 (q, C-13), 17.9 (q, C-18), 22.4(t, C-11), 25.9 (q, C-19), 27.4 (t, C-15), 35 (t, C-12),117.2 (s, C-1), 119.6 (d, C-16), 121.1 (d, C-7), 124.3(s,C-5), 125.3(d, C-4), 129.7 (d, C-9), 130.5 (s, C-2),134.1 (s, C-17), 139 (d, C-8), 140 (d, C-10), 145.32 (s,C-3), 155.4 (s, C-6), 195.4 (d, C-14.

化合物6: 黃色針晶(甲醇), 分子式為C19H24O3,UV 254nm下有暗斑, 香草醛-濃H2SO4顯棕藍(lán)色,HRESIMSm/z: 299.1650[M-H]-;1H NMR(CDCl3,500MHz)δHppm: 11.92 (1H, s, 6-OH), 10.23 (1H, s,H-14), 6.9 (1H, s, H-4), 6.08 (1H, m, H-11), 5.98(1H,m, H-9), 5.63 (1H, m, H-12), 5.55 (1H, m, H-10), 5.28(1H, m, H-16), 4.52 (1H, s, 3-OH), 3.3 (2H, d, H-15),2.98(2H, t, H-7), 2.35 (2H, dd, H-8), 1.76(3H, s, H-19),1.73 (3H, t, H-13), 1.7 (3H, s, H-18) 和13C NMR(CDCl3, 125MHz)δCppm: 15.6 (q, C-19), 17.8 (q,C-18), 18 (q, C-13), 24.2 (t, C-7), 27.2(t, C-15), 34.1(t, C-8), 117.1 (s, C-1), 121 (d, C-16), 125.4 (d, C-4),127.1 (s, C-2), 128.3 (d, C-9), 128.7 (s, C-5), 129.2 (d,C-10), 131 (d, C-12), 131.8 (d, C-11), 134 (s, C-17),145.5 (s, C-3), 155.4 (s, C-6), 195.7 (d, C-14).

化合物7: 黃色針晶(甲醇), 分子式為C19H24O3,UV 254nm下有暗斑, 香草醛-濃H2SO4顯棕藍(lán)色,HR-ESI-MSm/z: 299.1650[M-H]-;1H NMR (CDCl3,500MHz)δHppm: 11.77 (1H,s, 6-OH), 10.06 (1H, s,H-14), 7.0 (1H, s, H-4), 6.5 (1H, m, H-7), 6.5 (1H, m,H-8), 5.95 (1H, m, H-11), 5.95 (1H, m, H-12), 5.28 (H,m, H-16), 4.65 (1H, s, 3-OH), 3.47 (2H, m, H-15), 3.4(2H, m, H-10), 3.21 (2H, m, H-9), 1.76 (3H,s, H-19),1.7 (3H, s, H-18), 1.63 (3H, m, H-13) .

化合物8: 橙黃色針晶, 分子式為C19H22O3,HRESIMSm/z: 297.1499[M-H]-(cal. 299.1491);1H NMR (CDCl3, 400 MHz)δHppm: 11.79 (1H, s, 6-OH),10.08 (1H, s, H-14), 6.99 (1H, s, H-4), 6.65 (1H, d,H-7), 6.48 (1H, m, H-9), 6.33 (1H, m, H-8), 6.31 (1H,m, H-11), 6.15 (1H, m, H-10), 5.84 (1H, m, H-12),5.29 (1H, brt, H-16), 4.93(1H, s, 3-OH), 3.33 (2H, d,H-15), 1.82 (3H, d, H-13), 1.76 (3H, s, H-18), 1.7(3H,s, H-19) 和13C NMR (CDCl3,100MHz)δCppm: 17.9(q, C-18), 18.6 (q, C-13), 26 (q, C-19), 27.4(t, C-15),117.1 (s, C-1), 120.8 (d, C-16), 121 (d, C-7), 124.2(s,C-5), 134.2 (s, C-17), 125.3 (d, C-4), 129.1 (d, C-8),130.7(s, C-2), 131.4(d, C-9), 132.9(d, C-11), 136.4(d,C-12), 139.7(d, C-10), 145.2(s, C-3), 155.5 (s, C-6),196.2 (d, C-14).

化合物 9: 黃色油狀, 分子式為 C19H24O3,HRESIMSm/z: 299.1651[M-H]-(cal. 299.1641);1H NMR (CDCl3, 400MHz)δHppm: 11.67 (1H, s, 6-OH),10.24 (1H, s, H-14), 7.45 (1H, s, H-4), 6.65 (1H, s,H-7), 5.34 (1H, brt, H-16), 3.4 (2H, d, H-15), 2.78 (2H,t, H-9), 1.77 (3H, s, H-18), 1.74 (2H, m, H-10), 1.72(3H, s, H-19), 1.38 (2H, m, H-11), 1.36 (2H, m, H-12),0.91 (3H, t, H-13)和13C NMR (CDCl3,100MHz)δCppm: 14.1 (q, C-13), 17.9(q, C-18), 22.5 (t, C-12), 26(q, C-19), 27.5(t, C-10), 27.6(t, C-15), 28.8 (t, C-9),31.5 (t, C-11), 98.7(d, C-7), 110.9 (s, C-1), 119.6 (d,C-4), 121.6 (d, C-16), 125.5 (s, C-5), 128.7(s, C-2),134(s, C-17), 148.6 (s, C-3), 157.6 (s, C-8), 162.8 (s,C-6), 193.3 (d, C-14).

1.6 藥理活性試驗(yàn)

MTT法: 其原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT(噻唑蘭, 溴化噻唑藍(lán)四氮唑)還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中, 而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瓚, 用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值, 可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。采用96孔板法, 粗提物和單體化合物的篩藥濃度分別為200μg·mL-1和50μmol·L-1(LaKshmi et al, 2009)。耐藥腫瘤細(xì)胞株為吉非替尼耐藥肺癌腫瘤細(xì)胞株(H1975/GR)。

2 結(jié)果與討論

化合物1為黃色針晶(甲醇), 紫外燈254nm下有暗斑, 香草醛-濃H2SO4顯棕藍(lán)色。由ESI-MS給出的準(zhǔn)分子離子峰m/z為303[M-H]-, 提示其相對(duì)分子質(zhì)量為304, 結(jié)合1H和13C NMR確定其分子式為C19H28O3, 表明不飽和度為6。結(jié)合其NMR圖譜信息, 結(jié)構(gòu)中含有6個(gè)C、3個(gè)CH、7個(gè)CH2和3個(gè)CH3。1H NMR譜中δH10.25(1H, s, H-14)和13C NMR譜中δC195.52(d, C-14)的信號(hào)提示結(jié)構(gòu)中含有醛基;1H NMR中只顯示了一個(gè)芳香質(zhì)子信號(hào)δH6.89(1H,s),δH11.9(1H, s)和4.4(1H, s)為酚羥基質(zhì)子信號(hào), 結(jié)合13C NMR信息說明結(jié)構(gòu)中存在五取代苯環(huán), 為苯甲醛類化合物。1H NMR譜存在一組典型的異戊烯基片段質(zhì)子信號(hào):δH3.28(2H, d, 7.2Hz, H-15)、5.28(1H, t, 7.2Hz, H-16)、1.7(3H, s, H-18)和1.76(3H,s, H-19); 一系列質(zhì)子信號(hào):δH2.88(2H, br t, 7.2 Hz,H-7)、1.58(2H, m, H-8)、1.39(2H, m, H-9)、1.29(2H,m, H-10)、1.29(2H, m, H-11)、1.29(2H, m, H-12)和0.88(3H, m, H-13)。結(jié)合13C NMR信號(hào)δC23.94(t,C-7)、31.99(t, C-8)、29.59(t, C-9)、 29.11(t, C-10)、31.77(t, C-11)、22.61(t, C-12) 及14.04(q, C-13), 可知結(jié)構(gòu)中應(yīng)存在一飽和的直鏈7碳烷烴片段。進(jìn)一步將數(shù)據(jù)與黃玉玲等(2012)的flavoglaucin對(duì)比, 可確定該化合物1為灰綠曲霉黃色素(flavoglaucin)。

化合物2、3和4均為黃色晶體(甲醇), 紫外燈254nm下有暗斑, 香草醛-濃H2SO4顯棕藍(lán)色, 提示為苯甲醛類化合物。三者的HR-ESI-MS分析給出的準(zhǔn)分子離子峰m/z均為 301.1808[M-H]-(cal.301.1804), 分子式均為C19H26O3, 不飽和度為7, 互為同分異構(gòu)體。同時(shí)發(fā)現(xiàn)2、3、4的分子量比1少2, 不飽和度與1比較增加1, 可推斷2、3、4只是比1多了1個(gè)雙鍵。對(duì)比化合物1～4的NMR信息, 四者高度類似, 其中2的1H NMR譜中含有異戊烯基的特征吸收信號(hào)δH5.43(1H, m, H-16)、3.50(2H, d,J=7.2Hz, H-15)、1.65(3H, s, H-19)和 1.62(3H, s,H-18);13C NMR譜中給出相應(yīng)的信號(hào)為: 2 個(gè)甲基信號(hào)δC18.04(C-18)、26.09 (C-19), 1個(gè)亞甲基δC28.04(C-15), 1個(gè)sp2雜化的次甲基δC122.71(C-16)和1個(gè)sp2雜化的季碳δC133.78(C-17)。分子中庚二烯基結(jié)構(gòu)片段信號(hào)δH7.01(1H, td,J=16.0Hz, H-7)和6.0(1H, td,J=2.4,16.0Hz, H-8)表明該化合物的7、8位之間為反式雙鍵; 信號(hào)δH2.24(2H, m, H-9)、1.41(2H, m, H-10)和1.26(4H, m, H-11, 12)表明該化合物的9、10位和11、12位之間都為單鍵; 信號(hào)δH0.84(3H, m, H-13)、1.26(4H, m, H-11, 12)表明化合物的12、13位為單鍵。綜合以上信息, 將化合物2與文獻(xiàn)曲霉素(aspergin)(Inoue et al, 1997)對(duì)比, 確定2為曲霉素(aspergin)或四氫金(色)灰綠曲霉素(tetrahydroauroglaucin)?；衔?、4與2對(duì)比, 唯一不同的是在直鏈的7碳烯烴片段中雙鍵取代的位置存在差異。將化合物3的 NMR數(shù)據(jù)與isoaspergin(黃玉玲 等, 2012)對(duì)比, 兩者基本一致, 故確定3為isoaspergin。將化合物 4 的 NMR 數(shù)據(jù)與isotetrahydroauroglaucin對(duì)比(Hamasaki et al, 1980),兩者基本一致, 故確定4為isotetrahydroauroglaucin。

化合物5、6和7均為黃色針晶(甲醇), 三者紫外燈254nm下均有暗斑, 香草醛-濃H2SO4顯棕藍(lán)色,提示為苯甲醛類化合物。三者的HR-ESI-MS分析給出的準(zhǔn)分子離子峰m/z均為299.1650[M-H]-(cal.299.1647), 分子式均為C19H24O3, 不飽和度為8, 提示化合物5、6、7為同分異構(gòu)體。其次, 3個(gè)化合物的NMR圖譜信息與化合物2、3、4高度相似, 唯一不同的是在直鏈的7碳烯烴片段中雙鍵取代的數(shù)量存在差異?；衔?的1H NMR中,δH6.54(1H, d,16.0 Hz, H-7)、6.27(1H, m, H-8)、6.43(1H, m, H-9)、5.88(1H, m, H-10)、2.13(2H, q, 8.0 Hz, H-11)、1.45(2H, m, H-12)和0.94(3H, t,J=8.0 Hz, H-13), 以及13C NMR信號(hào)中的δC121.1(d, C-7)、139.0(d,C-8)、129.7(d, C-9)、140.0(d, C-10)、22.4(t, C-11)、35.0(t, C-12)和13.9(q, C-13), 表明化合物5的7、8位和9、10位分別為雙鍵取代, 將該化合物的NMR數(shù)據(jù)與dihydroauroglaucin(Hamasaki et al, 1981)對(duì)比,兩者基本一致, 故確定化合物5為dihydroauroglaucin?；衔?、7與5對(duì)比, 唯一不同的是在直鏈的7碳烯烴片段中雙鍵取代的位置存在差異。將化合物6的數(shù)據(jù)與異二氫金(色)灰綠曲霉素(黃玉玲 等, 2012)進(jìn)行比較, 兩者接近一致, 故確定化合物6為異二氫金(色)灰綠曲霉素(isodihydroauroglaucin)。將化合物 7的數(shù)據(jù)與 2-(1',5'-heptadienyl)-3,6-dihydroxy-5-(3''-methyl-2''-butenyl) benzaldehyde (Li et al, 2008)對(duì)比, 兩者接近一致, 故將化合物7的結(jié)構(gòu)定為2-(1',5'-hepta-dienyl)-3, 6-dihydroxy-5-(3''-methyl-2''-butenyl) benzaldehyde。

化合物8為橙黃色針晶(甲醇), HR-ESI-MS分析給出的準(zhǔn)分子離子峰m/z為297.1499[M-H]-(cal.299.1491), 分子式為C19H22O3, 不飽和度為9。其NMR圖譜信號(hào)與化合物5高度相似, 唯一不同的是在直鏈的7碳烯烴片段中雙鍵取代的位置存在差異?；衔?的1H NMR中, 系列質(zhì)子信號(hào)為δH6.65(1H, d,J=16.0 Hz, H-7)、6.33(1H, m, H-8)、6.48(1H, m, H-9)、6.15(1H, m, H-10)、6.31(1H, m,H-11)、5.84(1H, m, H-12)和1.82(3H, d, 8.0 Hz, H-13),結(jié)合13C NMR信號(hào)中的δC121.0(d, C-7)、129.1(d,C-8)、131.4(d, C-9)、139.7(d, C-10)、132.9(d, C-11)、136.4(d, C-12)以及18.6(q, C-13), 可判斷直鏈的7碳烯烴片段為共軛三雙鍵取代。將化合物8的NMR數(shù)據(jù)與auroglaucin(Miyake et al, 2009)對(duì)比, 兩者基本一致, 故確定化合物8為auroglaucin。

化合物9為黃色油狀, HR-ESI-MS分析給出的準(zhǔn)分子離子峰m/z為299.1651[M-H]-(cal. 299.1641),分子式為C19H24O3, 不飽和度為8。對(duì)其NMR圖譜進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)該化合物也屬于苯甲醛類化合物,結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)五取代苯體系和一個(gè)異戊二烯基片段。1H NMR圖譜僅顯示烯烴質(zhì)子信號(hào)δH6.65(1H, s,H-7), 除此之外無任何不飽和度信息, 說明其結(jié)構(gòu)中還存在一個(gè)環(huán)。13C NMR圖譜中的烯烴信號(hào)δH98.7(d, C-7)和157.6(s, C-8), 說明其一端為連氧烯碳。根據(jù)13C NMR圖譜中給出的19個(gè)碳信號(hào)(7個(gè)C, 4個(gè)CH, 5個(gè)CH2和3個(gè)CH3), 結(jié)合1H NMR的一系列質(zhì)子信號(hào)[δH2.78(2H, t, 8.0 Hz, H-9)、1.74(2H,m, H-10)、1.38(2H, m, H-11)、1.36(2H, m, H-12)和0.91(3H, t, 4.0 Hz, H-13)], 且只存在一個(gè)酚羥基質(zhì)子信號(hào)[δH11.67(1H, s, 6-OH)], 可推測結(jié)構(gòu)中直鏈片段的8位與苯環(huán)的3位形成了吡喃環(huán)。將化合物9的 NMR數(shù)據(jù)與 2-(2',3-epoxy-1'-heptenyl)-6-hydroxy-5-(3′′-methyl-2′′-butenyl) benzaldehyde(Li et al, 2008)對(duì)比, 兩者基本一致, 故確定化合物9為2-(2′,3-epoxy-1′-heptenyl)-6-hydroxy-5-(3′′-methyl-2′′-butenyl) benzaldehyde。

本文體外克服腫瘤耐藥活性研究的結(jié)果表明,苯甲醛部位在濃度為200ug·mL-1時(shí), 其對(duì)吉非替尼耐藥肺癌細(xì)胞株HT1975/GR的抑制率為58.19%。而單體化合物在濃度為50μg·mL-1時(shí), 僅化合物3和9表現(xiàn)出對(duì)吉非替尼耐藥肺癌細(xì)胞株HT1975/GR有抑制作用, 抑制率分別為62.66%和93.71%。這可能是由于化合物9的結(jié)構(gòu)2位側(cè)鏈與3羥基形成的吡喃環(huán)大大地提高了其克服吉非替尼耐藥肺癌細(xì)胞株HT1975/GR的活性, 故具有一定新穎性。文獻(xiàn)調(diào)研表明(Inoue et al, 1997), 化合物2對(duì)產(chǎn)氣桿菌Enterobacter aerogenes、大腸桿菌Escherichia coli、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis具有弱的抗菌活性,且具有弱的抗腫瘤活性。此外, 化合物1、2、3、5、6、8清除DPPH自由基的IC50值分別為17.8、10.5、18.0、9.6、19.6、7.6μmol·L-1, 陽性對(duì)照VC(維生素C)的IC50值為21.0μmol·L-1(黃玉玲 等, 2012), 提示它們具有抗氧化活性, 并且如果側(cè)鏈與苯環(huán)形成共軛體系, 可能會(huì)明顯提高化合物清除自由基的活性。