鴉膽子廢渣抑菌活性成分分析

何博 黃燕 陳琳 王燦燦 曾東強 唐文偉

摘要：【目的】探究鴉膽子去油后廢渣的抑菌活性成分，為開發(fā)生物藥肥提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎镁z生長速率法、孢子萌發(fā)法和濾紙片法等測定鴉膽子廢渣粗提物及不同溶劑萃取物對禾谷鐮刀菌、茄子黃萎病菌和西瓜枯萎病菌等18種供試植物病原真菌的生物活性，并通過生物活性跟蹤對其乙酸乙酯萃取物的化學成分進行分離及鑒定?！窘Y(jié)果】在10 mg/mL濃度下鴉膽子甲醇提取物僅對水稻紋枯病菌具有抑制活性，其抑制率為33.33%;但在5 mg/mL濃度下其石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物對供試病原真菌均具有一定的抑制作用，以乙酸乙酯萃取物的抑菌活性最明顯，對12種供試病原真菌菌絲生長均具有一定的抑制作用，其中對火龍果潰瘍病菌、苦瓜枯萎病菌和水稻紋枯病菌的抑制率分別達75.71%、56.47%和51.72%，對應(yīng)的致死中濃度（EC50）分別為2.65、3.48和2.10 mg/mL。乙酸乙酯萃取物對火龍果潰瘍病菌孢子萌發(fā)的抑制作用隨濃度的升高而增強，在濃度為2.5000 mg/mL時抑制率達100.00%;在紫外光和自然光條件下乙酸乙酯萃取物對火龍果潰瘍病菌的抑菌活性穩(wěn)定。從乙酸乙酯萃取物中分離得到catechol（1）、benzofuran-2-carboxaldehyde（2）、1H-Indazole（3）、vanillic acid（4）、cleomiscosin A（5）等5種化合物，其中，化合物2和3為首次從鴉膽子中分離獲得，但化合物1、2、4和5對供試火龍果潰瘍病菌、苦瓜枯萎病菌和水稻紋枯病菌均無顯著抑菌活性（P>0.05）?！窘Y(jié)論】鴉膽子廢渣中含有抑菌活性成分，在植物病害防控上具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞： 鴉膽子廢渣;抑菌活性;化學成分

中圖分類號： S432? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）04-1002-10

Antifungal active chemical constituents of

Brucea javanica residue

HE Bo， HUANG Yan， CHEN Lin， WANG Can-can， ZENG Dong-qiang，

TANG Wen-wei*

（College of Agriculture， Guangxi University/Guangxi Key Laboratory of Agric-environment and

Agric-product Safety， Nanning? 530004， China）

Abstract：【Objective】This study attempted to find antifungal active components of Brucea javanica residue （oil was removed），which could provide reference for development and utilization of biological medicine and fertilizer. 【Method】Mycelium growth rate method， spore germination method and filter paper method were used to determine the biological activities of the extracts of B. javanica residue against 18 tested pathogenic fungi， such as Fusarium graminearum Schw， Verticillium dahliae Kleb and F. oxysporum f. sp. niveum（E. F. Smith） Synder & Hansen， etc. And through biological activity tracking， the chemical composition of its ethyl acetate extract was separated and identified. 【Result】The results indicated that the methanol extracts of B. javanica only had antifungal activity against Thanatephorus cucumeris（Frank） Domk with the inhibition rate of 33.33% at the concentration of 10 mg/mL. However， the extracts of petroleum ether and ethyl acetate had obvious inhibitory effect on the tested pathogenic fungi activity at the concentration of 5 mg/mL， especially the extracts of ethyl acetate， which had antifungal activity against 12 tested pathogenic fungi including Neoscytali-dium dimidiatum（Penz.） Crous & Slippers， F. oxysporum f. sp. momordicae Sun & Huang J Wand T. cucumeris with inhibition rates of 75.71%， 56.47%， 51.72% andmedial lethal concentration（EC50） values were 2.65， 3.48， 2.10 mg/mL， respectively. The inhibitory effect of ethyl acetate extract on the spore germination of N. dimidiatum could be enhanced with the increase of concent ration. At the concentration of 2.5000 mg/mL， the inhibition rate could reach 100.00%. The antifungal activity against N.dimidiatum of ethyl acetate extract remained stable under the conditions of ultraviolet light and natural light. Five chemical components， catechol（1）， benzofuran-2-carboxaldehyde（2）， 1H-Indazole（3）， vanillic acid （4）， cleomiscosin A（5）， were isolated from the ethyl acetate extracts， and the benzofuran-2-carboxaldehyde（2） and 1H-Indazole（3） were isolated from B. javanica for the first time. Catechol（1）， benzofuran-2-carboxaldehyde（2）， vanillic acid（4）， and cleomiscosin A （5） had no significant antifungal activity against N. dimidiatum， F. oxysporum f. sp. momordicae and T. cucumeris（P>0.05）. 【Conclusion】B. javanica residue contains antifungal activity components， providing a good application prospect for controlling plant diseases.

Key words： Brucea javanica residue; antifungal activity; chemical constituents

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31660529）; Guangxi Innovation Driven Development Special Project（Guike AA18118015）

0 引言

【研究意義】近年來，我國植物提取物行業(yè)發(fā)展迅猛，其涉及到食品、化工、中成藥及植物源農(nóng)藥等諸多領(lǐng)域（李若鵬，2018）。但從植物材料中提取獲得的目標有效成分含量較少，生產(chǎn)過程中通常需要耗費大量的植物原料，同時產(chǎn)生大量提取殘渣。目前對于提取殘渣主要采用焚燒、堆放及填埋等手段進行處理，不僅造成資源浪費，還會污染環(huán)境，因此，研發(fā)出妥善的植物提取殘渣處理和利用方式十分必要（周達彪和唐懋華，2007）。植物材料在提取目標有效成分后，其殘渣中仍含有許多活性成分及有機質(zhì)，若將其制成生物藥肥，一方面可將植物提取殘渣資源化利用，另一方面施用生物藥肥不僅可有效控制目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中難以解決的土傳和種傳病害，還兼具改良土壤、增產(chǎn)增收及改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)等多重效果（吳傳萬等，2014;張興等，2015）。目前針對鴉膽子[Brucea javanica （L.） Merr.]的商業(yè)利用主要是制備鴉膽子油，進一步將其制成乳劑或軟膠囊用于多種癌癥的輔助性治療，而在鴉膽子油制備過程中產(chǎn)生的大量藥渣主要作為畜禽飼料添加劑使用（王群，2016）。鴉膽子廢渣中尚存在大量活性較高的化學成分及大量有機質(zhì)（羅應(yīng)等，2019），具有較高的研究價值，因此探究鴉膽子去油后廢渣的生物活性成分具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】至今，有關(guān)植物提取殘渣加工成具有營養(yǎng)、殺蟲、防病及改善土質(zhì)等多重效果的生物藥肥已有較多研究。施用黨參、地黃和百部等中藥殘渣經(jīng)無害化技術(shù)處理后與肥料（微肥、有機肥）合理組配而成的生物有機藥肥，不僅能有效防治花生和馬鈴薯等農(nóng)作物病害，還能改善農(nóng)作物品質(zhì)，增產(chǎn)增收，且不同程度地改善土壤理化性質(zhì)（畢軍等，2008;史桂芳等，2010）。砂地柏殘渣與纖維素分解菌發(fā)酵腐熟后施用，可顯著提高對番茄灰霉病菌、黃瓜枯萎病菌及棉花黃萎病等6種植物病害的防治效果（袁旭超，2008）。馬齒莧殘渣與砂地柏殘渣經(jīng)堆肥化處理為浸提液，施用該浸提液可顯著提高對黃瓜灰霉病、霜霉病和炭疽病的防治效果（李春霄等，2009）?？喽棺釉o以楝樹和牛心樸子等植物干粉混配研發(fā)出具有顯著防病效果，且兼具營養(yǎng)、改良土壤等多種功能于一體的新一代生態(tài)環(huán)保型藥肥，對黃瓜施用后不僅有促生長作用，還能改善土壤理化性質(zhì)和黃瓜品質(zhì)等（吳傳萬等，2014）?？鄥⑻崛堅c生防鏈霉菌發(fā)酵腐熟施用不僅明顯提高對辣椒立枯病和草莓根腐病的防治效果，還具有促進辣椒和草莓生長的作用（王海濱，2015）。海帶渣與生防芽孢桿菌Hitwh-BA2經(jīng)堆肥化處理制成的海帶渣生物藥肥能有效減少土壤中寄生曲霉的數(shù)量，還顯著增加土壤中細菌的數(shù)量（肖偉和閆培生，2015）。印楝渣與解淀粉芽孢桿菌HN-11經(jīng)堆肥化處理為腐熟的生物藥肥，施用該生物藥肥不僅能有效防控香蕉枯萎病的發(fā)生，還具有促進香蕉生長的作用（賴多等，2017）。目前對鴉膽子廢渣進行綜合利用已有少量研究報道。鴉膽子廢渣不同溶劑提取物對蘋果褐腐病菌、薯蕷炭疽病菌和意大利青霉等多種植物病原菌具有防治效果（李海燕等，2009;白麗莎等，2015;陳楚英等，2016）;鴉膽子廢渣經(jīng)堆肥化處理為腐熟的生物有機藥肥，施用該生物藥肥不僅能有效控制土傳病害，還具有改良土壤及提高作物產(chǎn)量等功效（徐漢虹等，2017）。【本研究切入點】目前，有關(guān)鴉膽子廢渣抑菌活性成分的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用菌絲生長速率法、孢子萌發(fā)法和濾紙片法測定鴉膽子廢渣不同提取物及化合物對植物病原菌的生物活性，明確鴉膽子廢渣的抑菌活性成分，為開發(fā)生物藥肥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試植物 鴉膽子的干燥成熟種子2018年9月采集于廣西百色市田林縣，恒溫鼓風干燥箱中50 ℃烘干，去油，粉碎機粉碎，40目過篩稱重，放入密封袋中遮光保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 1. 2 供試植物病原真菌 供試植物病原真菌共18種，分別為禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum Schw）、茄子黃萎病菌（Verticillium dahliae Kleb）、西瓜枯萎病菌[Fusarium oxysporum f. sp. niveum （E. F. Smith） Synder & Hansen]、馬鈴薯立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn）、香蕉炭疽病菌[Collectorichum musae（Berk. & Curt.） Arx]、水稻稻瘟病菌[Pyricularia grisea（Cooke） Sacc]、香蕉枯萎病菌4號小種（Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4）、甘蔗梢腐病菌（Fusarium moniliforme Sheldon）、番茄立枯病菌（Rhizoctonia colani Kühn.）、苦瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. momordicae Sun & Huang J W）、姜白絹病菌（Sclerotium rolfsii Sacc）、香蕉煤紋病菌[Helminthosporium torulosum （Sydow） Ashby]、柑橘擬莖點霉（Phomopsis citri Fawcett）、膠孢炭疽菌[Colletotrichum gloeosporioides（Penz） Sacc]、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea Pers. ex Fr）、辣椒炭疽病菌（Gloeosporium piperatum Ell. et EV）、火龍果潰瘍病菌[Neoscytalidium dimidiatum （Penz.） Crous & Slippers]和水稻紋枯病菌[Thanatephorus cucumeris（Frank） Donk]，均由廣西大學農(nóng)學院植物病理研究室提供。

1. 1. 3 試劑與儀器 主要試劑：甲醇、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇均為市售分析純;37%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑（壽光晨陽農(nóng)化有限公司）;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）;柱層析硅膠（100～200目和200～300目）（青島海洋化工廠分廠）;Sephadex LH-20葡聚糖凝膠（Amersham生物科學公司）。主要儀器設(shè)備：DHG型系列電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）;LX-05 250克多功能粉碎機（上海江信科技有限公司）;BI型系列電子天平（廈門百倫斯電子科技有限公司）;N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海泉杰儀器有限公司）;FD50A高壓滅菌鍋[至微（廈門）儀器有限公司];PRX-600C智能培養(yǎng)箱系列（寧波賽福實驗儀器有限公司）;CX21顯微鏡（OLYMPUS）;Bruker AVANCE Ⅲ HD-600核磁共振儀（Zurich，Swiss）。

1. 2 植物材料提取

1. 2. 1 植物粗提物制備 將鴉膽子種子（去油后）干粉10 kg分置入錐形瓶（3 L）中（每次裝入500 g干粉），加入一定量甲醇（v/v=1∶3），超聲提取1 h（期間每隔15 min攪拌1次）（王新源，2018），重復(fù)提取3次，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾濃縮，得甲醇粗提物浸膏（1230 g），置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 植物萃取物制備 將鴉膽子甲醇粗提物（1230 g）用蒸餾水（水溫低于50 ℃）充分熱溶，倒入分液漏斗懸浮，分別用等體積石油醚、乙酸乙酯和正丁醇各萃取3次，合并萃取液，減壓蒸餾濃縮，得石油醚萃取物（714 g）、乙酸乙酯萃取物（52 g）和正丁醇萃取物（177 g），置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 抑菌活性生物測定

1. 3. 1 對病原菌菌絲生長抑制作用測定 采用菌絲生長速率法（沈晉良，2013）進行測定：鴉膽子甲醇粗提物及石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物分別以甲醇或丙酮配制成一定濃度藥液，準確吸取1.0 mL藥液加入到9.0 mL PDA培養(yǎng)基（冷卻至45 ℃左右）中，混勻后倒入直徑為9 cm的培養(yǎng)皿，制成所需濃度的含鴉膽子粗提物或萃取物培養(yǎng)基，以加入相同體積溶劑的培養(yǎng)基為對照。將打孔器打制的6 mm不同植物病原菌菌餅分別接種于培養(yǎng)基中央（帶有菌絲的一面朝下），置于（25±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時間后，采用十字交叉法測量菌落直徑，每處理3次重復(fù)，按公式計算抑制率。

抑制率（%）=（對照組菌落直徑-處理組菌落直

徑）/（對照組菌落直徑-6）×100? （1）

1. 3. 2 對病原菌毒力測定 采用菌絲生長速率法（沈晉良，2013）進行測定。鴉膽子乙酸乙酯萃取物和苯醚甲環(huán)唑分別以甲醇配制成一定濃度母液，準確吸取1.0 mL藥液加入到9.0 mL PDA培養(yǎng)基（冷卻至45 ℃左右）中，混勻后倒入直徑為9 cm的培養(yǎng)皿，制成所需濃度的含鴉膽子乙酸乙酯萃取物或苯醚甲環(huán)唑培養(yǎng)基。將母液對半稀釋，以相同方法依次配制成5.0000、2.5000、1.2500、0.6250和0.3125 mg/mL等5個濃度梯度的含鴉膽子乙酸乙酯萃取物培養(yǎng)基，對照藥劑配制成1.6、0.8、0.4、0.2和0.1 μg/mL等5個濃度梯度的含苯醚甲環(huán)唑培養(yǎng)基。其余操作方法同1.3.1。以待測藥液濃度的對數(shù)值（x）和菌絲生長抑制率的幾率值（y）繪制毒力曲線，計算毒力回歸方程、致死中濃度（EC50）及其95%置信限。

1. 3. 3 對病原菌分生孢子萌發(fā)抑制作用測定 采用孢子萌發(fā)法（方中達，2007;李晶等，2018）進行測定。向生成大量孢子的菌種培養(yǎng)皿中加入一定量無菌水，用涂布棒輕輕刮下分生孢子和菌絲，3層紗布過濾，制成測試所需濃度的病原菌孢子懸浮液。鴉膽子乙酸乙酯萃取物以甲醇配制成一定濃度母液，準確吸取1.0 mL不同濃度藥液或甲醇（CK）分別與1.0 mL病原菌孢子懸浮液混勻，用移液槍吸取20 μL混合液至凹玻片上，以相同方法依次配制成5.0000、2.5000、1.2500、0.6250和0.3125 mg/mL系列濃度，每處理3次重復(fù)，置于溫度（25±1）℃、相對濕度（75±1）%的恒溫培養(yǎng)箱中恒溫保濕培養(yǎng)，待對照組孢子萌發(fā)率達80%以上時，觀察記錄孢子總數(shù)和孢子萌發(fā)數(shù)。按公式計算孢子萌發(fā)率和抑制率。

孢子萌發(fā)率（%）=（孢子萌發(fā)數(shù)/觀察孢子總數(shù)）×

100? （2）

孢子萌發(fā)抑制率（%）=（空白孢子萌發(fā)率-處理

孢子萌發(fā)率）/空白孢子

萌發(fā)率×100 （3）

1. 3. 4 萃取物抑菌活性及穩(wěn)定性測定

1. 3. 4. 1 抑菌活性測定 采用濾紙片法（戚馨月等，2020）進行測定。鴉膽子乙酸乙酯萃取物以甲醇配制成一定濃度藥液;將無菌的6 mm濾紙片分別于藥液或甲醇（CK）中充分浸泡，取出瀝干;取0.1 mL病原菌孢子懸浮液至培養(yǎng)基，用無菌涂布棒涂布均勻，將上述濾紙片3片為一組呈正三角形平鋪于培養(yǎng)皿中，每處理3次重復(fù)，置于（25±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1. 3. 4. 2 穩(wěn)定性測定 采用濾紙片法（戚馨月等，2020）測定在不同pH、溫度、金屬離子及紫外光、自然光、氧化條件下鴉膽子乙酸乙酯萃取物對火龍果潰瘍病菌抑菌活性的穩(wěn)定性。酸堿穩(wěn)定性測定：用1 mol/L HCL或NaOH將萃取物的pH分別調(diào)至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0，以未經(jīng)酸堿處理的萃取物為對照。熱穩(wěn)定性測定：將萃取物分別在40、60、80、100和121 ℃的條件下處理30 min，待自然冷卻，以未經(jīng)加熱處理的萃取物為對照。紫外光穩(wěn)定性測定：將萃取物在距離紫外燈30 cm處分別照射20、30、40、50和60 min，以未經(jīng)紫外線處理的萃取物為對照。自然光穩(wěn)定性測定：將萃取物在恒溫培養(yǎng)箱中分別燈光照射2、4、6、8、10和12 h，以未經(jīng)自然光處理的萃取物液為對照。氧化穩(wěn)定性測定：將萃取物在室溫下于空氣中分別暴露6、12、24、48和96 h，然后用含20% Tween-80溶液配制藥液，以未經(jīng)氧化處理的萃取物為對照。金屬離子穩(wěn)定性測定：將萃取物分別與含0.5 g/mL Ag+、Na+、K+、Ca2 +、Mn2+ 和 Zn2+ 的鹽溶液（含0.5% Tween-80）等體積混合，以未經(jīng)金屬離子處理的萃取物為對照。

1. 4 萃取物化學成分分離及鑒定

綜合運用中壓制備、硅膠柱層析、Sephadex LH-20柱層析和硅膠薄層層析等分離手段，對鴉膽子乙酸乙酯萃取物的抑菌活性成分進行跟蹤分離，以核磁共振譜（NMR）和質(zhì)譜（MS）數(shù)據(jù)，并查找文獻，鑒定分離得到的化合物結(jié)構(gòu)。

將鴉膽子乙酸乙酯萃取物（52 g）以200.0 g 100～200目硅膠拌樣，經(jīng)硅膠柱層析（200～300目，柱子為12.0 cm×120.0 cm），分別以石油醚∶乙酸乙酯（100∶0、95∶5、90∶10、80∶20、70∶30、50∶50）和乙酸乙酯∶甲醇（100∶0、90∶10、80∶20、60∶40、0∶100）為流動相梯度洗脫，減壓蒸餾所得洗脫液，經(jīng)TLC板薄層層析分析，合并得到O、A、B、C、D、E和F等7個流分。

將流分段B（2.6 g）經(jīng)Sephadex LH-20（氯仿—甲醇）柱層析后，經(jīng)TLC板薄層層析分析，得到2個流分段，記為B1～B2。將流分段B2經(jīng)Sephadex LH-20（氯仿—甲醇）柱層析后，經(jīng)TLC板薄層層析分析，得3個流分段，記為B2.1～B2.3。將B2.3經(jīng)Sephadex LH-20（甲醇）柱層析后，經(jīng)TLC板薄層層析分析，得3個流分段，記為B2.3.1～B2.3.3。將B2.3.2以0.6 g 100～200目硅膠拌樣，經(jīng)硅膠柱層析（100～200目，2.5 cm×58.0 cm），以石油醚∶丙酮（90∶10、80∶20、75∶25、70∶30）為流動相梯度洗脫，經(jīng)TLC板薄層層析分析，得2個流分段，記為B2.3.2.1～B2.3.2.2，B2.3.2.1經(jīng)反復(fù)Sephadex LH-20（甲醇）柱層析后，經(jīng)TLC板薄層層析分析，得到化合物1。將流分段B2.3.3以1.0 g 100～200目硅膠拌樣，經(jīng)硅膠柱層析（100～200目，2.5 cm×58.0 cm），以石油醚∶丙酮（100∶0、95∶5、90∶10、80∶20、70∶30）為流動相梯度洗脫，經(jīng)TLC板薄層層析分析，得2個流分段，記為B2.3.3.1～B2.3.3.2，將B2.3.3.1經(jīng)反復(fù)Sephadex LH-20（丙酮）柱層析后，經(jīng)TLC板薄層層析分析，得到化合物2。

將流分段C（6.2 g）以5.0 g 100～200目硅膠拌樣，經(jīng)快速中壓制備系統(tǒng)制備，分別以石油醚∶乙酸乙酯（100∶0～0∶100）和乙酸乙酯∶甲醇（100∶0～ 0∶100）為流動相梯度洗脫，經(jīng)TLC板薄層層析分析，得到6個流分段，記為C1～C6。

將流分段C2以5.0 g 100～200 目硅膠拌樣，經(jīng)快速中壓制備系統(tǒng)制備，分別以石油醚∶乙酸乙酯（100∶0～0∶100）和乙酸乙酯∶甲醇（100∶0～0∶100）為流動相梯度洗脫，經(jīng)TLC板薄層層析分析，得到4個流分段，記為C2.1～C2.4。將流分段C2.2經(jīng)Sephadex LH-20（氯仿—甲醇）柱層析后，經(jīng)TLC板薄層層析分析，得到6個流分段，記為C2.2.1～C2.2.6。將C2.2.6以0.8 g 100～200目硅膠拌樣，經(jīng)硅膠柱層析（200～300目，1.1 cm×34.0 cm），以氯仿∶甲醇（100∶0、97∶3、95∶5、90∶10）為流動相梯度洗脫，經(jīng)TLC板薄層層析分析，得到3個流分段，記為C2.2.6.1～C2.2.6.3。將C2.2.6.2經(jīng)Sephadex LH-20（氯仿—甲醇）柱層析后，再以0.5 g 100～200目硅膠拌樣，經(jīng)硅膠柱層析（200～300目，1.1 cm×41.0 cm），以氯仿∶甲醇（100∶0、97∶3、95∶5、90∶10）為流動相梯度洗脫，經(jīng)TLC板薄層層析分析，得到化合物3。

將流分段C4以2.1 g 100～200目硅膠拌樣，經(jīng)硅膠柱層析（200～300目，3.0 cm×58.0 cm），以氯仿∶甲醇（100∶0、99∶1、97∶3、95∶5、92∶8）為流動相梯度洗脫，經(jīng)TLC板薄層層析分析，得到2個流分，記為C4.1～C4.2。將C4.2以0.8 g 100～200目硅膠拌樣，經(jīng)硅膠柱層析（200～300目，1.1 cm×34.0 cm），以氯仿∶甲醇（100∶0、95∶5、90∶10）為流動相梯度洗脫，經(jīng)TLC板薄層層析分析，得到化合物4。

將流分段C5經(jīng)Sephadex LH-20（氯仿—甲醇）柱層析后，經(jīng)TLC板薄層層析分析，得到3個流分段，記為C5.1～C5.3。將C5.1經(jīng)Sephadex LH-20（氯仿—甲醇）柱層析后，經(jīng)TLC板薄層層析分析，得到2個流分段，記為C5.1.1～C5.1.2。將C5.1.2以1.0 g 100～200目硅膠拌樣，經(jīng)硅膠柱層析（100～200目，2.5 cm×58.0 cm），以氯仿∶甲醇（100∶0、98∶2、95∶5、90∶10）為流動相梯度洗脫，經(jīng)TLC板薄層層析分析，得到化合物5。

1. 5 化合物抑菌活性測定

采用濾紙片法（劉學勇和姬志勤，2019）進行測定。化合物用甲醇配制成一定濃度藥液，其余操作方法同1.3.4.1。

1. 6 統(tǒng)計分析

采用Excel 2003、SPSS 23.0和DPS 9.50進行試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用單因素分析和Duncans新復(fù)極差法進行方差分析，采用MestreNova進行NMR譜圖分析處理。

2 結(jié)果與分析

2. 1 鴉膽子提取物抑菌活性測定結(jié)果

以禾谷鐮刀菌、茄子黃萎病菌和西瓜枯萎病菌等18種植物病原真菌為供試病原菌，采用菌絲生長速率法對鴉膽子甲醇粗提物（10 mg/mL）及石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物（均為5 mg/mL）的抑菌活性進行測定。結(jié)果（表1）顯示，10 mg/mL鴉膽子甲醇粗提物僅對水稻紋枯病菌具有抑制活性，抑制率為33.33%。在5 mg/mL濃度下，3種萃取物對供試病原真菌的抑制活性存在差異，其中，乙酸乙酯萃取物的抑菌活性最強，對12種供試病原真菌菌絲生長均具有一定的抑制作用;石油醚萃取物次之，對3種供試病原真菌具有抑制作用;而正丁醇萃取物對供試病原真菌均無抑制作用。乙酸乙酯萃取物對火龍果潰瘍病菌、苦瓜枯萎病菌和水稻紋枯病菌菌絲生長均具有顯著的抑制作用（P<0.05，下同），其中對火龍果潰瘍病菌的抑制率最高，為75.71%，對苦瓜枯萎病菌的抑制率次之，為56.47%，對二者的抑制率均顯著高于其他植物病原菌。綜合表1結(jié)果分析，鴉膽子廢渣的抑菌活性成分主要集中于乙酸乙酯萃取物中。

2. 2 乙酸乙酯萃取物對3種供試病原真菌的毒力

進一步測定鴉膽子乙酸乙酯萃取物對火龍果潰瘍病菌、苦瓜枯萎病菌和水稻紋枯病菌3種病原真菌的毒力。結(jié)果（表2）表明，鴉膽子乙酸乙酯萃取物對3種病原真菌菌絲生長均具有明顯的抑制作用，其中對水稻紋枯病菌的抑制作用最強，其EC50為2.10 mg/mL;對苦瓜枯萎病菌的抑制作用最弱，其EC50為3.48 mg/mL。

為明確鴉膽子乙酸乙酯萃取物的抑菌活性，對3種供試病原真菌進行顯微觀察，其中火龍果潰瘍病菌產(chǎn)生分生孢子，故后續(xù)進一步測定乙酸乙酯萃取物對火龍果潰瘍病菌孢子萌發(fā)的抑制作用。

2. 3 乙酸乙酯萃取物對火龍果潰瘍病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

采用孢子萌發(fā)法測定鴉膽子乙酸乙酯萃取物對火龍果潰瘍病菌孢子萌發(fā)的抑制作用。結(jié)果（圖1和表3）表明，隨著處理濃度的不斷升高，鴉膽子乙酸乙酯萃取物對火龍果潰瘍病菌孢子萌發(fā)的抑制作用不斷增強，在濃度為2.5000 mg/mL時其抑制率已達100.00%，EC50為0.78 mg/mL。

2. 4 乙酸乙酯萃取物對火龍果潰瘍病菌抑菌活性的穩(wěn)定性

由圖2可知，在不同pH、溫度、金屬離子及氧化條件下鴉膽子乙酸乙酯萃取物對火龍果潰瘍病菌的抑菌活性不穩(wěn)定;而在紫外光和自然光條件下乙酸乙酯萃取物對火龍果潰瘍病菌的抑菌活性穩(wěn)定。

2. 5 乙酸乙酯萃取物化學成分分離及鑒定結(jié)果

綜合運用中壓制備、硅膠柱層析、Sephadex LH-20柱層析和硅膠薄層層析等分離方法對鴉膽子乙酸乙酯萃取物的化學成分進行分離，結(jié)果得到5種化合物?；衔锝Y(jié)構(gòu)見圖3。

化合物1：無色針狀結(jié)晶（甲醇），易溶于甲醇，能溶于丙酮，不溶于氯仿。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）：δ 7.89（2H，d，J=8.4 Hz，H-3，4），6.82（2H，d，J=8.4 Hz，H-2，5）。13C-NMR（150 MHz，CD3OD）：δ 161.9（C-1，6），131.6（C-3，4），114.6（C-2，5）。上述數(shù)據(jù)與文獻（詹艷芝，2019）報道基本一致，故鑒定為catechol。

化合物2：無色粉末（甲醇），易溶于甲醇，微溶于丙酮，不溶于氯仿。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）：δ 8.10（1H，s，H-3），8.18（1H，dt，J=7.8，1.2 Hz，H-4），7.26（1H，ddd，J=15.0，8.0，1.0 Hz，H-5），7.30（1H，ddd，J=15.0，8.0，1.0 Hz，H-6），7.49（1H，dd，J=8.0，1.2 Hz，H-7），9.89（1H，s，H-1'）。13C-NMR（150 MHz，CD3OD）：δ 137.5（C-2），138.2（C-3），118.7（C-3a），120.9（C-4），122.2（C-5），123.6（C-6），111.7（C-7），124.3（C-7a），186.0 （C-1'）。上述數(shù)據(jù)與文獻（Maulidiani et al.，2009）報道基本一致，故鑒定為benzofuran-2-carboxaldehyde，為首次從鴉膽子中分離獲得。

化合物3：無色片狀結(jié)晶（甲醇），能溶于甲醇，不溶于丙酮和氯仿。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）：δ 7.45（1H，d，J=7.2 Hz，H-8），7.21（1H，m，H-7），7.18（1H，m，H-6），8.09（1H，d，J=7.2 Hz，H-5），7.96（1H，s，H-3）。13C-NMR（150 MHz，CD3OD）：δ 131.9（C-3），122.1（C-4），120.9（C-5），120.6（C-6），126.1（C-7），111.4（C-8），136.8（C-9）。上述數(shù)據(jù)與文獻（任英杰等，2020）報道基本一致，故鑒定為1H-Indazole，為首次從鴉膽子中分離獲得。

化合物4：無色羽狀結(jié)晶（甲醇），易溶于甲醇，能溶于丙酮，不溶于氯仿。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）：δ 7.56（2H，dd，J=6.6，1.8 Hz，H-1 and H-2），6.84（1H，d，J=6.6，8.4 Hz，H-5），3.94（3H，s，4-OCH3）。13C-NMR（150 MHz，CD3OD）：δ 112.4（C-1），114.4（C-2），114.4（C-5），123.8（C-6），147.2（C-4），151.1（C-3），168.9（C-7），54.9（-OCH3）。上述數(shù)據(jù)與文獻（Renata et al.，2010;趙廷，2015）報道基本一致，故鑒定為vanillic acid。

化合物5：無色粉末（DMSO），易溶于DMSO，不溶于甲醇、丙酮和氯仿。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）：δ 6.35（1H，d，J=9.6 Hz，H-3），7.96（1H，d，J=9.6 Hz，H-4），6.92（1H，s，H-5），7.03（1H，d，J=1.8 Hz，H-2'），6.83（1H，d，J=7.8 Hz，H-5'），6.88（1H，dd，J=7.8，1.8 Hz，H-6'），4.98（1H，d，J=1.8 Hz，H-7'），4.33（1H，m，H-8'），3.39，3.66（each 1H，m，H-9'），3.78（3H，s，6-OCH3），3.79（3H，s，3'-OCH3）。13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）：δ 160.5（C-2），113.7（C-3），145.7（C-4），101.2（C-5），145.3（C-6），138.5（C-7），132.1（C-8），137.5（C-9），111.7（C-10），115.8（C-1'），112.5（C-2'），148.1（C-3'），147.7（C-4'），127.1（C-5'），121.2（C-6'），76.7（C-7'），78.3（C-8'），60.3（C-9'），56.2（6-OCH3），56.3（3'-OCH3）。上述數(shù)據(jù)與文獻（Ray et al.，1985;Kumar et al.，1988;趙麗娟，2014）報道基本一致，故鑒定為cleomiscosin A。

2. 6 化合物抑菌活性測定結(jié)果

以火龍果潰瘍病菌、苦瓜枯萎病菌和水稻紋枯病菌為供試病原菌，采用濾紙片法對化合物1、2、4和5的抑菌活性進行測定，結(jié)果表明，在200 μg/mL濃度下，化合物1、2、4和5對3種供試病原真菌均無顯著抑菌活性（P>0.05）。

3 討論

本研究從鴉膽子廢渣乙酸乙酯萃取物中分離得到5種化合物，其中，化合物1H-Indazole（3）、vanillic acid（4）與羅應(yīng)等（2019）從鴉膽子廢渣中分離獲得3-吲哚甲醛和3，4-二羥基苯甲酸化合物相似，其結(jié)果說明鴉膽子廢渣中尚存在大量吲唑類和苯丙素類化合物。另外，化合物catechol（1）、benzofuran-2-carboxaldehyde（2）、vanillic acid（4）、cleomiscosin A（5）對供試火龍果潰瘍病菌、苦瓜枯萎病菌和水稻紋枯病菌等3種病原真菌均無顯著抑菌活性。但有研究表明，化合物catechol和vanillic acid對植物病原真菌具有一定抑制作用，分離自懷槐心材提取物中的化合物catechol在藥液濃度為2%時，對褐腐菌、球毛殼菌、宛氏擬青霉菌和白腐菌菌絲生長有較好的抑制作用（蘇文強，2008）;從鏈霉菌4301菌株的代謝產(chǎn)物中分離得到的化合物vanillic acid在濃度為10 mmol/L時對荔枝霜疫霉菌有很好的抑制作用，其抑菌圈直徑達28 mm（陳敏等，2009）。因此，本研究分離獲得的化合物1、2、4和5雖然對3種供試病原真菌均無顯著抑菌活性，但在植物病害的防控上仍具有一定的利用價值，鴉膽子廢渣中抑菌活性成分還有待進一步分離。

目前，鴉膽子在商業(yè)上的利用主要是將鴉膽子油制成乳劑或軟膠囊，而在鴉膽子油生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量的鴉膽子廢渣，主要處理方式是將其作為畜禽飼料添加劑，不僅未能充分發(fā)揮廢渣的藥用價值，還會造成廢渣資源的大量浪費（王群，2016）。據(jù)文獻報道，鴉膽子廢渣仍具有一定的抑菌活性，鴉膽子丙酮提取物在濃度為8 mg/mL時對薯蕷炭疽菌菌絲生長有很好的抑制作用，其抑制率在80%以上（白麗莎等，2015）;鴉膽子乙醇提取物在濃度為0.1 mg/mL時對蘋果褐腐病菌、芒果炭疽病菌、番茄灰霉病菌和草莓軟腐病菌菌絲生長均有一定的抑制作用（李海燕等，2009）;對意大利青霉也具有良好的抑制作用，其最低抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MFC）分別為6.25和12.50 mg/mL（陳楚英等，2016）。鴉膽子廢渣作為生產(chǎn)廢棄物資源較豐富，且廢渣中仍含有具有抑菌作用的活性成分及大量有機質(zhì)，將其制成生物藥肥，使之合理使用，可變廢為寶，避免資源浪費。

本研究采用菌絲生長速率法和濾紙片法測定鴉膽子廢渣不同提取物及單體化合物對植物病原真菌的抑菌活性，其中，菌絲生長速率法對樣品所需量較多，抑菌活性測定結(jié)果偏高;濾紙片法對樣品所需量較少，其測定結(jié)果易受藥劑溶解后擴散能力的影響;但兩者均具有操作簡單、重現(xiàn)性好的優(yōu)點。綜合使用2種方法不僅可相互驗證測定結(jié)果，還可避免漏選有殺菌效果的植物活性成分。

4 結(jié)論

鴉膽子廢渣乙酸乙酯萃取物對多種植物病原菌具有抑菌活性，尤其對火龍果潰瘍病菌、苦瓜枯萎病菌和水稻紋枯病菌抑菌活性較強，且在紫外光和自然光條件下對火龍果潰瘍病菌的抑菌活性穩(wěn)定?？梢?，鴉膽子廢渣在植物病害防控上具有良好的應(yīng)用前景。

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（責任編輯 麻小燕）