酶法制備殼寡糖及其抗腫瘤活性評(píng)價(jià)

季 珂， 李 恒*， 龔勁松， 耿 燕， 丁振中， 蔣 敏， 許正宏， 史勁松

（1.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.揚(yáng)州日興生物科技股份有限公司，江蘇 高郵 225601；3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

殼寡糖（chitosan oligosaccharides，COS）是一種海洋來源的相對(duì)分子質(zhì)量小于3 000的低聚糖。目前，殼寡糖大都通過化學(xué)法（包括酸解法和氧化法）、物理法[1]以及酶解法（纖維素酶[2]或殼聚糖酶）降解得到。基于殼聚糖酶的專一性與高效性，用其制備殼寡糖的方法具有良好的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)和發(fā)展?jié)摿3]。

COS相對(duì)分子質(zhì)量低的特性不但改善了其原料水溶性差的問題，同時(shí)其也具有廣泛的生物功能，包括抗炎[4]、抗菌[5]、抗氧化[6]、降糖[7]及神經(jīng)保護(hù)等。近年來，針對(duì)COS抗腫瘤活性的研究逐漸成為熱點(diǎn)。

研究表明，在多株腫瘤細(xì)胞（胃癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞等）中，COS均能達(dá)到半數(shù)致死的效果[8]。相對(duì)分子質(zhì)量和去乙酰度影響其抗腫瘤活性，且低相對(duì)分子質(zhì)量表現(xiàn)出更為明顯的效果[9]。在作用機(jī)制探索方面，COS可通過誘導(dǎo)HeLa和A549細(xì)胞的自噬性死亡而抑制細(xì)胞增殖[10]，對(duì)A549細(xì)胞，COS還可明顯降低細(xì)胞線粒體膜電位水平而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[11]。此外，COS可通過上調(diào)p21，下調(diào)PCNA、cyclin A和cdk-2基因抑制HepG2細(xì)胞的DNA合成速率，抑制細(xì)胞增殖[12]；通過誘導(dǎo)SW480細(xì)胞阻滯在G2/M期而抑制細(xì)胞增殖[13]。由此可見，COS對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的作用和機(jī)制并不完全相同，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用還有待進(jìn)一步研究。

為了進(jìn)一步了解COS潛在的抗腫瘤作用，首先以殼聚糖酶酶解法自行制備COS，建立基于分級(jí)處理的COS優(yōu)化制備工藝，將獲得的低相對(duì)分子質(zhì)量COS產(chǎn)物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤活性進(jìn)行評(píng)價(jià)初篩，進(jìn)而在作用最為顯著的人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中進(jìn)行量效關(guān)系評(píng)價(jià)及初步機(jī)制探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖酶：由作者所在實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建的重組菌E.coli Rosetta-gami（DE3）/ChiE發(fā)酵產(chǎn)酶[5]，經(jīng)純化濃縮后得到殼聚糖酶酶液，酶活為2 260 U/mL；COS、氨基葡萄糖、無水乙醇、亞硫酸氫鈉、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、3，5-二硝基水楊酸、冰醋酸、Tris：購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；鹽酸阿霉素：購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；DMEM、RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、FBS胎牛血清、抗生素、胰酶、Dulbecco's Phosphate Buffered Saline（DPBS）：購(gòu) 于美國(guó)Gibco公司；納濾膜：購(gòu)于美國(guó)陶氏化學(xué)公司；Transwell小室、Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒：購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司。

質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的膠體COS溶液：取1 g COS粉末加入少量去離子水溶脹，加入30 mL的0.4 mol/L的乙酸溶液攪拌至COS粉末完全溶解，再以2 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0，加水定容至100 mL。

DNS試劑：準(zhǔn)確稱取244.4 g酒石酸鉀鈉加到500 mL煮沸的蒸餾水中溶解，然后依次加入3，5-二硝基水楊酸6.3 g、NaOH 21 g、苯酚5 g和亞硫酸氫鈉5 g，攪拌至溶解后定容至1 L，棕色瓶中貯存，一周后可使用。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計(jì)：上海Mettler-Toledo公司產(chǎn)品；紫外分光光度計(jì)：上海尤尼可儀器有限公司產(chǎn)品；數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇區(qū)富華電器有限公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)：日本日立公司產(chǎn)品；超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)沃特世公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀：上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)箱：美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品；全自動(dòng)倒置熒光顯微鏡（共聚焦超分辨成像系統(tǒng)）：日本Nikon公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 COS的酶法制備 探究酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響時(shí)，反應(yīng)體系包含制得的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%COS溶液10 mL（乙酸鈉緩沖液，pH 6.0）和0.3 mL酶液，50℃下酶解8 h，間隔1 h取樣測(cè)定還原糖含量。

探究加酶量對(duì)酶解效果的影響時(shí)，向質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的COS溶液中分別加入殼聚糖酶60、90、120、150、180 U/g。體系在50℃下酶解4 h，反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定還原糖含量。

1.3.2 DNS法測(cè)定還原糖質(zhì)量濃度 以氨基葡萄糖為標(biāo)樣，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取10 mg氨基葡萄糖，溶解定容至100 mL，再分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL，以去離子水補(bǔ)至1 mL，各加入1 mL DNS，沸水浴5 min，冷卻定容至5 mL，于540 nm處測(cè)定吸光度?？瞻捉M為同樣步驟下1 mL去離子水。

分別取1 mL酶解產(chǎn)物，加入1 mL DNS溶液，沸水浴中反應(yīng)5 min，迅速冷卻至室溫，在540 nm處測(cè)量吸光度。去離子水作為空白對(duì)照。

1.3.3 COS的制備工藝 最適酶解條件下得到的殼寡糖酶解液，經(jīng)100℃水浴15 min后10 000 r/min離心除酶。上清液加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇后4℃過夜。離心收集的上清液依次經(jīng)截留相對(duì)分子質(zhì)量3 000的膜超濾留取濾過液，經(jīng)截留相對(duì)分子質(zhì)量300的膜納濾收取截留液后，濃縮并凍干得到COS樣品。

1.3.4 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）測(cè)定COS樣品成分 液相色譜條件：色譜儀Waters acquity UPLC，檢測(cè)器Waters acquity PDA，柱溫45℃，流量0.3 mL/min，進(jìn)樣量10μL。質(zhì)譜條件：電噴霧電離（ESI+），離子源溫度100℃，脫溶劑氣溫度400℃，掃描范圍：m/z 20~2 000。

1.3.5 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞和PATU-8988細(xì)胞培養(yǎng)在含體積分?jǐn)?shù)90%RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100μg/L鏈霉素的培養(yǎng)基內(nèi)；MDA-MB-231細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM，其他條件同上。于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，每3 d傳一代。

1.3.6 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞生存率 取匯合度90%的細(xì)胞，5×103個(gè)/mL的細(xì)胞濃度鋪板至96孔板。考察1~1 000μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)COS對(duì)3株腫瘤細(xì)胞作用24 h的生存率影響。COS與阿霉素（DOX）復(fù)合給藥時(shí)，首先確定DOX質(zhì)量濃度為細(xì)胞生存率為50%所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度（IC50），即2.5 μg/mL。以質(zhì)量濃度為1、10、100、1 000μg/mL的COS作用6 h后給藥DOX孵育24 h。之后每孔加10μL CCK-8，孵育1.5 h后測(cè)A450nm。陽性對(duì)照組為DOX，空白組為培養(yǎng)基，計(jì)算細(xì)胞生存率，公式如下：

式中：V為細(xì)胞生存率，%；AP為藥物組在450 nm處吸光度；AB為空白組在450 nm處吸光度；AC為對(duì)照組在450 nm處吸光度。

1.3.7 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 匯合度90%的MDA-MB-231細(xì)胞消化后，以饑餓培養(yǎng)基重懸，以每孔1×105個(gè)接種于24孔板的小室內(nèi)。細(xì)胞完全貼壁后加入500μg/mL COS培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)基。多聚甲醛固定30 min，DPBS洗3遍，結(jié)晶紫染色30 min。用流水沖至孔板無色，將小室取出，擦凈內(nèi)部底面后倒置拍照。之后將小室放入24孔板中，每孔加1 mL體積分?jǐn)?shù)33%冰醋酸，振蕩，取200μL液體測(cè)A570nm。

1.3.8 激光共聚焦檢測(cè)細(xì)胞對(duì)DOX的攝取 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞以1×104個(gè)/mL的細(xì)胞濃度鋪板至激光共聚焦專用培養(yǎng)皿。聯(lián)用組加入500μg/mL COS 1 mL，作用4 h后再加入1 mL含有2倍終質(zhì)量濃度DOX培養(yǎng)基，對(duì)照組為DOX單獨(dú)給藥組。培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1、3、5 h。吸去培養(yǎng)基，DPBS洗1遍，經(jīng)多聚甲醛固定和DAPI染色各20 min后，DPBS洗3遍。包裹錫箔紙，避光拍照。

1.3.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。單因素?cái)?shù)據(jù)采用單向方差分析法分析。顯著性差 異 表 示 為*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。用GraphPad Prism軟件制圖分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 COS的酶法制備

考察酶解時(shí)間、加酶量對(duì)殼聚糖酶酶解的影響。如圖1所示，還原糖生成量隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)而上升。酶解4 h內(nèi)，還原糖含量快速增加，4 h之后趨于平穩(wěn)，最佳酶解時(shí)間選定4 h。由圖2可知，酶解過程中，還原糖生成量隨著加酶量的升高而逐漸增大。在加酶量為120 U/g時(shí)，還原糖生成量近最大值后穩(wěn)定。繼續(xù)增加酶量未能使還原糖質(zhì)量濃度顯著增加。最優(yōu)加酶量選擇為120 U/g。

圖1 酶解時(shí)間對(duì)COS水解效果的影響Fig.1 Effect of time on chitosan hydrolysis

圖2 加酶量對(duì)COS水解效果的影響Fig.2 Effect of ratio of enzyme and substrate dosage on chitosan hydrolysis

對(duì)酶解液逐步采用乙醇沉淀、超濾、納濾進(jìn)行分級(jí)分離，工藝流程如圖3，最終得到COS產(chǎn)物，得率約41%。

圖3 COS的制備工藝Fig.3 Protocol of COSpreparation

2.2 COS組成分析

采用LC-MS法分析COS產(chǎn)物組成。液相色譜圖中對(duì)應(yīng)3個(gè)保留時(shí)間有吸收峰（見圖4（a）），分別是5.21、6.90、8.36 min。分別對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜分析，在ESI+模式下，質(zhì)荷比m/z 341.1、363.1（見圖4（b））對(duì)應(yīng)[殼二糖+H]+、[殼二糖+Na]+的分子離子峰，502.2、524.2（見圖4（c））對(duì)應(yīng)[殼三糖+H]+、[殼三糖+Na]+的分子離子峰，663.3、685.3（見圖4（d））對(duì)應(yīng)[殼四糖+H]+、[殼四糖+Na]+的分子離子峰。依此判斷所得COS產(chǎn)物的主要組分為殼二糖、殼三糖和殼四糖。進(jìn)一步通過峰面積積分計(jì)算可知，所得COS組分中殼二糖、殼三糖和殼四糖相對(duì)含量的比例約為3∶5∶2。

圖4 COS的液相色譜-質(zhì)譜圖Fig.4 Liquid chromatography-mass spectrometry profile of COS

通過自行構(gòu)建的殼聚糖酶酶解，以及多級(jí)分級(jí)處理工藝獲得了低相對(duì)分子質(zhì)量的COS，為后續(xù)抗腫瘤活性的分析提供了更為明確和簡(jiǎn)單的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.3 COS抗腫瘤作用評(píng)價(jià)

2.3.1 COS對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抑制活性 研究COS對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2、人乳腺癌細(xì)胞MDAMB-231和人胰腺癌細(xì)胞PATU-899生長(zhǎng)的影響（見圖5）。在給藥質(zhì)量濃度0~1 000μg/mL情況下，未觀察到3株腫瘤細(xì)胞有生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象，可以認(rèn)為低質(zhì)量濃度的COS對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)影響甚微。

圖5 COS對(duì)腫瘤細(xì)胞生存率的影響Fig.5 Effect of COSadministrated against various tumor cell lines

類似的結(jié)果在前期A549和HCT-116細(xì)胞的研究中也有報(bào)道。4種來源不同的COS作用時(shí)，高質(zhì)量濃度（1.25~20 mg/mL）明顯抑制細(xì)胞增長(zhǎng)，而低質(zhì)量濃度（0.078 125~1.25 mg/mL）呈現(xiàn)負(fù)抑制作用[8]。其中相對(duì)分子質(zhì)量在1 500~2 000的COS樣品即使在高質(zhì)量濃度（1.25~20 mg/mL）下對(duì)A549細(xì)胞依然無細(xì)胞毒性。綜觀已報(bào)道的研究結(jié)果，多數(shù)報(bào)道可顯著抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的研究中使用的COS質(zhì)量濃度較高，如相對(duì)分子質(zhì)量1 000~3 000的COS在質(zhì)量濃度5.0 mg/mL時(shí)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞抑制效果最佳[14]；2~5 mg/mL的COS對(duì)HepG2細(xì)胞抑制率有劑量依賴關(guān)系[15]。COS的腫瘤抑制活性因自身相對(duì)分子質(zhì)量、給藥質(zhì)量濃度以及評(píng)價(jià)用細(xì)胞株的不同而各異，因此有必要進(jìn)行更為細(xì)致地考察和分析。

2.3.2 COS聯(lián)合DOX對(duì)不同癌細(xì)胞的抑制活性近期研究發(fā)現(xiàn)，在多株骨肉瘤細(xì)胞中，甘露糖與DOX或順鉑聯(lián)用可通過下調(diào)Bcl-2家族的Mcl-1和Bcl-XL蛋白質(zhì)表達(dá)水平而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)在凋亡途徑，提高抗腫瘤作用[16]。DOX是治療乳腺癌、肝癌等實(shí)體瘤的一種常用化療藥物[17]。DOX的非靶向性可對(duì)正常細(xì)胞造成損傷[18]。因此，新的方案建議可與其他藥物或天然產(chǎn)物聯(lián)用降低用藥量以減少其副作用[19]。受此啟示，將COS與DOX復(fù)合給藥以評(píng)價(jià)其效果。如圖6所示，相較于DOX組50%的細(xì)胞生存率，COS僅在人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231上表現(xiàn)出增強(qiáng)DOX抑制作用的效果，且在較低質(zhì)量濃度下細(xì)胞生存率可下降20%~30%。由此選定MDA-MB-231細(xì)胞為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的模型，進(jìn)一步探討復(fù)合給藥的效果和機(jī)制。

圖6 復(fù)合給藥對(duì)腫瘤細(xì)胞生存率的影響Fig.6 Effect of combination treatment on tumor cell viability

2.3.3 COS作用時(shí)間對(duì)其聯(lián)合DOX抑制MDAMB-231細(xì)胞生存率的影響 在MDA-MB-231細(xì)胞中，進(jìn)一步分析COS作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞生存率的影響。由圖7所示，與初始狀態(tài)下的細(xì)胞生存率相比（見圖7（a）），COS短時(shí)間作用后細(xì)胞生存率顯著降低，表現(xiàn)出增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)DOX敏感性的能力。其中，給藥時(shí)間4 h條件下（見圖7（b）），COS質(zhì)量濃度在0~125μg/mL時(shí)細(xì)胞生存率呈質(zhì)量濃度依賴性下降，250~1 000μg/mL時(shí)趨于平穩(wěn)，與陽性藥物DOX組相比均有極大的顯著性差異（***P<0.001）；作用8 h（見圖7（c）），COS質(zhì)量濃度在0~125μg/mL時(shí)細(xì)胞生存率約下降20%，與DOX組相比有較大顯著性差異（**P<0.01），增大質(zhì)量濃度在250~1 000μg/mL時(shí)有顯著性差異（*P<0.05）。繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間至12 h并不能降低細(xì)胞的生存率（見圖7（d））。COS在MDA-MB-231細(xì)胞中增強(qiáng)其對(duì)阿霉素敏感性的機(jī)制有待進(jìn)一步分析。

圖7 COS作用時(shí)間對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞生存率的影響Fig.7 Effect of COStreated time on MDA-MB-231 cells viability

2.4 COS聯(lián)合DOX抑制MDA-MB-231細(xì)胞生存率的機(jī)制初探

2.4.1 COS對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響考慮到MDA-MB-231細(xì)胞的高遷移特性，首先以小室遷移實(shí)驗(yàn)體外考察COS能否抑制腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散。如圖8所示，500μg/mL COS作用后，相較于空白對(duì)照組（NC），COS組的細(xì)胞遷移數(shù)量明顯減少（**P<0.01）。說明COS可有效抑制MDA-MB-231細(xì)胞遷移，這與Nam等[20]報(bào)道的研究現(xiàn)象一致。此外，COS抑制腫瘤細(xì)胞遷移的現(xiàn)象也存在于成纖維HT1080細(xì)胞[21]和MCF-10A乳腺上皮細(xì)胞[22]。由此確認(rèn)了COS抑制腫瘤細(xì)胞遷移的作用。

圖8 COS抑制MDA-MB-231細(xì)胞的小室遷移分析Fig.8 Transwell migration assay of MDA-MB-231 cells with COS

2.4.2 COS對(duì)DOX入核的影響 DOX作用于腫瘤細(xì)胞時(shí)，作為拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑，進(jìn)入細(xì)胞核干擾DNA復(fù)制而發(fā)揮作用[21]。借助DOX自帶紅色熒光的特點(diǎn)，通過激光共聚焦顯微鏡觀察復(fù)合COS給藥時(shí)，MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)DOX的攝取效果，結(jié)果如圖9所示。隨著DOX作用時(shí)間的延長(zhǎng)，無論是否給藥COS，細(xì)胞內(nèi)DOX熒光強(qiáng)度均呈時(shí)間依賴性增強(qiáng)。進(jìn)一步與復(fù)合給藥相比，1 h時(shí)，兩組都觀察到輕微的DOX入核量，且差異不明顯。而在3 h時(shí)，COS與DOX復(fù)合給藥組較DOX單獨(dú)給藥組顯示出更強(qiáng)的核內(nèi)紅色熒光。5 h時(shí)，兩組的細(xì)胞核內(nèi)紅色熒光均達(dá)到最強(qiáng)但無顯著差異。由此說明，COS具有促進(jìn)DOX快速富集于MDA-MB-231細(xì)胞核的作用。推測(cè)這一過程可能與COS帶正電荷有關(guān)，由于靜電作用靶向改變了腫瘤細(xì)胞膜表面負(fù)向電子流，從而影響信號(hào)傳導(dǎo)通路[23]。此外，COS的這種增強(qiáng)DOX誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用也在負(fù)載DOX的含COS納米材料中被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道[24]。

圖9 MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)DOX的攝取Fig.9 Uptakeof DOX incubation with MDA-MB-231cells

總結(jié)以上結(jié)果可以推測(cè)，在MDA-MB-231細(xì)胞中，COS與DOX的復(fù)合給藥通過抑制腫瘤細(xì)胞遷移，并促進(jìn)陽性藥物DOX的入核而發(fā)揮抗腫瘤活性。二者的聯(lián)用具有一定協(xié)同增效作用。

3 結(jié) 語

COS具有良好的生物相容性和廣泛的生物學(xué)活性。COS的抗腫瘤作用是研究的熱點(diǎn)，但其作用與機(jī)制因糖的組成以及細(xì)胞種類等而各異，有必要進(jìn)一步在特定細(xì)胞上探討COS的作用與機(jī)制。

基于前期在細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)的糖與化療藥物聯(lián)用提高藥效的研究結(jié)果[16]，本研究中在酶法制備得到聚合度2~4的低相對(duì)分子質(zhì)量COS的基礎(chǔ)上，采用COS與DOX復(fù)合給藥的方式評(píng)價(jià)COS的抗腫瘤作用。體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，單獨(dú)給藥低質(zhì)量濃度COS對(duì)所選用的3株腫瘤細(xì)胞并無顯著抑制效果；當(dāng)與DOX復(fù)合給藥時(shí)，低質(zhì)量濃度COS即可顯著降低人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞生存率。進(jìn)一步的機(jī)制分析推測(cè)了COS可通過抑制人乳腺癌細(xì)胞遷移，同時(shí)促進(jìn)DOX入核而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性，發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤特性。這為功能糖等膳食補(bǔ)充劑與化療藥物聯(lián)用的治療方案提供了數(shù)據(jù)參考和理論支撐。

由于COS的抗腫瘤作用與機(jī)制較為復(fù)雜，受糖本身性質(zhì)以及細(xì)胞株影響較大，未來對(duì)于COS抗腫瘤作用的深入解析還有待從特定糖的結(jié)構(gòu)、糖與細(xì)胞作用的靶點(diǎn)、可能影響的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路等分子水平進(jìn)一步闡釋和驗(yàn)證。