氨基甲酸乙酯降解酶的固定化研究

周雪燕， 石 淼， 康 寧， 王 壹， 王曉茜， 郭曉豐， 王 斌， 史學(xué)偉

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832003）

固定化生物技術(shù)是使水溶性的細(xì)胞/酶與水不溶載體在物理或化學(xué)方法的作用下成為水不溶性細(xì)胞/酶的一類技術(shù)。酶固定化技術(shù)是用固體材料將游離的酶束縛或限制于一定區(qū)域，但仍具有催化活性并可重復(fù)使用的一種技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是：1）與游離酶相比，酶穩(wěn)定性更高；2）可重復(fù)使用，節(jié)約資源；3）易于從目標(biāo)物中實(shí)現(xiàn)分離；4）酶活性保留時(shí)間長(zhǎng)；5）環(huán)保，對(duì)產(chǎn)物的影響較小。但也存在以下幾點(diǎn)不足：對(duì)固定化技術(shù)要求高，增加成本；制備過程酶活受影響；固定化酶的效果受多種因素影響因而存在較大差異。

自1910年酶的固定化研究開始，酶的固定化技術(shù)也得到了很好的發(fā)展，尤其是酶的固定化新型載體層出不窮。人們常根據(jù)不同的應(yīng)用需求選擇不同的固定化載體，不僅要求它的固定化性能好，還有一些實(shí)際應(yīng)用的要求[1-4]。比如食品領(lǐng)域就要求高安全性能、無污染性、經(jīng)濟(jì)實(shí)用性等。根據(jù)固定化載體的組成成分可將其基本分為以下3大類：無機(jī)載體（硅藻土、活性炭、多孔陶瓷、玻璃等[5-6]）、天然高分子材料（殼聚糖、淀粉、海藻酸鈉、纖維素等[7-8]）和合成有機(jī)材料（常見的有聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、氧化石墨烯等[3，9-10]）。依據(jù)酶與載體的結(jié)合方式可將酶的固定化方法分為4類：吸附法是依靠帶電的酶與載體之間的靜電作用，使酶吸附于載體表面上的一種方法[11-12]。包埋法是將酶用物理的方法包埋在各種載體（網(wǎng)格或半透膜）內(nèi)，此法是目前應(yīng)用最多的一種理想的固定化方法[12]。交聯(lián)法是借助雙功能試劑使酶分子和載體之間發(fā)生交聯(lián)的一種固定化方法，此法固定的酶具有良好的穩(wěn)定性，常用的雙功能試劑有戊二醛、甲醛、京尼平、雙偶氮苯等[13]。共價(jià)偶聯(lián)法是借助共價(jià)鍵將載體的功能基團(tuán)（芳香氨基、羥基、羧甲基等）和酶的活性非必需側(cè)鏈基團(tuán)（羧基、巰基、羥基、酚羥基和咪唑基等）進(jìn)行偶聯(lián)的一種方法[14]。

在已有的報(bào)道中對(duì)固定化酶有如下研究：彭虹旎等以氨基多糖為材料，戊二醛為交聯(lián)劑制備了表面光滑氨基多糖微球載體和多孔氨基多糖微球載體。以此載體對(duì)脲酶進(jìn)行固定化，結(jié)果表明：多孔微球載體的固定化效率和固定化酶活力均高于表面光滑微球載體，因其固定的酶量更多，故表現(xiàn)出更高的酶活力[15]。2015年，王簡(jiǎn)之等使用磁性復(fù)合微球?qū)χ久高M(jìn)行固定化，得到的固定化脂肪酶在熱穩(wěn)定性、酸堿耐受性、重復(fù)使用率方面有所提升。在pH 4.0，共價(jià)固定6 h后，固定化脂肪酶的酶活損失低于40%[16]。有研究者將甲基丙烯、間苯二胺水凝膠、殼聚糖和氧化石墨烯反應(yīng)制備復(fù)合材料，制得的復(fù)合凝膠在機(jī)械強(qiáng)度和吸附能力方面都有所提升[17]。

固定化酶在提高食品利用率和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值方面有突出貢獻(xiàn)，比如固定化淀粉酶可以將淀粉分解為易被人體吸收的短鏈小分子糖[18-19]；固定化脂肪酶可用于代可可脂的脫脂；而研究較多的固定化脲酶已應(yīng)用于酒精飲料中尿素和EC的去除，可以提升發(fā)酵飲品的飲用安全性[20-21]。為了充分發(fā)揮脲酶的實(shí)用價(jià)值，國(guó)內(nèi)外研究者已對(duì)脲酶的固定化進(jìn)行了不少探索[14，20，22]，而直到近幾年，國(guó)內(nèi)學(xué)者才逐漸展開對(duì)EC降解酶的固定化研究。趙雅敏對(duì)篩選到的產(chǎn)EC降解酶的菌株LBMAE-8進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)對(duì)該菌進(jìn)行細(xì)胞固定化處理，殼聚糖/海藻酸鈣微膠囊一步法比海藻酸鈣包埋法制得的固定化細(xì)胞的酶活回收率高[23]。張遷等將來自P.rettgeri JN-B815的酸性脲酶經(jīng)乙醇沉淀、離子交換等純化后用殼聚糖微球進(jìn)行固定化，制備的固定化酸性脲酶的溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性及對(duì)黃酒中尿素和EC的去除率均有所提升[24]。劉小鋒使用氧化石墨烯（GO）和殼聚糖（CS）復(fù)合微球?qū)λ嵝噪迕高M(jìn)行固定化，在流化床反應(yīng)器中考察固定化酸性脲酶對(duì)黃酒的處理效果，該酶對(duì)黃酒中尿素的去除率高達(dá)93.85%，而對(duì)EC的去除率達(dá)到57.46%[25]。

固定化酶的酶活力、底物親和力、米氏常數(shù)、反應(yīng)活化能等性質(zhì)會(huì)由于酶的性質(zhì)、載體材料的性質(zhì)及包埋條件的不同而發(fā)生改變，因此，一般對(duì)載體材料和固定化方法經(jīng)過實(shí)驗(yàn)摸索才能確定最佳方案。通過篩選產(chǎn)EC降解酶的微生物并優(yōu)化其產(chǎn)酶條件，從而獲得一定數(shù)量的EC降解酶并將其應(yīng)用于國(guó)內(nèi)酒精飲料中EC含量的降低成為目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

作者圍繞固定化EC降解酶的固定條件、酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用展開研究，為保障發(fā)酵飲品的安全性提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取經(jīng)活化和優(yōu)化培養(yǎng)的CAT-4（Kluyveromyces marxianus）酵母菌株作為出發(fā)菌株，取其發(fā)酵液通過反復(fù)凍融結(jié)合超聲破碎法得到EC降解酶粗酶液，待用。

乙醇（色譜純）：天津致遠(yuǎn)公司產(chǎn)品；氨基甲酸乙酯、正丙基甲酸酯：Sigma-aldrich公司產(chǎn)品；其余溶劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DVB/CAR/PDMS（50/30μm）SPME萃 取 頭、7890 B-5977 A氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；FRESCO21高速冷凍離心機(jī)：Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；AS-4S超聲細(xì)胞破碎儀：寧波新芝生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；722型可見分光光度計(jì)：上海佑科儀器儀表有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 微球載體的制備及交聯(lián)條件的優(yōu)化

1）滴入法[26]制備殼聚糖微球 稱取0.5 g殼聚糖溶解于50 mL體積分?jǐn)?shù)1.0%的醋酸溶液中，置于搖床上活化2 h，將活化的殼聚糖用注射器逐滴加入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%NaOH和體積分?jǐn)?shù)30%CH3OH的凝結(jié)液中，挑選出粒度均勻、形狀規(guī)整的殼聚糖微球，用去離子水洗至中性，冷藏備用。

2）戊二醛交聯(lián)殼聚糖載體的制備 將上述制備的微球置于體積分?jǐn)?shù)6%戊二醛溶液中，在30℃恒溫水浴鍋中振蕩6 h。反應(yīng)完成后，用去離子水反復(fù)洗滌，以去除剩余的戊二醛，直至洗滌液在280 nm處的吸光度小于0.01，即得戊二醛交聯(lián)殼聚糖微球載體。

3）粗酶液的制備及EC降解酶的固定化 取一定量戊二醛交聯(lián)殼聚糖微球載體，加入適量CAT-4菌株產(chǎn)生的粗酶液，置于30℃恒溫水浴搖床上振蕩1 h。分離棄去上層溶液，用去離子水反復(fù)洗滌沉淀物，得到后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用的固定化EC降解酶。

4）戊二醛體積分?jǐn)?shù)對(duì)載體制備的影響 配制體積分?jǐn)?shù)2%、3%、4%、5%、6%和7%的戊二醛溶液，用注射器將冷藏的殼聚糖微球緩慢滴加至不同體積分?jǐn)?shù)的戊二醛溶液中，使其形成直徑均勻的微球，在30℃恒溫水浴鍋中振蕩6 h。反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水反復(fù)洗滌，直至洗滌液在280 nm處的吸光度小于0.01，即得戊二醛交聯(lián)殼聚糖微球載體，置于4℃冰箱保存。用羥胺法[27]測(cè)其懸掛醛基質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

5）戊二醛交聯(lián)時(shí)間對(duì)載體制備的影響 用注射器將冷藏的殼聚糖微球緩慢滴加至體積分?jǐn)?shù)為6%的戊二醛溶液中，使其形成形狀規(guī)整、均勻的微球，在30℃恒溫水浴鍋中振蕩2、4、6、8、10 h。其余操作同1.3.1中4）。

1.3.2 酶活力的測(cè)定 分別將1 mL粗酶液或1 g固定化EC降解酶和超純水加到2支裝有1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%EC溶液的10 mL比色管中，將比色管置于37℃水浴鍋中反應(yīng)15 min后加入1 mL終止劑，充分混勻后依次加入各1 mL的顯色劑I和顯色劑II，強(qiáng)烈振蕩后繼續(xù)置于37℃水浴條件下保溫20 min，用超純水定容至刻度線，測(cè)定并記錄A625nm值。酶活計(jì)算公式如下：

式中：M為酶活力；ΔA625nm為反應(yīng)結(jié)束后空白對(duì)照與樣品測(cè)定的光密度值之差；n為待測(cè)樣液的稀釋倍數(shù)；k為NH4+標(biāo)準(zhǔn)曲線中斜率的倒數(shù)[28]。

1.3.3 EC去除率的測(cè)定

1）相圖的制作 參考文獻(xiàn)[29]使用濁度滴定法測(cè)定雙水相體系的二元曲線。具體做法如下：將乙醇逐滴加入盛有已知濃度K2HPO4溶液的玻璃容器中，直到在25℃時(shí)形成界限清晰的兩相體系。記錄此時(shí)乙醇和K2HPO4組成。在此基礎(chǔ)上，將去離子水滴加到玻璃容器中，得到一個(gè)清晰的單相體系，繼續(xù)滴加乙醇，再形成兩相體系，如此反復(fù)。接著用不同質(zhì)量濃度的K2HPO4重復(fù)上述步驟，記錄數(shù)據(jù)。

2）乙醇和K2HPO4雙水相體系（ATPS）提取“美樂”葡萄酒中EC 圖1顯示了用乙醇和K2HPO4雙水相體系提取EC的原理。以含50μg/L EC和100 μg/L正丙基甲酸酯（PC）的體積分?jǐn)?shù)55%乙醇溶液作為模型溶液，用酒石酸和NaOH調(diào)節(jié)pH并記錄當(dāng)前的pH。

圖1 用ATPS提取“美樂”葡萄酒中EC的原理圖Fig.1 Schematic diagram for extracting EC in‘Merlot’wine using ATPS

量取5 mL模型溶液和過量的K2HPO4固體加入離心管中，混勻后以4 000 r/min離心5 min，以確保兩相完全分離。將離心管置于25℃恒溫水浴中持續(xù)3.5 h達(dá)到相平衡。記錄頂相體積并取1.5 mL的頂部溶液與150 mg無水硫酸鎂完全混合，在轉(zhuǎn)速為12 000 r/min的條件下離心1 min。最后，將1 mL上清液通過0.45μm膜過濾，用于GC-MS分析。

3）EC的GC-MS檢測(cè)[30]使用Agilent 7890B GC-5977A MS系統(tǒng)進(jìn)行EC的定量和定性分析。氣相色譜柱為Carbowax 20M（30 m×0.25μm×0.25 mm），以氦氣為載氣，流量為1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度200℃，檢測(cè)器溫度250℃。柱溫采用程序升溫：初始溫度50℃保留1 min，以3℃/min升至180℃保留1min，然后以20℃/min升至220℃，保留10min。

質(zhì)譜條件：以氦氣為載氣，采用電子轟擊源（EI）的電離模式，電子能量70 eV；四級(jí)桿溫度150℃；離子源溫度230℃；選取離子監(jiān)測(cè)（SIM）模式，選擇質(zhì)荷比（m/z）分別為62、74和89作EC的監(jiān)測(cè)離子，m/z為62作定量離子；選擇m/z分別為59、62和89來監(jiān)測(cè)PC，m/z為62作定量離子。

1.3.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)

1）香氣化合物提取 根據(jù)頂空固相微萃取法（HS-SPME）改進(jìn)的方法[31]提取揮發(fā)性風(fēng)味化合物，并用GC/MS進(jìn)行分析。將10 mL“美樂”葡萄酒樣品和3.6 g NaCl放入15 mL萃取瓶中，再加入20μL 20 mg/L的3-辛醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。萃取瓶用內(nèi)襯密封，樣品在45℃下平衡20 min，微萃取在45℃、500 r/min的攪拌下持續(xù)60 min。萃取結(jié)束將萃取頭插入進(jìn)樣口解吸5 min。

2）色譜條件 用Agilent 7890 B氣相色譜儀與5977 A質(zhì)譜儀進(jìn)行GC-MS分析。色譜柱型號(hào)HPInnowax column柱（60 m×2.5 mm×0.25μm），載氣是流量為1 mL/min的氦氣，進(jìn)樣口溫度230℃。柱溫采用程序升溫：初始溫度50℃保留5 min，以3℃/min升至125℃保留3 min，然后以2℃/min升至180℃保留3 min，最后以15℃/min升至230℃保留15 min。

質(zhì)譜儀在電子轟擊源（EI）的電離模式下運(yùn)行，使用間隔為0.2 s的全掃描模式（掃描范圍m/z 40~450），離子源溫度200℃[32]。

定性和定量分析：通過將各組分峰中的化合物與NIST14.L譜庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)化合物進(jìn)行匹配，并將得到的質(zhì)譜和保留指數(shù)（RI）與NIST14.L譜庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)化合物進(jìn)行比較。用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各組分的相對(duì)含量[33]，結(jié)果表示為3個(gè)重復(fù)的“美樂”葡萄酒樣品的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用Excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）。采用Origin Pro 8.5進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖載體交聯(lián)條件的優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 交聯(lián)劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)載體制備的影響 殼聚糖微球載體懸掛醛基的數(shù)量與其固定化酶能力的強(qiáng)弱有關(guān)。不同體積分?jǐn)?shù)的戊二醛對(duì)殼聚糖微球載體上懸掛醛基質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響見圖2。

圖2 戊二醛溶液體積分?jǐn)?shù)對(duì)懸掛醛基的影響Fig.2 Impact of glutaraldehyde concentration on the suspended aldehyde group

由圖可知，在一定范圍內(nèi)，隨著戊二醛溶液體積分?jǐn)?shù)的增加，載體上的懸掛醛基質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈上升趨勢(shì)，但是當(dāng)戊二醛溶液體積分?jǐn)?shù)達(dá)到5%時(shí)，載體上懸掛醛基質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)2.4%，之后隨戊二醛體積分?jǐn)?shù)增加，載體上懸掛醛基反而趨于平穩(wěn)。使用不同加酶量，測(cè)得數(shù)據(jù)與此一致。結(jié)果說明，體積分?jǐn)?shù)5%的戊二醛溶液已經(jīng)可以提供足夠多數(shù)量的醛基與殼聚糖載體上的氨基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，此時(shí)載體對(duì)酶的固定量達(dá)到最大[34]。因此載體制備時(shí)選用體積分?jǐn)?shù)為5%的戊二醛溶液作交聯(lián)劑即可。

2.1.2 交聯(lián)時(shí)間對(duì)載體制備的影響 如圖3所示，在2~8 h范圍內(nèi)，載體上的懸掛醛基隨交聯(lián)時(shí)間的增加而增加；當(dāng)交聯(lián)時(shí)間達(dá)到8 h后，懸掛醛基的質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本保持不變。說明8 h的交聯(lián)時(shí)間足以使戊二醛溶液中的醛基與載體上的氨基充分反應(yīng)，使載體對(duì)酶的固定量最大。因此，選擇8 h作為殼聚糖微球載體和戊二醛溶液的交聯(lián)時(shí)間。

圖3 交聯(lián)時(shí)間對(duì)懸掛醛基的影響Fig.3 Impact of cross-linking time on the suspended aldehyde group

2.2 固定化EC降解酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 固定化EC降解酶的最佳反應(yīng)溫度及其穩(wěn)定性 如圖4所示，通過游離酶和固定化酶在30、36、42、48、54、60、66℃和72℃條件下的酶活結(jié)果可知，它們的最適溫度分別為30℃和42℃。固定化酶在30~42℃酶活性逐漸增高，最適溫度比游離酶略高；在42℃以后降解EC能力逐漸降低，與酶活呈下降趨勢(shì)的游離酶變化基本一致；但固定化酶的酶活在42~72℃均高于游離酶。

圖4 固定化EC降解酶的最適溫度及其穩(wěn)定性Fig.4 Optimal temperature and its stability of immobilized urethanase

出現(xiàn)最適溫度轉(zhuǎn)移可能是由于EC降解酶的空間結(jié)構(gòu)受到固定化載體的影響而略有改變，尤其是在42℃以后，固定化EC降解酶的空間結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，催化底物能力比游離酶略高。也有其他研究結(jié)果表明固定化脲酶與游離酶的最適催化溫度有所差異[35-36]，但二者的催化效果并不存在顯著差異。

穩(wěn)定性結(jié)果顯示，固定化EC降解酶在42℃條件下存放24 h后相對(duì)酶活仍能達(dá)到60%以上，說明固定化EC降解酶能夠耐受一定范圍的溫度，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性較好，在室溫環(huán)境下無需低溫保護(hù)，是一種環(huán)境友好型固定化酶。

2.2.2 固定化EC降解酶的最適pH及其穩(wěn)定性從圖5可以看出，在pH為3.0、3.3、3.6、3.9、4.2、4.5和4.8的條件下，游離酶和固定化酶催化底物EC的最適pH有所偏離，游離EC降解酶對(duì)pH 4.5的EC溶液具有最大的催化活性，且在pH 3.0~4.5酶活性逐漸增加，相對(duì)酶活在30%~100%之間；固定化EC降解酶的最適pH為3.6~3.9，且在此范圍內(nèi)酶活性均高于游離酶，尤其在pH 3.6左右表現(xiàn)出最大催化活性。

圖5 固定化EC降解酶的最適p H及其穩(wěn)定性Fig.5 Optimal pH and its stability of immobilized urethanase

穩(wěn)定性結(jié)果顯示，固定化酶在最適pH條件下反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，相對(duì)酶活性的下降速度越快，尤其是12~24 h期間的相對(duì)酶活變化率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于0~12 h的變化率。固定化酶在pH 3.6條件下放置24 h之后的酶活損失率不超過40%，說明固定化EC降解酶的耐酸性較游離酶好，更適于復(fù)雜環(huán)境的操作。之前就有研究將以京尼平為交聯(lián)劑與來源于普羅維登斯菌（Providencia rettgeri JN-B815）的酸性脲酶進(jìn)行交聯(lián)，發(fā)現(xiàn)此交聯(lián)酶能夠適應(yīng)黃酒的復(fù)雜微環(huán)境并去除尿素和EC[37]。2.2.3 固定化EC降解酶的乙醇耐受性 EC降解酶的乙醇耐受性在酒精飲料的應(yīng)用中非常重要。從圖6可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，游離酶和固定化EC降解酶酶活均隨之下降，但固定化EC降解酶對(duì)乙醇表現(xiàn)出良好的耐受性。在乙醇體積分?jǐn)?shù)為7%~25%時(shí)，固定化EC降解酶酶活均能保留50%以上，同游離酶的乙醇耐受性相比，變化有一定差異，初步推測(cè)此固定化方法對(duì)其乙醇耐受性和酶活提高有一定影響。說明此固定化EC降解酶與游離酶相比，在乙醇體積分?jǐn)?shù)相對(duì)較低時(shí)可以保持相對(duì)較高的酶活[37]，適用于乙醇體積分?jǐn)?shù)相對(duì)較低的發(fā)酵酒精飲料。

圖6 乙醇對(duì)固定化EC降解酶酶活的影響Fig.6 Effect of ethanol on urethanase enzymatic activity

2.2.4 固定化EC降解酶的重復(fù)使用性 如圖7所示，在模擬酒樣對(duì)固定化EC降解酶進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，每次使用后酶活均有下降。當(dāng)重復(fù)使用8次以后，固定化EC降解酶酶活力保留在50%以上，因此在8次前使用效果較好。

圖7 固定化EC降解酶的重復(fù)使用次數(shù)Fig.7 Reusability of immobilized urethanase

此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的GO-CS復(fù)合固定酸性酶使用10次時(shí)的酶活80%相比，可使用次數(shù)稍顯劣勢(shì)[25]，但就所得固定化酶而言，仍然可以考慮將使用次數(shù)盡量控制在8次以內(nèi)以獲得更好的效果。

2.2.5 固定化EC降解酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性 固定化EC降解酶在不同儲(chǔ)存溫度隨貯藏時(shí)間的酶活變化如圖8所示。在4℃條件下，酶活隨時(shí)間逐漸降低，酶活降低速率在1~3周和4~6周的變化都較平穩(wěn)，而在3~4周的變化最大；且貯藏6周之內(nèi)，酶活損失不足30%。在20℃條件下，酶活隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低，至第5周時(shí)基本保持不變，但在貯藏6周之后，酶活僅達(dá)到60%。說明貯藏溫度對(duì)固定化EC降解酶的酶活有一定影響，但不是唯一因素。因此在該實(shí)驗(yàn)條件下，盡量將固定化酶保藏在4~20℃，但基于固定化酶最適反應(yīng)溫度和出于經(jīng)濟(jì)節(jié)約方面的考慮，以20℃作為最佳貯藏溫度條件。

圖8 固定化EC降解酶儲(chǔ)存穩(wěn)定性Fig.8 Storage stability of immobilized urethanase

2.3 固定化酶對(duì)“美樂”葡萄酒的影響

2.3.1 固定化酶在“美樂”葡萄酒中的穩(wěn)定性 如圖9所示，隨著靜置時(shí)間增加，游離酶和固定化EC降解酶酶活均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但在整個(gè)過程中，固定化酶酶活均高于游離酶酶活。當(dāng)靜置96 h時(shí)，固定化酶酶活與游離酶酶活相差最大，相較于起初酶活差異，后期的差異更大，可能是由于相同酶量的條件下，起初游離酶更容易與底物接觸，而隨著時(shí)間推移，固定化酶由于載體的保護(hù)作用，仍能慢慢顯示出較高的酶活性。靜置144 h之前，固定化酶酶活的損失率在50%以下，說明此酶可以適應(yīng)“美樂”葡萄酒的微環(huán)境，用于葡萄酒中EC的去除。

圖9 “美樂”葡萄酒中固定化EC降解酶酶活的變化Fig.9 Changes of immobilized urethanase activity in‘Merlot’wine

2.3.2 固定化酶對(duì)“美樂”葡萄酒中EC的去除率“美樂”葡萄酒樣品中添加等量酶活的固定化EC降解酶和游離酶一段時(shí)間后，樣品中EC質(zhì)量濃度逐漸降低。

從圖10可以看出，樣品中加酶處理后，處理組的EC質(zhì)量濃度均低于對(duì)照組，處理組的EC去除率高于對(duì)照組，說明無論是游離還是固定化EC降解酶的處理，均使“美樂”葡萄酒中EC質(zhì)量濃度得到了降低，但游離酶酶法去除EC的效果要優(yōu)于固定化酶處理法。在該實(shí)驗(yàn)條件下，固定化EC降解酶對(duì)“美樂”葡萄酒中EC的去除率可達(dá)30.90%，是游離酶的81.53%。

圖10 游離和固定化EC降解酶去除EC的效果Fig.10 Influence of free and immobilized urethanase on EC

2.3.3 固定化酶對(duì)“美樂”葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)的影響 葡萄酒的風(fēng)味不是獨(dú)立存在的，而是由醇、酯、酸、醛、酮、萜類化合物和C13-萜烯類化合物相互協(xié)調(diào)而產(chǎn)生的，它們共同構(gòu)成了葡萄酒香氣的組成成分[38]。對(duì)“美樂”葡萄酒中香氣化合物及其相對(duì)含量進(jìn)行了定性和定量分析。

對(duì)照組和處理組的葡萄酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量如表1所示，在3種處理方式下的葡萄酒中，共檢測(cè)到29種香氣成分，包括12種酯類、9種醇類、3種有機(jī)酸和5種醛、酮、酚類。經(jīng)分析可知，不同處理組中各揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量之間無顯著差異，但是相較于對(duì)照組，處理組的物質(zhì)種類均有所減少，其中固定化酶處理組減少了8種物質(zhì)，而游離酶處理組減少了12種物質(zhì)。說明酶處理對(duì)葡萄酒中揮發(fā)性物質(zhì)的種類數(shù)量有些許影響，但對(duì)化合物的相對(duì)含量影響不顯著，而且，固定化酶處理方式對(duì)葡萄酒更加友好。相比對(duì)照組，酶處理組中的物質(zhì)均出現(xiàn)了數(shù)量的減少，但消失的物質(zhì)并不相同，固定化酶處理組減少的物質(zhì)包括：香茅醇、正癸醛、己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸己酯、乙酸苯乙酯和異丙醇。而游離酶處理組減少的物質(zhì)分別是香茅醇、β-大馬士酮、糠醛、正癸醛、己酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、丁二酸二乙酯、2，3-丁二醇、異丙醇、1-己醇。說明不同類型的酶處理對(duì)葡萄酒的影響不同，但考慮到游離酶引起芳香味和果香味物質(zhì)的損失更大，由于在考慮風(fēng)味復(fù)雜性時(shí)要避免不愉快風(fēng)味的發(fā)展，因此建議對(duì)“美樂”葡萄酒使用固定化EC降解酶進(jìn)行處理。

此外，不同處理組測(cè)得的揮發(fā)性風(fēng)味化合物的組成也有明顯不同。表1和圖11顯示了“美樂”葡萄酒中不同酶處理方式下主要揮發(fā)性香氣成分（醇、酯類、酸和醛）的變化規(guī)律。

圖11 “美樂”葡萄酒中揮發(fā)性風(fēng)味化合物的成分組成Fig.11 Composition of volatile flavor compounds in‘Merlot’wine

表1 不同酶處理方式對(duì)“美樂”葡萄酒中揮發(fā)性化合物的影響Table 1 Effects of different enzyme treatment on volatile compounds in‘Merlot’wine

由C6化合物、揮發(fā)性酚類物質(zhì)和苯類化合物組成的香氣成分在“美樂”葡萄酒中隨著酶處理方式的不同而呈現(xiàn)出不同的趨勢(shì)。酶處理后醇類和醛類占比降低，而酯類和酸類均有所增加，其他類基本保持不變，表明不同的酶處理方式對(duì)揮發(fā)性香氣化合物產(chǎn)生了一定影響。盡管酶處理方式對(duì)葡萄酒中揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量沒有顯著影響，但引起了香氣物質(zhì)種類的減少和香氣成分的改變，且游離酶對(duì)其不利影響要大于固定化酶。因此，在人們接受風(fēng)味有所改變的前提下，固定化EC降解酶更適合用于“美樂”葡萄酒。

續(xù)表1

3 結(jié)語(yǔ)

通過對(duì)殼聚糖與戊二醛的交聯(lián)條件進(jìn)行優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，以體積分?jǐn)?shù)5%的戊二醛溶液作交聯(lián)劑，交聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行8 h時(shí)，載體對(duì)酶的固定量達(dá)到最大。之后對(duì)EC降解酶的酶學(xué)性質(zhì)展開分析，得到如下結(jié)果：固定化EC降解酶的最適溫度是42℃，在此溫度下放置24 h時(shí)相對(duì)酶活達(dá)60%以上；其最適pH是3.6，在此條件下放置24 h的相對(duì)酶活大于60%；在體積分?jǐn)?shù)7%~25%乙醇下，酶活均保持在50%以上，說明該固定化酶的乙醇耐受范圍廣，催化活性高；該酶在重復(fù)使用8次后，酶活還保持在50%以上，而且分別在4℃和20℃下貯藏6周后的酶活損失率不足30%和40%。最后，采用ATPS結(jié)合GC-MS檢測(cè)不同酶處理的“美樂”葡萄酒中含有的EC，得知固定化EC降解酶的EC去除率達(dá)30.90%，是游離酶的81.53%。EC降解酶的處理方式對(duì)葡萄酒中揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量沒有顯著影響，只是引起了香氣物質(zhì)種類的減少和香氣成分的改變，但固定化酶對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的不利影響遠(yuǎn)低于游離酶。