氯沙坦對急性肺損傷小鼠肺樹突狀細胞活化的影響及作用機制研究

趙耀東，魏明

（1.鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，河南 鄭州 450052；2.鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院輸血科，河南 鄭州 450052）

急性肺損傷（ALI）是一類較多見的危急大病，能夠進展成為更加危急的急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。病因眾多，其死亡率能夠達到40%[1，2]。當(dāng)前研究認為其發(fā)病的主要因素為不可控制的炎性反應(yīng)[3]。腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的激活在ALI的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。RAS的主要效應(yīng)因子血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）有顯著的促進炎癥發(fā)生的作用,它是介導(dǎo)ALI肺部炎性反應(yīng)過程的關(guān)鍵因子[4,5]。作為血管緊張素Ⅱ的1型受體阻斷劑，氯沙坦能夠顯著降低肺部炎癥損傷水平[6]。樹突狀細胞（DC）能夠調(diào)節(jié)肺部免疫反應(yīng)，并在其中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。有研究表明，肺部組織感染以及由博來霉素誘發(fā)的肺部損傷過程都有肺DC的干預(yù)[7,8]。肺部結(jié)構(gòu)RAS能夠調(diào)節(jié)肺DC的作用水平，AngⅡ可促進DC分化成熟[9]。但是，氯沙坦能否依賴于抑制AngⅡ誘發(fā)的肺DC的激活從而緩解肺部組織炎性反應(yīng)這仍有待于深究。此實驗應(yīng)用脂多糖（LPS）來構(gòu)建ALI小鼠的模型，研究在ALI中，氯沙坦對肺DC的數(shù)目和功能的作用，從而深入探究氯沙坦對ALI產(chǎn)生的保護性機理。

1 實驗材料和實驗方法

1.1 實驗動物72只C57BL/6小鼠，雄性，6～8周，體重為18～22 g。由鄭州大學(xué)實驗動物中心供給，許可證號：ZYXK（豫）2016-0289。于無特定病原體（SPF級）條件下常規(guī)喂養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)化顆粒飼料、飲用水、墊料及其他相關(guān)物品都經(jīng)滅菌處理。

1.2 試劑和器材LPS（E.coli 0111：B4）購自Sigma公司，膠原酶V購自Sigma-Aldrich公司。小鼠CD11c、CD11b，組織相容性復(fù)合物（MHC II），CD80及同型對照單克隆抗體都購自eBioscience公司。Losartan由Cayman公司提供。小鼠IL-6 ELISA kit購自上海依科賽生物有限公司。流式細胞儀購自美國BD公司（BDFACSCaliburTM）。

1.3 模型制備與分組 將72只SD小鼠按隨機數(shù)字表法分為正常對照組、ALI模型組和氯沙坦干預(yù)組各24只。正常對照組：向小鼠腹腔中注射50μl的PBS，30分鐘后向氣管中滴加30μl的PBS，ALI模型組[10,11]：向小鼠腹腔中注射50μl的PBS，30分鐘之后向氣管中滴加2mg/kg的LPS（溶于30μl PBS中），成功構(gòu)建LPS-ALI模型的標(biāo)準(zhǔn)：肺部組織間質(zhì)內(nèi)充血、腫大，肺泡之間的間隙顯著增寬，肺部組織間質(zhì)以及肺泡腔中有彌漫性炎癥細胞的包裹、出血，大部分肺泡結(jié)構(gòu)萎縮[11]。氯沙坦干預(yù)組：向小鼠腹腔中注射15mg/kg的氯沙坦（溶于50 μl PBS中），30分鐘之后構(gòu)建LPS-ALI模型。注射LPS或 者PBS之 后 的6、12、24小 時 左 右 處 死 標(biāo)本，留取待檢的肺組織。

1.4 標(biāo)本的采集以及病理研究 于6、12、24小時采用右心室取血的方法處死小鼠（n=6只小鼠/每組/每個時間點）。將右肺部分組織標(biāo)本大?。s0.5cm×0.5cm，1～2g）進行甲醛固定、石蠟片包埋、再經(jīng)切片、HE染色,由病理科一名醫(yī)師專門負責(zé)觀測其病理改變，并將組織小塊按照方法[12]對其進行損傷分級評分。規(guī)則如下：⑴肺泡的充血，⑵出血,⑶肺泡腔中或者血管壁上有中性粒細胞的包裹,⑷肺泡壁加厚和（或）有透明質(zhì)膜的產(chǎn)生四項指標(biāo)，分別按照病變的嚴重程度對其評0～4分（0：沒有病理改變或極度輕微病變，1：輕微病理改變，2：中等程度病理改變，3：嚴重病理改變，4：極度重癥病理改變）。各部分的評分數(shù)之和即為急性肺損傷的總分數(shù)。

1.5 肺單細胞懸液制備 在滅菌的情況下拿出肺部組織30mg,將其放于含有Hank's平衡溶液的培養(yǎng)皿之中,把取到的肺部組織用眼科剪裁成1mm×1mm×1mm大小的小塊,把裝有肺部組織小塊的培養(yǎng)皿放于培養(yǎng)箱中,勇膠原酶V溶液對其進行消化1小時（37℃，每隔3分鐘輕輕振搖數(shù)次），冰浴終止消化，緩緩吸打分離細胞，用200目的不銹鋼網(wǎng)格過篩,在EP管中集中收取消化液。再經(jīng)1000 rpm/min的速度離心10分鐘，去上清，于下層沉淀中注入2ml的PBS緩緩吸打,相同的速度離心5分鐘，棄上清，于沉淀里加5ml的紅細胞裂解液，緩緩吸打使細胞分散開來,冰塊上靜置10分鐘，相同的速度離心10分鐘，棄上清，加3ml的PBS混合版均勻，離心5分鐘，速度同上。棄上清。用臺盼藍染液對細胞進行染色，細胞計數(shù)板涂片，光學(xué)顯微鏡下觀測活體細胞數(shù)目，之后將細胞的濃度調(diào)整到1×106個/ml，冰凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 肺濕重/體重（LW/BW）檢測 取肺組織，把肺部組織表層多余的水分用吸水紙吸盡同時清理好血漬之后，稱量并算出肺組織LW/BW水平。

1.7 ELISA測定肺部組織IL-6水平 挑選右肺下部組織約10mg，加入2ml生理鹽水，用電動勻漿機制備肺組織勻漿，4℃，3000rpm/min離心10分鐘，留上清液，－80℃保存。按照試劑盒的說明書進行嚴格規(guī)范操作，450nm處測吸光值，計算IL-6水平。

1.8 流式細胞儀測定肺部DC數(shù)目以及CD80、MHC II的表達 在管中滴加0.5μg的抗CD16/CD32單克隆抗體避光反應(yīng)10分鐘,在相對應(yīng)的管中分別滴加0.25μg的抗CD11c-FITC單抗、0.125 μg的CD11b-PE單抗、0.03μg的抗MHC II-APC單抗以及0.06μg的抗CD80-APC單抗。并將FITC熒光標(biāo)記的抗亞美尼亞倉鼠IgG、PE熒光標(biāo)記的抗大鼠IgG2b、APC熒光標(biāo)記的抗大鼠IgG2b設(shè)為同型的陰性對照管（抗體在使用之前應(yīng)該緩慢搖勻），混和均勻，25℃避光反應(yīng)20分鐘，1200rpm的速度離心5分鐘，棄去上層清液，向沉淀中滴加1 ml的含有1% BSA PBS混和均勻,同樣的速度離心5分鐘,棄去上層清液,滴加1%的多聚甲醛300μl，放于4℃避光存放，24小時之內(nèi)上機檢測，檢測之前應(yīng)該緩慢吸打使細胞混合均勻，本實驗重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗中均采用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)資料進行分析。對各組數(shù)據(jù)進行正態(tài)檢驗和方差齊性檢驗，如果數(shù)據(jù)方差齊、滿足正態(tài)分布，采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間比較采用Dunnett-t法，若不滿足方差齊性檢驗條件，則采用秩和檢驗。用Mann-Whiteney法對其進行組間比較，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氯沙坦對小鼠肺部結(jié)構(gòu)病理學(xué)變化產(chǎn)生的效果6h各組肺部結(jié)構(gòu)切片進行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。正常對照組中小鼠的肺泡間隙均等，肺泡腔中沒有明顯的滲出以及炎癥性包裹，ALI模型組小鼠的肺部組織病理學(xué)檢查可見其肺泡間隙顯著加寬、肺間質(zhì)內(nèi)血管有充血、出血同時彌漫的炎癥性包裹,氯沙坦干預(yù)組中小鼠肺部病理學(xué)檢查可見肺泡間隔稍稍加寬,產(chǎn)生少部分出血以及炎癥性包裹,與ALI模型組相比損傷大大降低,見圖1。

圖1 氯沙坦對6 h小鼠肺組織病理變化的影響（HE×400，箭頭為中性粒細胞）

2.2 氯沙坦對小鼠肺LW/BW比的影響6h、12h和24h各組小鼠肺LW/BW比較，經(jīng)方差分析，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=5.78、5.65和5.51，P=0.006、0.005和0.004）；與正常對照組相比，ALI模型組和氯沙坦干預(yù)組小鼠肺LW/BW升高（P<0.05）；氯沙坦干預(yù)組肺LW/BW較ALI模型組降低（P<0.05），見表1。

表1 氯沙坦對小鼠肺LW/BW比的影響（n=8，%，）

表1 氯沙坦對小鼠肺LW/BW比的影響（n=8，%，）

注：與正常對照組比較：aP<0.05，與ALI模型組比較：bP<0.05

組別 6h正常對照組ALI模型組氯沙坦干預(yù)組F值P值0.49±0.03 0.71±0.04a 0.63±0.04ab 5.78<0.05 12h 24h 0.51±0.04 0.69±0.05a 0.61±0.03ab 5.65<0.05 0.50±0.03 0.67±0.05a 0.58±0.06ab 5.51<0.05

2.3 氯沙坦對小鼠肺Smith損傷評分的影響 比較6h、12h和24h各部分小鼠肺部組織病理評分，經(jīng)方差分析，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=127.24、118.67和121.38，P=0.002、0.005和0.003），與正常對照組相比，ALI模型組和氯沙坦干預(yù)組小鼠肺組織病理切片評分增高（P<0.05）；氯沙坦干預(yù)組肺損傷評分較ALI模型組明顯降低（P<0.05）見表2。

表2 氯沙坦對小鼠肺Smith損傷評分的影響（n=8，分）

表2 氯沙坦對小鼠肺Smith損傷評分的影響（n=8，分）

注：與正常對照組比較：aP<0.05，與ALI模型組比較：bP<0.05

組別 6h正常對照組ALI模型組氯沙坦干預(yù)組F值P值0.66±0.23 5.56±0.22a 3.98±0.21ab 127.24<0.05 12h 24h 0.61±0.20 5.49±0.19a 3.89±0.28ab 118.67<0.05 0.57±0.19 5.31±0.21a 3.27±0.33ab 121.38<0.05

2.4 氯沙坦對小鼠肺組織勻漿IL-6水平的影響比較6h、12h和24h各組小鼠肺組織勻漿IL-6含量,經(jīng)方差分析，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.84、7.23和8.71，P=0.003、0.003和0.002）。6 h、12 h和24 h ALI模型組小鼠肺組織勻漿中IL-6含量與正常對照組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與ALI模型組比較,氯沙坦干預(yù)組IL-6含量降低(P<0.05),見表3。

表3 氯沙坦對小鼠肺IL-6水平的影響（n=8，pg/mg）

表3 氯沙坦對小鼠肺IL-6水平的影響（n=8，pg/mg）

注：與正常對照組比較：aP<0.05，與ALI模型組比較：bP<0.05

組別 6h正常對照組ALI模型組氯沙坦干預(yù)組F值P值396±96 2864±185a 2135±193ab 6.84<0.05 12h 24h 341±72 3568±369a 2539±238ab 7.23<0.05 355±108 3018±264a 1786±153ab 8.71<0.05

2.5 氯沙坦對小鼠肺組織DC數(shù)量的影響6h、12h和24h各組小鼠肺組織DC數(shù)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=16.24、13.67和11.38，P=0.005、0.004和0.003）；與正常對照組比較，ALI模型組肺組織DC數(shù)量和氯沙坦干預(yù)組肺組織DC數(shù)量均顯著升高（P<0.05）。ALI模型組與氯沙坦干預(yù)組肺組織DC數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表4。

表4 氯沙坦對小鼠肺DC數(shù)量的影響（n=8，%，）

表4 氯沙坦對小鼠肺DC數(shù)量的影響（n=8，%，）

注：與正常對照組比較：aP<0.05，與ALI模型組比較：bP>0.05

組別 6h正常對照組ALI模型組氯沙坦干預(yù)組F值P值1.14±0.22 3.18±0.43a 2.96±0.37ab 16.24<0.05 12h 24h 1.09±0.31 3.34±0.37a 3.15±0.33ab 13.67<0.05 1.11±0.35 3.48±0.45a 3.29±0.33ab 11.38<0.05

2.6 氯沙坦對小鼠肺部組織DC表達CD80的作用6h、12h和24h各組小鼠肺組織DC表達CD80比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=11.78、15.31和19.65，P=0.006、0.004和0.002）；與正常對照組比較，ALI模型組和氯沙坦干預(yù)組肺DC表達CD80均升高（P<0.05）。ALI模型組肺DC表達CD 80明顯高于氯沙坦干預(yù)組（P<0.05），見表5和圖2。

表5 氯沙坦對小鼠肺DC功能狀態(tài)的影響（n=8，%，）

表5 氯沙坦對小鼠肺DC功能狀態(tài)的影響（n=8，%，）

注：與正常對照組比較：aP<0.05，與ALI模型組比較：bP<0.05

組別 6h正常對照組ALI模型組氯沙坦干預(yù)組F值P值3.51±0.94 9.78±2.37a 7.41±2.64ab 11.78<0.05 12h 24h 3.56±1.02 10.56±2.69a 8.59±2.86ab 15.31<0.05 3.52±0.98 12.43±3.07a 9.24±3.01ab 19.65<0.05

圖2 氯沙坦對6 h小鼠肺組織CD80的影響（右框紅色部分）

2.7 氯沙坦對小鼠肺組織DC表達MHC II的影響6h、12h和24h各組小鼠肺組織DC表達MHC II比較,經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.32、1.56和1.24，P=0.065、0.055和0.071）；與正常對照組比較，ALI模型組肺DC表達MHC II和氯沙坦干預(yù)組肺DC表達MHC II差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),正常對照組和氯沙坦干預(yù)組肺DC表達MHC II差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表6和圖3。

圖3 氯沙坦對6 h小鼠肺組織MHCⅡ的影響（右框紅色部分）

表6 氯沙坦對小鼠肺DC抗原提呈功能的影響（n=8，%，）

表6 氯沙坦對小鼠肺DC抗原提呈功能的影響（n=8，%，）

注：與正常對照組比較：aP>0.05，與ALI模型組比較：bP>0.05

組別 6h正常對照組ALI模型組氯沙坦干預(yù)組F值P值81.31±16.94 78.24±18.23a 78.98±18.56ab 1.32>0.05 12h 24h 83.67±18.15 79.61±17.59a 80.14±18.34ab 1.56>0.05 82.33±17.52 80.27±18.16a 79.39±18.05ab 1.24>0.05

3 討論

因為炎癥感染等多種原因使肺部多種炎癥因子激活，從而使肺部組織的免疫反應(yīng)失去控制是ALI發(fā)生的主要原因[13,14]。與此同時，缺少特異性藥物的治療成為影響其病情發(fā)展以及預(yù)后主要因素之一[15]。有研究[16]顯示，肺部RAS系統(tǒng)的活躍狀態(tài)在整個ALI的免疫紊亂中起到非常關(guān)鍵的作用。也有研究[6]顯示，氯沙坦可以顯著降低ALI肺部的炎性損傷,這揭示了其在ALI的臨床治療上可能具有重要的應(yīng)用價值。而探究氯沙坦對ALI肺部免疫紊亂造成的炎性損傷機理有及其重大的意義。

此實驗應(yīng)用向氣管內(nèi)注射LPS復(fù)制構(gòu)建小鼠ALI模型，來重現(xiàn)由于肺部炎癥感染所致ALI的整個過程。本實驗可見，ALI模型組小鼠肺LW/BW顯著升高，肺部切片能夠看到肺泡間隙加寬、肺部充血、出血以及彌漫性的炎性細胞的包裹，且IL-6水平也有顯著的增高，這都表明ALI模型復(fù)制成功[17]。本實驗還可見到，與ALI模型組比較，經(jīng)氯沙坦干預(yù)的小組LW/BW降低，肺部組織免疫損傷有所緩解，肺損傷的評分顯著降低，并且肺IL-6水平也明顯減低，提示氯沙坦能夠緩解肺部損傷。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，經(jīng)氯沙坦干預(yù)組的小鼠肺部炎癥損傷水平依舊較高，提示氯沙坦對ALI產(chǎn)生部分保護的效果。

在肺部免疫系統(tǒng)的防御和保護中，肺DC都起到了非常重要的作用，其數(shù)目和功能與免疫效能的發(fā)揮有著相當(dāng)密切的聯(lián)系[18]。目前已知的肺部感染,慢性阻塞性肺疾病以及支氣管哮喘等肺部炎性病變的產(chǎn)生與發(fā)展都有肺DC的參與[19]。本次實驗結(jié)果可見，ALI小鼠的肺DC有廣泛積聚現(xiàn)象，其中其表達的CD80水平也顯著升高，這些均提示在ALI肺部炎性反應(yīng)中,都有成熟的肺DC的身影。且在調(diào)節(jié)ALI肺部免疫損傷這一過程中，肺DC可能成為其重要靶點。此實驗還發(fā)現(xiàn)，正常對照組與ALI模型組小鼠肺DC表的達MHCⅡ分子水平都相對較高，并且沒有顯著差異,提示ALI小鼠肺DC的抗原遞呈能力沒有很大改變。機體內(nèi)免疫反應(yīng)的種類以及水平可能是由其DC的數(shù)目和功能來決定的。有研究[7]顯示，由博來霉素誘發(fā)的小鼠肺損傷模型中肺部成熟DC數(shù)目有明顯升高并且其同時還參與肺部免疫反應(yīng)，阻礙肺DC的發(fā)育成熟能夠明顯緩解肺部的炎性損傷及其纖維化。

本研究證明，經(jīng)氯沙坦干預(yù)小組對LPS-ALI小鼠肺DC數(shù)目沒有太大影響，但是表達CD80的肺DC比例顯著降低，揭示了氯沙坦能夠通過阻礙肺DC成熟緩解ALI肺部免疫損傷水平。本實驗還發(fā)現(xiàn)，氯沙坦對ALI肺DC表達的MHCⅡ分子不產(chǎn)生顯著影響，提示了氯沙坦可能對DC的抗原遞呈功能沒有明顯影響。也有研究[9]發(fā)現(xiàn)，氯沙坦能夠顯著減輕實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠腦以及脊髓中的免疫損傷主要是依賴于對其組織中DC的激活和成熟的抑制。這也更加深入的說明了氯沙坦能夠通過阻礙DC成熟從而實現(xiàn)對ALI的免疫調(diào)節(jié)。

綜上所述，氯沙坦能夠通過抑制肺DC的發(fā)育成熟從而調(diào)節(jié)ALI肺部免疫損傷,在治療ALI的臨床手段上可能具有非常重要的應(yīng)用價值。