HPLC法測定黃體酮軟膠囊含量的不確定度分析

葉嬋娟

（揚(yáng)州市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，江蘇 225009）

黃體酮軟膠囊屬于孕激素類藥物，可用于治療由黃體酮缺乏引起的機(jī)能障礙、排卵功能障礙引發(fā)的月經(jīng)失調(diào)、痛經(jīng)及經(jīng)前期綜合征、出血、絕經(jīng)前紊亂、絕經(jīng)，也有助于妊娠［1-2］。黃體酮的含量測定方法已經(jīng)成熟，但是由于劑型的影響，軟膠囊劑在試驗(yàn)過程中的操作誤差較其他制劑來說會(huì)更大。本文就HPLC法測定黃體酮軟膠囊含量進(jìn)行不確定度分析，以驗(yàn)證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，保證測量結(jié)果可靠性。

對(duì)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確的表征是進(jìn)行測量的目的，但是測量值與真值之間必然存在一定的差異，這種差異來源于測量誤差，而測量誤差不可避免的存在于試驗(yàn)的方方面面。由于誤差存在的必然性，而檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)出具報(bào)告的準(zhǔn)確性又是一個(gè)機(jī)構(gòu)的生命線，因此作為一個(gè)檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)，測量的準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)就顯得尤為重要。測量不確定度是“表征合理地賦予被測量值的分散性，與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)”，其可以在一定程度內(nèi)對(duì)被測量客觀值進(jìn)行評(píng)定，對(duì)測量結(jié)果的質(zhì)量及水平進(jìn)行定量表征。在試驗(yàn)中測量不確定度越小，測量結(jié)果質(zhì)量越高，其使用價(jià)值越大［3-4］。

本文參考《測量不確定度評(píng)定與表示》中相關(guān)規(guī)定，并根據(jù)《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》，利用日常檢驗(yàn)過程中HPLC法測定黃體酮軟膠囊的含量數(shù)據(jù)進(jìn)行不確定度分析，以期找出影響不確定度的各類因素，并對(duì)不確定度進(jìn)行評(píng)估，為檢驗(yàn)檢測報(bào)告的合理評(píng)價(jià)提供可靠依據(jù)，也為HPLC法測定其他樣品進(jìn)行指導(dǎo)，降低不確定度，提高測量結(jié)果質(zhì)量。

1 測定方法及不確定來源

1.1 儀器與試藥 日本島津LC-20AD高效液相色譜儀，SPD-10A紫外檢測器，LC Solution化學(xué)工作站，瑞士Mettler公司XS205DU型電子分析天平；Milli-Q IQ7000超純水機(jī)，KH-400KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器。黃體酮對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定研究院，批號(hào)100027-201810，供鑒別及含量測定用，105℃干燥3 h后使用，含量：99.6%）；黃體酮軟膠囊（浙江愛生藥業(yè)有限公司，批號(hào)20200303，規(guī)格：100 mg）；甲醇（北京迪馬科技有限公司，色譜純），水為純化水（自制）。

1.2試驗(yàn)方法與結(jié)果

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent 5 HC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相；甲醇-乙腈-水（25∶35∶40）；檢測波長：241 nm；柱溫：30℃；流速：1.00 ml/min；進(jìn)樣量：20 μl。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取黃體酮對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置于50 ml量瓶中，加甲醇適量，振搖使黃體酮溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.3 供試品溶液的制備 取本品20粒，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于黃體酮50 mg），置于100 ml量瓶中，加甲醇適量，超聲使黃體酮溶解，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 ml，置于25 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.4 含量測定結(jié)果 根據(jù)試驗(yàn)過程，含量計(jì)算公式可表示為式中：Q:黃體酮軟膠囊標(biāo)示百分含量（%）；Ay:供試品溶液的峰面積；Ad：對(duì)照品溶液的峰面積；Wd:對(duì)照品稱樣量（mg）；Wy:供試品稱樣量（g）；P:對(duì)照品的純度；Vd：對(duì)照品的稀釋體積（ml）；Vy1：供試品的一次稀釋體積（ml）；Vy2：供試品二次稀釋時(shí)移液管取樣體積（ml）；Vy3：供試品的二次稀釋體積（ml）；W:供試品的平均片重（g）；100：供試品的規(guī)格（mg）。計(jì)算結(jié)果：黃體酮軟膠囊含量為標(biāo)示量的95.30%。

1.3 不確定度分量來源的分析 從公式中看出HPLC法測定黃體酮軟膠囊含量的測量不確定主要源于①對(duì)照品方面：對(duì)照品純度、對(duì)照品稱量、對(duì)照品稀釋和對(duì)照品溶液色譜峰面積；②樣品部分：樣品平均片重、樣品稱量、樣品稀釋以及樣品溶液色譜峰面積。天平的校準(zhǔn)和稱量的重復(fù)性是稱量不確定度的主要來源；稀釋的不確定度來源于玻璃儀器的校準(zhǔn)及使用溫度；峰面積的不確定度來源于高效液相色譜儀的重復(fù)性及儀器所處的環(huán)境和性能。

2 各分量的不確定度分析

2.1 對(duì)照品純度引起的相對(duì)不確定度urel（P） 黃體酮對(duì)照品購自中國食品藥品檢定研究院，105℃干燥3 h后使用，純度為99.6%，由于中檢院尚未給出不確定度，現(xiàn)假定其分散區(qū)間的半寬度為α=0.25%，按B類不確定度，矩形分布計(jì)算，取包含因子則對(duì)照品純度引入的不確定度為u

2.2 對(duì)照品稱量引起的相對(duì)不確定度urel（Wd） 來源主要有兩個(gè)：天平的示差和天平稱量的重復(fù)性。天平示差的不確定度：根據(jù)電子天平檢定證書：820022887-011，其示差誤差為±0.05 mg，按B類不確定度，矩形分布分析，取包含因子，其不確定度為ure（lWd）1=；天平稱量重復(fù)性的不確定度：電子天平檢定證書：820022887-011，其給出天平示值重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1 mg，按B類不確定度，矩形分布分析，其不確定度為則單次稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為本法采用減重法進(jìn)行稱量，并進(jìn)行2次稱量，所以不確定度為兩份對(duì)照品稱樣量分別為10.31 mg和10.44 mg，則對(duì)照品稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為1.24×10-2。

2.3 對(duì)照品稀釋引起的相對(duì)不確定度urel（Vd） 對(duì)照品溶液制備過程中有稀釋步驟，稀釋過程中包含玻璃儀器的不確定度。玻璃儀器的不確定度主要包含兩個(gè)方面；第一，量瓶體積校準(zhǔn)的不確定度。根據(jù)JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》，A級(jí)50 ml量瓶的容量允差為±0.05 ml，按B類不確定度，矩形分布分析，取包含因子，則第二，量瓶校準(zhǔn)時(shí)的溫度與試驗(yàn)時(shí)使用溫度差異。試驗(yàn)時(shí)環(huán)境溫度為18℃，按照J(rèn)JG196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》，水的體積膨脹系數(shù)為0.000 21 ml/℃，因此50 ml量瓶產(chǎn)生的體積變化為50×0.000 21×2=0.021 ml，按照矩形分布，屬于B類不確定度，取包含因子，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為10-2。綜上對(duì)照品稀釋引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel（Vd）=

2.4 對(duì)照品溶液色譜峰面積的相對(duì)不確定度urel（Ad） 色譜峰面積不確定度的主要影響因素為峰面積重復(fù)性、儀器、環(huán)境、進(jìn)樣體積等。由于對(duì)照品溶液與供試品溶液在基本相同的條件下進(jìn)樣，儀器環(huán)境、進(jìn)樣體積等因素造成的不確定度可互相抵消，所以忽略儀器環(huán)境和進(jìn)樣的影響。故峰面積重復(fù)性是影響對(duì)照品溶液峰面積不確定度的主要因素。本次試驗(yàn)中，對(duì)照品1重復(fù)進(jìn)樣3次，峰面積分別為9 950 591、9 974 909和9 978 032，平均值為9 967 844，對(duì)照品峰面積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為相對(duì)不

3 計(jì)算合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

4 給出擴(kuò)展不確定度

試驗(yàn)結(jié)果一般用擴(kuò)展不確定度來表示，取包含因子k=2（置信概率約為95%），則含量測定擴(kuò)展不確定度uc（Q）=2×uc（Q）=2×1.24%=2.48%。含量測定結(jié)果可表示為Q+U（Q）:95.3%±2.48%，k=2（95%的置信區(qū)間）。

5 討論

對(duì)HPLC法測定黃體酮軟膠囊的含量的不確定度分析，得到檢測結(jié)果的擴(kuò)展不確定度為2.48%（k=2）。由上述評(píng)估過程可知，在HPLC測量黃體酮軟膠囊的含量中，對(duì)照品的稱量是不確定度分析中對(duì)不確定度影響最大的一個(gè)分量，其次是色譜峰面積形成的影響。因此在日常試驗(yàn)中要做好質(zhì)量控制，嚴(yán)格規(guī)范稱量、稀釋、進(jìn)樣等關(guān)鍵步驟。對(duì)于稱量來說，試驗(yàn)中可采取增加稱樣量和選用更高精度的天平的方法來減少稱量對(duì)不確定的影響，嚴(yán)格按照《中國藥典》稱量要求進(jìn)行稱量，控制實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，保持適宜的溫度和濕度，以減少環(huán)境對(duì)稱量及其他試驗(yàn)步驟的影響；就色譜峰面積而言，可以考慮重復(fù)多次進(jìn)樣來減少其對(duì)不確定度的影響，定期做好儀器維護(hù)和期間核查保證儀器的正常性能。

試驗(yàn)中的人員、儀器、試劑、試驗(yàn)方法、環(huán)境等各個(gè)方面都會(huì)影響試驗(yàn)的準(zhǔn)確性［4］。要把好試驗(yàn)過程中的每一關(guān)。做好人員培訓(xùn)，盡量減少試驗(yàn)操作上的誤差；在日常中要做好儀器維護(hù)，確保儀器性能，定期做好玻璃器具的檢定，保證試驗(yàn)使用的各種儀器器具都是在正常的狀態(tài)；在采購驗(yàn)收時(shí)要注重產(chǎn)品質(zhì)量，為試驗(yàn)打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)；試驗(yàn)時(shí)確認(rèn)試驗(yàn)方法，保證按標(biāo)檢驗(yàn)；維護(hù)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境為試驗(yàn)提供一個(gè)適宜的溫濕度環(huán)境，并保持環(huán)境的穩(wěn)定減少環(huán)境改變帶來的影響。而且在試驗(yàn)過程中，盡量減少稀釋步驟，如必須稀釋可進(jìn)行更大體積的稀釋，以減少試驗(yàn)誤差。通過這些方法可降低合成相對(duì)不確定度，提高檢驗(yàn)質(zhì)量。

測量不確定度作為評(píng)定測量結(jié)果可信度的依據(jù)，在評(píng)價(jià)分析方法、實(shí)驗(yàn)室評(píng)定、確定測試人員的技術(shù)水平及判定藥品質(zhì)量是否準(zhǔn)確方面都具有重要意義［6-7］。評(píng)定不確定度時(shí)，應(yīng)盡量將產(chǎn)生不確定度的所有來源都考慮周全，因?yàn)橹匾牟淮_定度分量幾乎完全取決定合成不確定度的數(shù)值。由本文的研究也提示本文建立的測量不確定度評(píng)定方法，也可以為其他藥品應(yīng)用高效液相法進(jìn)行含量測定的測量不確定度的評(píng)定提供參考，為液相方法測定含量提供技術(shù)上的支持，關(guān)注誤差來源，減少誤差的產(chǎn)生，提高測量數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。