隔藥餅灸對動脈粥樣硬化易損斑塊兔腹主動脈TLR2、TLR4、NF-κB表達的影響

易麗貞　楊俊　謝濤　吳雪芬　劉欣　岳增輝

〔摘要〕 目的 觀察隔藥餅灸對動脈粥樣硬化（atherosclerosis， AS）易損斑塊兔Toll樣受體2（toll like receptor 2， TLR2）、Toll樣受體4（toll like receptor 4， TLR4）、核因子κB（nuclear factor kappa B， NF-κB）變化的影響，探討其可能的作用機制。方法 將60只普通級新西蘭兔隨機分為空白組、模型組、直接灸組、隔藥餅灸組、藥物組，每組12只。通過高脂飼養(yǎng)+腹主動脈球囊損傷制作兔AS易損斑塊模型。采用免疫組化法觀察腹主動脈TLR2、TLR4、NF-κB的抗原活性;透射電鏡觀察腹主動脈超微結構。結果 與空白組比較，模型組、直接灸組、隔藥餅灸組和藥物組TLR2、TLR4、NF-κB灰度值均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，直接灸組、隔藥餅灸組和藥物組TLR2、TLR4、NF-κB灰度值均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與直接灸組相比，隔藥餅灸組和藥物組TLR2、TLR4、NF-κB灰度值明顯升高（P<0.05或P<0.01）。電鏡下觀察，模型組較空白組主動脈內皮細胞病變更嚴重，內皮細胞內含大量脂質;直接灸組、隔藥餅灸組、藥物組內皮細胞大多形態(tài)正常，有少量脂質沉積。結論 隔藥餅灸穩(wěn)定AS易損斑塊的機制可能是通過降低TLR2、TLR4、NF-κB的抗原活性，下調其表達，以延緩AS的形成。

〔關鍵詞〕 隔藥餅灸;動脈粥樣硬化;易損斑塊;Toll樣受體2;Toll樣受體4;核轉錄因子κB

〔中圖分類號〕R245? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.03.008

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of herbal cake separated moxibustion on the changes of toll like receptor 2 （TLR2）， toll like receptor 4 （TLR4） and nuclear factor kappa B （NF-κB） in vulnerable plaques of atherosclerosis （AS） in rabbits， and to explore the possible mechanism. Methods 60 ordinary New Zealand rabbits were randomly divided into the blank group， the model group， the direct moxibustion group， the herbal cake separated moxibustion group and the medicine group， with 12 rabbits in each group. AS vulnerable plaques rabbit model was established by feeding high-fat diet and balloon injury of abdominal aorta. Immunohistochemistry was used to observe the antigen activity of TLR2， TLR4 and NF-κB in abdominal aorta. A transmission electron microscope was used to observe the ultrastructure of the abdominal aorta. Results Compared with the blank group， the grey levels of TLR2， TLR4 and NF-κB were significantly reduced （P<0.05 or P<0.01） in the model group， the direct moxibustion group， the herbal cake separated moxibustion group and the medicine group; compared with the model group， the grey levels of TLR2， TLR4 and NF-κB were significantly raised （P<0.05 or P<0.01） in the direct moxibustion group， the herbal cake separated moxibustion group and the medicine group; compared with the direct moxibustion group， the grey levels of TLR2， TLR4 and NF-κB were significantly raised （P<0.05 or P<0.01） in the herbal cake separated moxibustion group and the medicine group. Under the electron microscope， compared with the blank group， the pathological changes of aortic endothelial cells were more serious and contained a large amount of lipid in model group; most of the endothelial cells in direct moxibustion group， the herbal cake separated moxibustion group and the medicine group， had normal morphology with a small amount of lipid deposition. Conclusion The mechanism of herbal cake separated moxibustion to stabilize vulnerable plaques of AS may be through reducing the antigen activity of TLR2， TLR4， NF-κB， and down regulating their expression， so as to delay the formation of AS.

〔Keywords〕 herbal cake separated moxibustion; atherosclerosis; vulnerable plaque; toll like receptor 2; toll like receptor 4;nuclear factor kappa B

動脈粥樣硬化（atherosclerosis， AS）是目前所知導致冠狀動脈心臟病、頸動脈疾病及外周動脈疾病最常見的原因。AS給人們的生存質量和健康狀況帶來了嚴重的影響，其發(fā)展是慢性炎癥過程，以炎癥細胞聚集等為特征[1]。易損斑塊（vulnerable plaque， VAP）是指短期內具有高血栓形成風險并有可能極速變成罪犯斑塊的AS斑塊，其形成與炎癥反應、內皮功能損傷等病理過程有著密切聯系[2]。Toll樣受體（toll

like receptor， TLRs）是天然免疫過程中的關鍵參與者，同時它也是炎癥與AS之間的聯系紐帶，是天然免疫系統(tǒng)中的細胞跨膜受體，也是病原模式識別受體[3]，可與配體結合后促進核轉錄因子κB（nuclear factor kappa B， NF-κB）發(fā)生核轉移，與AS的發(fā)展聯系密切[4]。研究[5-6]發(fā)現，Toll樣受體2（toll like

receptor 2， TLR2）通過促進內皮細胞活化及炎癥反應的發(fā)生促使AS斑塊形成。Toll樣受體4（toll like

receptor 4， TLR4）能促使斑塊破裂進而增強斑塊的不穩(wěn)定性[7]。本課題組前期研究[8-13]表明，隔藥餅灸可改善脂質代謝，干預炎癥反應，減少炎癥因子的釋放，能夠緩解AS的發(fā)展，穩(wěn)定AS斑塊。本研究通過探討隔藥餅灸對AS易損斑塊兔TLR2、TLR4、NF-κB的影響，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1? 實驗材料

1.1.1? 實驗動物? 健康新西蘭兔60只，雌雄各半，體質量1.5～2.0 kg，購于湖南省長沙市天勤生物有限公司[質量許可證號：SCXK（湘）2009-0012]。分籠飼養(yǎng)于動物實驗中心（普通級），自由飲水，飼養(yǎng)溫度范圍18～24 ℃，濕度范圍50%～70%。實驗動物處置均符合《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.1.2? 主要試劑及儀器? 艾柱（河南南陽漢醫(yī)艾絨廠，型號：東方一型）;阿托伐他汀鈣片（10 mg/片，北京嘉林藥業(yè)股份有限公司，批號：H19990258）;Ad5-p53重組載體（廣東省深圳賽百諾基因技術有限公司，批號：20080401）;組胺（美國sigma公司，批號：HT-7250）;斑點蝰蛇毒（廣州新源蛇毒）;SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號：08C20B、08G01A22）;TLR2、TLR4、NF-κB抗體（abcam公司，批號：ab13855、ab3066、ab95020）。雙目顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司，型號：Motic B3）;球囊導管與附件[（3.0～3.5 mm）×15 mm普通球囊導管、0.014/195 cm導引導絲、球囊擴張壓力泵，美國Cordis公司]。

1.2? 分組與造模

1.2.1? 動物分組? 60只新西蘭兔隨機分為5組：空白組、模型組、直接灸組、隔藥餅灸組、藥物組，每組12只。實驗期間，空白組死亡2只（腹瀉2只），模型組死亡3只（術后感染2只，腹瀉1只），直接灸組死亡4只（術后感染1只，猝死1只，腹瀉2只），隔藥餅灸組死亡3只（術后感染2只，猝死1只），藥物組死亡3只（麻醉意外1只，腹瀉1只，猝死1只）。

1.2.2? 模型建立? 造模方法參照文獻[14]和[15]，采用球囊損傷術結合高脂喂養(yǎng)方式復制AS易損斑塊模型。高脂飼料由15%蛋黃粉、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、5%豬油、77.5%普通飼料組成。除空白組外，其余組均行腹主動脈球囊損傷術。術后連續(xù)3 d給予青霉素肌肉注射（80萬U/d）防止術后感染[16]。術后第8周末利用球囊注入Ad5-p53重組載體（今又生）進行基因轉染，共2周。于動物處死前48 h、24 h，將除空白組外的實驗兔在腹膜下推注斑點蛇蝰毒0.15 mg/kg，30 min后沿耳緣靜脈處注射組胺0.02 mg/kg，先后兩次以觸發(fā)易損斑塊破裂。模型以腹主動脈出現AS斑塊為造模成功標準。

1.3? 干預方法

1.3.1? 空白組、模型組? 將實驗兔捆綁于兔臺上，不進行操作，每天20 min，連續(xù)8周。

1.3.2? 直接灸組? 將實驗兔穴位剃毛后捆綁于兔臺，將艾柱（艾柱下有紙質墊片）放置穴位上進行施灸，每日施灸連續(xù)3壯。穴位的選?。孩窠M穴位（巨闕、天樞、豐隆）、Ⅱ組穴位（心俞、肝俞、脾俞），每天交替施灸，共治療8周。治療期間若出現水泡，保持干燥，以防感染。

1.3.3? 隔藥餅灸組? 取3～5 g藥粉（由等比例丹參、郁金、澤瀉、大黃、山楂藥物組成）用陳醋調成糊狀后制作大小合適的的藥餅，將艾柱放置在藥餅上再一同放置于穴位上進行施灸，其余操作同直接灸組，共治療8周。

1.3.4? 藥物組? 按照1 mg/（kg·d）的劑量給予阿托伐他汀鈣片拌入實驗兔第1口飼料，吃完后再補充剩余高脂飼料，共治療8周。

1.4? 觀察指標及檢測方法

1.4.1? 免疫組化法檢測TLR2、TLR4、NF-κB抗原活性? 于13周末處死動物，剖開腹部，選取主動脈弓到髂總動脈分叉處的主動脈剪下，再將基因轉染處及血栓形成處血管段分3段備用。將所取的腹主動脈用PBS沖洗后再用4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、包埋、切片、脫蠟、抗原修復、過氧化氫滅活、血清封閉。滴加適當稀釋一抗兔TLR2、TLR4、NF-κB 單克隆抗體（1∶100）、生物素化山羊抗兔 IgG、SABC后加入DAB顯色，蘇木素襯染，沖洗、封片，顯微鏡觀察。每個切片計數1個視野，每個切片重復測量3次，在MIAS醫(yī)學圖象分析系統(tǒng)分析，取平均值作為該切片指標表達的灰度值。

1.4.2? 電鏡觀察內皮超微結構變化? 取材后使用2.5%的戊二醛混合固定液固定、脫水、滲透、包埋后，半薄切片，用甲苯氨藍染色觀察，光鏡定位選取所需要的部位，超薄切片（500 A），醋酸鈉、硝酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察并采集照片。

1.5? 統(tǒng)計學分析

所有實驗數據采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。各檢測指標統(tǒng)計數據均以“x±s”表示，服從正態(tài)分布則采用單因素方差分析，組間比較方差齊采用LSD檢驗，方差不齊采用非參數檢驗，均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1? 各組兔一般情況

實驗期間，空白組實驗兔精神狀態(tài)良好，動作靈敏，毛色光澤，大小便情況無明顯改變。模型組實驗兔精神狀態(tài)較差，體質量增長顯著，目光呆滯，反應遲鈍，毛色黯淡。各治療組實驗兔精神狀態(tài)一般，反應尚可。

2.2? 各組兔腹主動脈TLR2、TLR4、NF-κB抗原活性比較

與空白組比較，模型組TLR2、TLR4、NF-κB灰度值均顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，直接灸組、隔藥餅灸組和藥物組TLR2、TLR4、NF-κB的灰度值均具有明顯的上調（P<0.05或P<0.01），且隔藥餅灸組、藥物組優(yōu)于直接灸組（P<0.05或P<0.01）。見表1、圖1。

2.3? 各組兔腹主動脈超微結構變化

電鏡下觀察，模型組較空白組腹主動脈內皮病變嚴重，內皮細胞內含大量脂質和泡沫樣變細胞;直接灸組、隔藥餅灸組、藥物組內皮細胞大多形態(tài)正常，偶見線粒體水腫，有少量脂質沉積。見圖2。

3 討論

隔藥餅灸是指在穴位上放置藥餅，再將艾柱放置藥餅上的一種灸法，是集腧穴、藥物、艾灸作用為一體的治療方法。研究[17]表明，艾葉燃燒時可使物理因子和化學因子與腧穴特性和經絡傳導結合，通過調控機體神經、內分泌和免疫等系統(tǒng)，使艾灸不僅能產生局部有效刺激，還能對調整機體的內環(huán)境起到重要作用。有研究[18-19]表明隔藥餅灸具有確切的抗炎作用。中醫(yī)學中并無“動脈粥樣硬化”這一疾病記載，根據其臨床表現可歸為“中風”“頭痛”“胸痹”等范疇。中醫(yī)病機為本虛標實、虛實夾雜，本虛可累及心、肝、腎等臟腑，標實主要為痰濁、瘀血阻滯。因此，選取具有化濁降脂、行氣散瘀的山楂、丹參、郁金、大黃、澤瀉等藥物做成藥餅。相關研究[20-24]表明，上述5種藥物均可有效改善血脂水平、保護血管內皮，預防AS并改善其癥狀，穩(wěn)定AS易損斑塊?！熬揸I”“天樞”為心和小腸的募穴，“豐隆”為治痰要穴，“心俞”“脾俞”和“肝俞”分別為心、脾和肝的背俞穴，本課題組前期研究[8-13]已證實，選取以上穴位可有效調節(jié)血脂、改善AS癥狀。

AS是一種脂蛋白驅動的疾病，通過內膜炎癥、壞死、纖維化和鈣化導致易在動脈交叉部位形成斑塊，斑塊破裂則會導致威脅生命的冠狀動脈血栓形成。脂質代謝失衡是促進AS發(fā)生與進展的重要危險因素。高密度脂蛋白（high density lipoprotein， HDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein， LDL）與AS的發(fā)生有密切關系，LDL升高則表示危險因素增加，易導致AS性心血管疾病的風險增加[25]，HDL保護心血管的作用與其促進膽固醇逆向轉運、抗氧化、抗炎功能有關[26]。

AS的起始環(huán)節(jié)為內皮細胞的活化和功能紊亂，而內皮細胞活化的基因調控位點上存在很多NF-κB結合位點。NF-κB在炎癥反應中是一種重要的轉錄因子，可調控多種細胞因子、趨化因子、黏附因子、急性期反應蛋白，并參與炎癥反應的酶的基因表達[27]。NF-κB活化是TLR2/4-NF-κB信號通路介導炎癥反應的關鍵環(huán)節(jié)[28]。有研究[29]表明，NF-κB活化可促進AS斑塊的形成，通過抑制其活化可緩解AS的發(fā)生發(fā)展。TLRs在AS中發(fā)揮調控炎癥應答的作用，TLR2、TLR4可通過脂多糖誘導細胞內信號通路的激活，使NF-κB等轉錄因子激活，進而調節(jié)釋放和合成炎性細胞因子，影響AS的進程。在AS病變表面存在大量內皮細胞表達模式識別受體TLR2，可導致內皮細胞凋亡。TLR4被激活后可引起機體慢性炎癥反應，使AS形成加速。炎癥細胞因子可促進斑塊中膠原酶增多，能使細胞外基質中的膠原纖維降解，使AS斑塊的穩(wěn)定性減弱，最終導致斑塊破裂[30-31]。有相關研究[32]表明，在TLR2和TLR4基因缺陷的小鼠中，AS相關的炎癥應答被顯著抑制。研究[33]表明，干預TLR4的表達能使促炎因子的生成受抑制，通過減少炎癥反應進而減少斑塊中泡沫細胞，以增加斑塊的穩(wěn)定性，延緩AS的發(fā)展。有學者發(fā)現在AS斑塊中TLRs基因表達明顯上調，其中TLR2表達水平是正常動脈中的3倍[34]。TLR2/TLR4活化可通過髓樣分化因子88依賴性途徑啟動下游信號轉導調節(jié)轉錄因子NF-κB的活性，促進炎癥反應的發(fā)生，導致AS進一步發(fā)展[35]。

本實驗結果顯示，模型組TLR2、TLR4、NF-κB表達升高，表明TLR2/4-NF-κB信號通路被激活，且與模型組相比，隔藥餅灸組、直接灸組和藥物組TLR2、TLR4、NF-κB表達下降，這與前期發(fā)表文獻中PCR結果趨勢一致[13]。而隔藥餅灸組TLR2、TLR4、NF-κB表達下降說明隔藥餅灸可抑制TLR2/TLR4的表達，從而下調NF-κB表達，抑制促炎因子的釋放，最終達到抗AS并穩(wěn)定易損斑塊的目的。因此，隔藥餅灸可能通過下調TLR2、TLR4、NF-κB的表達，抑制炎癥反應，減少泡沫細胞的的數量，增強AS易損斑塊的穩(wěn)定性。

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