茯磚茶對APOE-/-小鼠肝脂合成和氧化應激影響

張文將， 劉圓月， 范文濤， 段麗芳， 李 鑫， 劉柏炎

（1.陜西中醫(yī)藥大學 基礎醫(yī)學院，陜西 咸陽712046；2.益陽醫(yī)學高等?？茖W校 基礎醫(yī)學部，湖南 益陽413000；3.湖南中醫(yī)藥大學 中西醫(yī)結合學院，湖南 長沙410208）

非酒精性脂肪肝（NAFLD）已發(fā)展為我國第一大肝病，呈低齡化和快速增長趨勢[1]。該病的發(fā)病機制尚不明確，“二次打擊學說”被認為是NAFLD形成的經(jīng)典假說，胰島素抵抗和脂質代謝紊亂導致脂類物質在肝細胞內(nèi)的聚集造成第一次打擊；各種原因造成的氧化應激以及脂質過氧化損傷被認為是“二次打擊”因素；該病持續(xù)發(fā)展有演化為肝纖維化，甚至有肝癌變、肝衰竭的風險[2-3]。

NAFLD尚無獲批的特異性藥物治療，2018年非酒精性脂肪性肝病防治指南建議改善不良的生活方式，適當應用具有降脂和抗氧化的藥物進行輔助治療，并認為適度飲茶有助于NAFLD患者的康復[4]。茯磚茶善解油膩、助消化，被譽為“生命之飲”，其所富含的茶多糖及發(fā)花過程中產(chǎn)生的冠突散囊菌具有清除自由基的能力[5]。江南大學生物工程學院研究團隊證實茯磚茶中存在類他汀的成分[6]。課題組既往實驗證實茯磚茶具有降低高脂喂養(yǎng)載脂蛋白E敲除（APOE-/-）小鼠肝質量、肝指數(shù)、體質量、脾質量、腹部脂肪質量作用；降低APOE-/-小鼠血清中低密度脂蛋白膽固醇（LDL）、三酰甘油（TG）含量和抑制炎癥因子表達的效果[7-8]。茯磚茶能否逆轉脂類物質在肝臟的沉積，這在以往的研究中鮮有報道。本實驗中檢測肝臟HMG-CoA還原酶mRNA（HMGCR）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ mRNA（PPAR-γ）、硬脂酰輔酶A去飽和酶1 mRNA（SCD-1）3個指標來反映小鼠肝脂合成代謝；以肝組織中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）來反映氧化應激損傷；肝組織丙氨轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）來反映肝細胞損傷，從而深入探討茯磚茶對NAFLD的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 2月齡SPF級雄性APOE-/-小鼠55只，南京大學生物模式中心提供，品系名APOE Cas9-KO，遺傳背景C57BL/6，配繁信息為-82bp/wt配B6J，動物許可證號SCXK（蘇）2015-0001；2月齡雄性C57BL/6J小鼠10只，動物許可證號SYXK（湘）2016-0002，該實驗通過動物倫理審查。

1.1.2 藥物及試劑 2014年茯磚茶：湖南安化白沙溪茶廠提供；阿托伐他汀：輝瑞制藥公司產(chǎn)品；Trizol Reagent： 美國invitrogen公司產(chǎn)品 （貨號：15596026）；Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit：美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品（貨號：00692424）；TB GreenTMPremix Ex TaqTM：日本TaKaRa公司產(chǎn)品（貨號：A152172A）；BCA蛋白質濃度測定試劑盒：武漢博士德公司產(chǎn)品；MDA、GSH-PX、SOD、ALT、AST試劑盒：南京建成公司產(chǎn)品。

1.1.3 飼料 高脂飼料：北京華阜康公司產(chǎn)品（型號：H10141）；普通維持飼料：湖南斯萊克景達實驗動物公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 高速冷凍離心機：德國Hermle公司產(chǎn)品；光學顯微鏡：日本奧林巴斯公司產(chǎn)品；分光光度計：日本島津公司產(chǎn)品；多功能酶標儀：美國Perkinelmer公司產(chǎn)品；核酸蛋白質濃度測定儀：英國Bio-drop公司產(chǎn)品；PCR擴增儀：美國Bio-rad公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀：德國Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物制備 為保證藥液的新鮮，每次熬制約一周的量，具體方法如下：準確稱量茯磚茶20 g并充分粉碎，用無菌紗布包裹系緊放入無菌燒杯中，茶葉與無菌III級水按照1 g∶15 mL比例進行配備，加水量應沒過茶包2~3 cm，充分浸泡0.5 h，武火煮開后文火煎煮30 min，煎煮藥液冷卻后過濾，取汁另置；藥包加III級水（與藥包齊平）繼續(xù)煎煮，煮沸后冷卻，合并兩次熬制的藥液并濃縮至185 mL（高濃度），取適當體積高濃度藥液若干，依次稀釋為中濃度和低濃度劑量，3 000g離心15 min后，去渣取上清液放入消毒廣口瓶中，于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。參考茶吸收實驗所推薦60 kg成人每日攝入量為10 g茶，即166.7 mg/（kg·d），換算小鼠每日需用量為1.44 g/（kg·d）[9]，根據(jù)預實驗結果設定茯磚茶高、中、低劑量（2.16、1.44、0.72 g/（kg·d））。阿托伐他汀按照10 mg/（kg·d）劑量予以灌胃，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 小鼠飼養(yǎng) 小鼠喂養(yǎng)于SPF級實驗室，IVC獨立送風隔離籠具喂養(yǎng)，每籠5只，室內(nèi)溫度（20±5）℃，室內(nèi)相對濕度40%~70%，明暗交替。APOE-/-小鼠和C57小鼠分別予以等量高脂飼料和普通飼料喂養(yǎng)。小鼠飲用水分別為實驗用III級水，自由飲水。每2 d更換一次墊料，定期對籠具和飲水瓶消毒。

1.2.3 動物分組、造模與給藥 動物適應性飼養(yǎng)一周后，將55只2月齡雄性APOE-/-小鼠連續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)3個月，另選用10只2月齡C57小鼠作為正常對照組予以普通飼料連續(xù)喂養(yǎng)3個月[10]，3個月后隨機抽取5只雄性APOE-/-小鼠進行解剖，觀察各組小鼠肝臟肉眼特征，取肝臟同一部位用多聚甲醛固定后進行HE染色。確定造模成功后隨機分為茯磚茶高、中、低劑量組，模型組，阿托伐他汀組，每組10只，以上各組小鼠按照10 mL/（kg·d）連續(xù)灌胃干預8周，其中模型組和空白對照組予以10 mL/（kg·d）生理鹽水灌胃干預。

1.2.4 標本收集與處理 各組小鼠連續(xù)灌胃8周后禁食不禁水12 h，腹腔麻醉，摘眼球取血后離心獲取血清備檢，頸椎脫臼法處死動物，迅速打開小鼠腹腔放置冰上操作，用眼科剪摘除小鼠肝臟并進行稱質量記錄，預冷生理鹽水漂洗后剪取相同部位小鼠肝葉，并用4%（質量分數(shù)）多聚甲醛固定后放入4℃冰箱以備HE染色。剪取約100 mg肝臟組織放入盛有1 mL預冷Trizol的無酶凍存管中，快速投入液氮中急速冷凍以備PCR檢測；剪取部分肝臟組織放入無酶凍存管并投入液氮中以備氧化應激及肝功能檢測；取材完畢，將液氮中的肝臟組織轉移至-80℃冰箱，盡快進行后續(xù)實驗的檢測。

1.2.5 氧化應激指標測定 將肝臟組織從低溫冰箱取出，冰生理鹽水漂洗后用消毒眼科剪將肝組織剪碎并按m（肝組織）∶V（生理鹽水）=1 g∶9 mL的比例關系加入生理鹽水（全程冰上操作），自動勻漿機勻漿（每3 s間歇1次，防止產(chǎn)熱過多）制成質量分數(shù)10%肝勻漿液，1 000g（4℃）離心15 min，取上清液加適量生理鹽水稀釋到合適的濃度范圍備測肝組織中SOD、GSH-PX活力和MDA質量摩爾濃度，測定數(shù)值帶入公式計算并進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.6 肝功能檢測 用BCA試劑盒測定10%（體積分數(shù)）肝勻漿中各組樣本的濃度，根據(jù)說明書步驟進行操作，計算出各組標本ALT和AST的活力。

1.2.7 病理形態(tài)學檢測 4%（質量分數(shù)）多聚甲醛固定肝組織48 h后取材，自動脫水機常規(guī)脫水后進行包埋，組織蠟塊充分冷卻后放入切片機中制備4μm厚度切片，攤片機上晾干后放入烤箱中70℃烤片1 h，常規(guī)HE染色、封片后觀察組織形態(tài)。依據(jù)指南對NAFLD活動度積分（NAS）進行半定量分析[11]。

1.2.8 RT-qPCR檢測

1）引物設計 從NCBI網(wǎng)站獲取小鼠相應mRNA序列，引物序列信息見表1。

表1 PCR引物序列信息Table1 PCRprimersequence

2）組織總RNA的提取 采用Trizol法提取小鼠肝組織中的總RNA。研缽、研杵DEPC稀釋液浸泡過夜，錫箔紙包裹后高壓蒸汽滅菌（121℃、2 h）后放入烤箱中充分烤干備用。保溫杯盛放液氮備用，低溫冰箱取出的肝臟組織迅速投入液氮預冷的研缽中，不斷倒入液氮促使肝臟組織在低溫環(huán)境下充分冷凍，研杵快速研磨組織直至成粉末狀，傾斜研缽以便于收集粉末，手持200μL吸頭尖端，同時用吸頭寬端迅速收集研缽中的組織粉末，轉移至盛有1 mL Trizol的1.5 mL無RNA酶的EP管中，室溫放置10 min，按照說明書步驟進行后續(xù)操作來獲取總RNA。用移液器吸取2μL RNA提取液滴入核酸蛋白質濃度測定儀中檢測并記錄吸光度比值（A260nm/A280nm），判斷RNA提取的質量。吸光度比值在1.8~2.0之間的組織進行下一步操作。

3）RNA逆轉錄為cDNA 配置20μL反應體系，按照說明書步驟進行操作。RNA變性：加入4μg總RNA（模板RNA），1μL引物Oligo（dT）18，加入RNase-freewater配置成每管12μL體系，打開已預熱的PCR儀器，65℃條件下變性5min，完畢后迅速取出標本放置于低溫冰盒中。RNA逆轉錄為cDNA第1鏈：將已變性的RNA中加入8μL混合液 （5×Reaction Buffer4 μL、RiboLock RNase Inhibitor 1 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL、RvvertAidM-MuLV逆轉錄酶1μL），用掌式離心機瞬時渦旋混勻后放冰盒中備用，放入PCR反應儀中進行條件設置 （42℃反應60min，70℃反應5min，4℃維持），完成RNA逆轉錄為cDNA第1鏈。

4）RT-qPCR擴增 95℃預變性2min，95℃變性15s，60℃退火1min；循環(huán)40次。

5）結果分析方法 以β-actin作為內(nèi)參，各指標基因表達以2-△△Ct值進行相對定量并統(tǒng)計分析。

1.2.9 統(tǒng)計學處理 運用SPSS18.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，結果以均數(shù)±標準差（±SD）來表示。采用單因素方差分析對多組間均數(shù)進行比較，LSD用于分析組間比滿足方差齊次性的實驗數(shù)據(jù)，P<0.05說明差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 肝臟肉眼觀測

空白對照組小鼠肝臟大小適中、顏色暗紅、邊緣銳利（見圖1）。模型組小鼠肝臟體積變大、色黃油膩、邊緣變鈍。高劑量組小鼠肝臟體積變大、顏色暗紅、色稍黃。中劑量組小鼠肝臟色暗紅、大小適中。低劑量組小鼠肝臟色黃油膩、體積變大，邊緣鈍。阿托伐他汀組小鼠肝臟色黃油膩、體積變大、邊緣變鈍。

圖1 不同組別小鼠肝臟肉眼觀測結果Fig.1 Macroscopic changes of liver in different micegroups

2.2 肝臟顯微鏡觀測

正常對照組低倍鏡下肝小葉結構清晰，中央靜脈居中，肝索呈現(xiàn)放射狀，肝血竇清晰；高倍鏡下肝細胞大小正常，核居中，胞質均質紅染。模型組低倍鏡下肝小葉輪廓模糊，肝索未呈現(xiàn)典型的放射狀排列，肝血竇紋理不清；高倍鏡下大量大小不等的空泡形成，細胞核偏位，胞漿淡染疏松化。茯磚茶高劑量組低倍鏡下肝小葉結構完整，中央靜脈居中，肝索呈放射狀，肝血竇基本清晰；高倍鏡下肝細胞大小基本一致，細胞核居中，大部分細胞胞漿紅染，部分細胞胞漿淡染，部分細胞有少量的空泡形成。茯磚茶中劑量組低倍鏡下肝小葉結構完整，中央靜脈居中，肝索呈現(xiàn)放射狀，肝血竇清晰；高倍鏡下肝細胞大小基本一致，細胞核居中，胞漿紅染均質，有少量小空泡形成。茯磚茶低劑量組低倍鏡下肝小葉輪廓欠清晰，中央靜脈居中，肝血竇紋理不清晰；高倍鏡下細胞核居中，胞漿淡染疏松化，有大量小空泡形成。阿托伐他汀組低倍鏡肝小葉輪廓欠清晰，中央靜脈居中，肝血竇紋理不清晰；高倍鏡顯示細胞核偏位，胞漿淡染疏松化，有大小不等的空泡形成（見圖2）。模型組NAS積分最高，各用藥組NAS積分下降，其中茯磚茶高、中劑量組NAS積分最低，結果見表2。

圖2 不同組別小鼠肝組織鏡下觀圖片F(xiàn)ig.2 Liver tissues of mice in different groups observed under microscope

表2 NAS積分在各組間的比較Table 2 NAS integral comparisons between groups

2.3 茯磚茶對小鼠肝臟氧化應激水平的影響

與空白對照組相比，模型組小鼠肝組織MDA質量摩爾濃度較高、GSH-PX與SOD活力較低（P<0.05）；與模型組相比，各用藥組小鼠肝組織GSH-PX和SOD活力較高，MDA質量摩爾濃度較低，其中茯磚茶高劑量組SOD活力最高，阿托伐他汀組GSH-PX活力最高，茯磚茶中劑量組MDA質量摩爾濃度最低（P<0.05），結果見表3。

表3 肝臟氧化應激指標的比較（±SD，n=10）Table 3 Comparison of hepatic oxidative stress indexes（±SD，n=10）

表3 肝臟氧化應激指標的比較（±SD，n=10）Table 3 Comparison of hepatic oxidative stress indexes（±SD，n=10）

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2.4 茯磚茶對小鼠肝功能的影響

與空白對照組相比，模型組肝組織ALT、AST活力較高（P<0.05）；與模型組相比，各用藥組肝組織ALT、AST活力較低，其中茯磚茶中劑量組ALT、高劑量組AST活力最低（P<0.05），結果見表4。

表4 肝臟勻漿轉氨酶活力的比較（±SD，n=10）Table 4 Comparison of transaminase activity in liver homogenate（±SD，n=10）

表4 肝臟勻漿轉氨酶活力的比較（±SD，n=10）Table 4 Comparison of transaminase activity in liver homogenate（±SD，n=10）

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2.5 對脂類物質合成相關指標的影響

2.5.1HMGCR基因表達 與空白對照組相比，模型組肝組織HMGCR基因表達升高（P<0.05）；與模型組相比，各用藥組肝組織HMGCR基因表達降低（P<0.05），其中阿托伐他汀組和茯磚茶不同劑量組之間HMGCR基因表達無差別（P>0.05），結果見表5和圖3。

表5 肝臟HMGCR數(shù)據(jù)（±SD，n=10）Table 5 Liver HMGCR data（±SD，n=10）

表5 肝臟HMGCR數(shù)據(jù)（±SD，n=10）Table 5 Liver HMGCR data（±SD，n=10）

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2.5.2PPAR-γ基因表達 與空白對照組相比，模型組肝組織PPAR-γ基因表達較高（P<0.05）；與模型組相比，各用藥組肝組織PPAR-γ基因表達降低（P<0.05），其中茯磚茶不同劑量組PPAR-γ基因表達低于阿托伐他汀組（P<0.05），結果見表6和圖4。

圖4 肝臟PPAR-γ基因表達擴增曲線和溶解曲線Fig.4 Amplification curve and dissolution curve of PPAR-γgene expression in liver

表6 肝臟PPAR-γ數(shù)據(jù)（±SD，n=10）Table 6 Liver PPAR-γdata（±SD，n=10）

表6 肝臟PPAR-γ數(shù)據(jù)（±SD，n=10）Table 6 Liver PPAR-γdata（±SD，n=10）

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圖3 肝臟HMGCR基因表達擴增曲線和溶解曲線

Fig.3 Expression and dissolution curves of HMGCR gene in liver

2.5.3SCD-1基因表達 與模型組相比，各用藥組小鼠肝臟SCD-1基因表達較低（P<0.05），阿托伐他汀組和各用藥組之間的SCD-1基因表達無差別（P>0.05），茯磚茶高、中劑量組SCD-1基因表達低于茯磚茶低劑量組（P<0.05），結果見表7和圖5。

圖5 肝臟SCD-1基因表達擴增曲線和溶解曲線Fig.5 Expression amplification curve and dissolution curve of liver SCD-1 gene

表7 肝臟SCD-1數(shù)據(jù)（±SD，n=10）Table 7 Liver SCD-1 data（±SD，n=10）

表7 肝臟SCD-1數(shù)據(jù)（±SD，n=10）Table 7 Liver SCD-1 data（±SD，n=10）

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2.6 討論

理想的動物模型是研究疾病至關重要的因素，APOE-/-小鼠血漿中乳糜微粒、LDL、VLDL等物質清除受損，導致肝臟有大量的脂類物質的沉積，APOE-/-小鼠可以較好地模擬人類NAFLD發(fā)生發(fā)展過程，是研究NAFLD較好的模型之一[12-13]。病理形態(tài)學顯示模型組小鼠肝臟有大量脂類物質的沉積，茯磚茶高、中劑量組灌胃治療給藥起到很好的逆轉脂類物質在肝臟的沉積的效果，但是茯磚茶低劑量組抑制脂類物質在肝臟沉積效果較差，說明茯磚茶必須達到一定劑量才可以有效地發(fā)揮抑制脂類物質沉積的效果。阿托伐他汀治療性給藥抑制脂類物質形成的效果差于茯磚茶高、中劑量組，說明茯磚茶是通過多種途徑發(fā)揮抑制脂類物質沉積的效果。本次實驗中選擇了SCD-1、PPAR-γ、HMGCR3個指標來觀察茯磚茶用藥對肝脂合成代謝的影響。

SCD-1是脂質代謝的核心，催化?；o酶A底物從頭合成不飽和脂肪酸的限速步驟[14]。SCD-1在肝臟和脂肪組織中表達豐富，在脂肪生成中發(fā)揮重要作用。有研究顯示，SCD-1可以調控甘油三酯和膽固醇等脂類物質的合成與吸收，其異常表達將會導致脂類物質代謝紊亂，從而導致肝脂變的形成[15]。從實驗結果可見，模型組小鼠由于脂類物質合成過多，導致大量SCD-1的基因表達，結合病理形態(tài)學可見SCD-1的表達和肝臟脂肪變性呈正相關。而茯磚茶不同劑量組和阿托伐他汀組小鼠用藥之后可以起到很好抑制SCD-1表達的效果，從而有效地抑制脂類物質的合成與吸收，改善了脂類物質代謝紊亂。

PPAR-γ在糖脂代謝形成過程中發(fā)揮著至關重要的作用[16]。NAFLD小鼠肝臟中PPAR-γ基因和蛋白質表達升高，從而促進了NAFLD的發(fā)生，并認為血液中FFA的升高激活了PPAR-γ信號通路[17-19]。模型組小鼠肝臟PPAR-γ基因表達升高，促進了脂肪組織在肝臟的合成，而茯磚茶不同劑量組和阿托伐他汀組小鼠治療給藥可以起到很好地抑制PPAR-γ表達的效果，從而抑制脂肪組織在肝臟的沉積。

HMGCR活性對控制從頭合成膽固醇有重要作用，表達上調則體內(nèi)膽固醇合成增加，臨床多應用他汀類藥物抑制HMGCR表達來降低膽固醇，故調控HMGCR表達是維持體內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)的關鍵步驟[20]。模型組小鼠肝臟HMGCR基因表達升高，反映APOE-/-小鼠長期高脂飲食促進了膽固醇合成。阿托伐他汀組小鼠肝臟HMGCR基因表達下降，茯磚茶不同劑量組也可以抑制HMGCR的基因表達，從而達到抑制膽固醇合成效果。

氧化應激在NAFLD發(fā)生發(fā)展過程中起著至關重要的作用[21]，當動物攝取外源性脂類物質過多時，便會導致肝細胞中多余的游離脂肪酸脂質過氧化，產(chǎn)生大量活性氧（ROS），當生成量超過機體的清除能力便會導致氧化應激損傷。大量ROS的生成導致線粒體功能受損，脂代謝障礙，肝脂變的形成[22-23]。氧化應激的持續(xù)激活有誘發(fā)肝纖維化、肝硬化的風險，針對氧化應激及炎癥的治療是延緩NAFLD進一步發(fā)展的有效措施[24-25]。本實驗中結果顯示模型組由于過剩的游離脂肪酸脂質過氧化，產(chǎn)生大量脂質過氧化產(chǎn)物MDA，同時消耗了SOD、GSH-PX等抗氧化酶。而茯磚茶用藥組和阿托伐他汀組小鼠由于用藥治療后抑制了氧化應激，抑制了ROS的產(chǎn)生，改善了脂代謝障礙，減輕了肝臟脂肪變性，由此可見茯磚茶具有很好的抗氧化能力。

正常人體中AST和ALT含量極低，當各種原因破壞肝細胞之后，便會導致肝細胞膜破裂，胞漿中的酶類物質入血。因此，AST和ALT含量是反映肝細胞損傷比較敏感的指標[26]。本次實驗中模型組小鼠肝臟受損程度重于用藥組，說明茯磚茶和阿托伐他汀治療性給藥可以起到保護肝細胞的效果。

3 結 語

由實驗結果可知，茯磚茶逆轉NAFLD形成是多方面的，其可能機制為通過抑制PPAR-γ、HMGCR、SCD-1基因表達來抑制肝臟脂類物質的合成，從而減輕肝臟脂肪變性，減輕脂質過氧化所造成的肝臟氧化應激損傷，有效保護了肝細胞，防止NAFLD的進一步演化發(fā)展。NAFLD至今尚無很好的藥物治療方法，茶作為一種天然抗氧化劑，同時作為我國古老的藥用本草。茯磚茶良好的臨床及動物實驗效果為臨床實踐用藥提供新的思路，具有非常重要的應用價值。實驗結果證實了茯磚茶在抑制脂類物質合成和抗氧化方面具有很好的效果，近年來研究表明，腸道菌群和膽汁酸代謝異常與NAFLD的形成密切相關，茯磚茶作為后發(fā)酵茶，已證實具有很好的調節(jié)腸道菌群的作用[27]，但是否通過調節(jié)腸道菌群和膽汁酸的代謝還不得而知。后續(xù)實驗將以“膽汁酸和腸道菌群-腸-肝軸”為主線展開茯磚茶治療性給藥對NAFLD的系統(tǒng)研究，以期為茯磚茶的臨床應用提供科學依據(jù)。