卵蛋白源胰脂肪酶抑制肽的制備及其對小鼠體質量控制效果

王 璐， 武雅珍， 焦明雅， 李志成

（西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌712100）

近年來，肥胖發(fā)生率呈快速上升趨勢。據統計，全球肥胖患者的增長速度為每5年翻一番，每年因肥胖引起的直接或間接死亡人數已達30萬，肥胖已成為僅次于吸煙之后的第二個健康危險因素[1]，肥胖也是繼癌癥和心腦血管疾病之后威脅人類健康的第三大疾病[2]。肥胖和飲食密切相關，當人體攝入食物的熱量大于消耗量時，多余的熱量會轉變?yōu)橹?，在體內積聚形成肥胖[3]，食物脂肪的過量攝入會增加發(fā)生肥胖的風險。因此，控制飲食中脂肪的攝入和機體對于脂肪的吸收對改善肥胖有重要作用[4-5]。

機體攝食后，胰脂肪酶將膳食脂肪水解為單酰甘油和游離脂肪酸[6]，在腸道內再吸收，合成新的脂肪[7]。胰脂肪酶抑制劑可有效抑制胰脂肪酶活性，降低胰脂肪酶對脂肪的分解作用，減少脂肪再合成，抑制機體內脂肪過度堆積，發(fā)揮控制、治療肥胖的作用[8]。目前，奧利司他（Orlistat）是市場上被廣泛認同和購買使用的胰脂肪酶抑制劑類減肥藥物，但具有失眠、乏力、增加心率，甚至心律失常、心力衰竭、猝死等副作用[9]。因此，研發(fā)具有減肥作用的藥物和輔助減肥的功能性食品已成為食品生物技術界、營養(yǎng)學界研究的熱點。

我國雞蛋生產總量超過了世界生產總量的1/3，但目前關于雞蛋的深加工較少，雞蛋的綜合利用率較低[10-12]。作者以卵蛋白為原料，采用酶工程技術制備卵蛋白源胰脂肪酶抑制肽 （Pancreatic lipase inhibitory peptide from albumin，PLIPA），研究其對豬胰脂肪酶的抑制作用，并通過建立營養(yǎng)型肥胖小鼠模型，研究PLIPA對肥胖小鼠的體質量控制效果，為研發(fā)減肥功能食品提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞蛋：購于陜西省楊凌示范區(qū)主要超市。

胰蛋白酶：北京索萊寶科技有限公司產品；堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶：西安熱默爾生物科技有限公司產品；豬胰脂肪酶、對硝基苯酚棕櫚酸酯：上海阿拉丁生化科技股份有限公司產品；奧利司他：薩恩化學技術有限公司產品；茶多酚：北京賽多利斯儀器系統有限公司產品；L-阿拉伯糖：山東福田藥業(yè)有限公司產品；原花青素：上海文森生物科技有限公司產品；茶多酚：山東福瑞達醫(yī)藥集團有限公司產品；總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）等試劑盒：南京建成生物工程研究所有限公司產品；其他試劑均為國產分析純。

1.2 實驗動物及飼料

7周齡C57BL/6J小鼠，由斯貝福（北京）生物技術有限公司提供，經中國食品藥品鑒定研究院檢測質量合格，實驗動物使用證號為SCXK（京）2016-0002。

高脂飼料組分（質量分數）：豬油10%，膽固醇1%，膽酸鈉0.5%，蔗糖10%，基礎飼料78.5%。

1.3 儀器與設備

UV-1700雙光束紫外光分光光度計：日本島津公司產品；LGJ-25C真空冷凍干燥機：北京四環(huán)儀器廠制造；JA3003型電子天平：北京賽多利斯科學儀器有限公司產品；Z216MK臺式高速冷凍離心機：德國Hermle公司產品；Victor X3多功能酶標儀：美國PE公司產品。

1.4 實驗方法

1.4.1 PLIPA的制備

1）制備卵蛋白粉 將新鮮雞蛋洗凈，消毒后分離蛋清，真空冷凍干燥成粉，保存?zhèn)溆?。采用GB/T 5009.5—2010凱氏定氮法[13]測定其粗蛋白質質量分數為80.85%。

2）篩選水解卵蛋白粉最佳蛋白酶 參照劉爽的方法進行水解[14]，將卵蛋白粉配成蛋白質質量濃度80 g/L溶液，沸水浴20 min使蛋白質變性，冷卻至反應溫度后放入水浴鍋，調節(jié)pH至最適條件（見表1），加入蛋白酶水解3 h，煮沸10 min滅活，冷卻至室溫，5 000 r/min離心20 min，取上清液（PLIPA）測定對胰脂肪酶活性的抑制率或在-20℃冷凍保存，根據抑制率的高低篩選出最佳蛋白酶。

表1 5種蛋白酶適宜水解參數Table 1 Optimum hydrolysis parameters of five proteases

3）優(yōu)化制備PLIPA以PLIPA對胰脂肪酶活性的抑制率為指標，分別研究最佳蛋白酶在最適pH條件下水解時間（酶解時間）、加酶量和水解溫度（酶解溫度）等工藝參數對其水解效果的影響，以獲得具有較高抑制脂肪酶活性作用的PLIPA。通過單因素實驗篩選各個因素的水平范圍值，采用響應面方法和利用Desigh-Expert軟件進行三因素三水平Box-Behnken Desigh（BBD）中心組合實驗設計[15-17]，優(yōu)化制備PLIPA的最佳工藝參數。

4）卵蛋白源活性肽對胰脂肪酶的抑制率測定參照Zheng和雷啟義的方法測定[18-19]。經測定，對硝基苯酚標準曲線方程為y=4.641 3x-0.024 9，R2=0.999 3。

參照Gómez-ruiz[20]方法進行模擬胃腸液消化實驗。參照魯偉[21]的方法測定多肽含量，將Gly-Gly-Tyr-Arg四肽修改為氧化型谷胱甘肽（GSSG），經測定，GSSG質量濃度與吸光度的標準曲線方程為y=8.481 1x，其中R2=0.997 9。

對于金融業(yè)而言，大量的用戶、長期的運營產生了海量的數據，包括存款貸款、客戶信息、理財投資等。通過人工智能技術進行數據分析，可以更有效地勾勒用戶畫像，制訂個性化、智能化的客戶方案，提供友好的智能客服助手，從而達到提升用戶粘性和吸引新的優(yōu)質客戶的目標。在互聯網+金融的背景下，金融服務會更多依賴信用機制，以降低呆賬、壞賬的概率，實現風險控制。例如螞蟻金服將人工智能應用到互聯網小貸、保險、征信、理財、客戶服務等多個領域，將虛假交易率降低了近10倍。芝麻信用通過分析用戶在阿里巴巴業(yè)務體系內的行為得出不同芝麻分，并放以不同金額的消費貸款。

1.4.2 PLIPA對肥胖小鼠的體質量控制效果

1）實驗分組 48只C57BL/6J小鼠用基礎飼料適應性飼喂3 d后按體質量分為6組：正常對照組，肥胖模型對照組，陽性藥物組，PLIPA低、高劑量組和復合組。除正常組給予基礎飼料喂養(yǎng)外，其余5組以高脂飼料飼喂（高脂組），以所有高脂組體質量均值>（正常組均值+2×標準誤差）來判斷造模是否成功[22]。造模成功后，各組飼料維持不變，每天同一時間灌胃給藥10μL/g（以體質量計），正常組、肥胖模型組灌胃等體積生理鹽水；陽性藥物組（奧利司他），PLIPA低、高劑量組分別給藥劑量60、400、800 mg/（kg·d），復合組劑量400 mg/（kg·d）（復合組中m（茶多酚）∶m（PLIPA）∶m（原花青素）∶m（L-阿拉伯糖）=4∶3∶2∶1）。實驗期間，小鼠自由攝食飲水，每5 d稱一次體質量，連續(xù)給藥28 d后取血、解剖。

2）指標測定 給藥結束后，禁食12 h，稱體質量，眼眶采血。血液室溫放置1 h，在4℃冰箱放置30 min，3 000 r/min離心10 min，收集血清，參照試劑盒說明測定TG、TC、HDL-C及LDL-C含量。采用頸椎脫臼處死小鼠，將小鼠平攤仰臥，用直尺準確測量小鼠鼻尖至肛門的長度為體長。解剖后，觀察小鼠體內臟器變化及脂肪沉著情況，取腹部與皮下脂肪和肝臟，稱質量，計算Lee′s指數、腹部與皮下脂肪系數、肝指數[23-24]，計算公式分別如下：

式中：I1為Lee′s指數；I2為腹部脂肪系數；I3為皮下脂肪系數；I4為肝指數；M為小鼠體質量，g；L為體長，cm；Ma為腹部脂肪濕質量，g；MS為皮下脂肪濕質量，g；M1為肝臟濕質量，g。

1.4.3 數據處理與統計分析 體外每組實驗做3個重復，結果以“平均值±標準偏差（X±SD）”的形式表示，使用Origin 8.5軟件進行數據統計和圖表繪制，采用SPSS 20.0統計軟件對有關數據進行顯著性分析，必要時結合最小顯著差數檢驗（LSD.test）進行分析，P<0.05認為統計學差異顯著。

2 結果與分析

2.1 卵蛋白水解酶的篩選

卵蛋白中所含多種特定生物活性肽的序列，能否被釋放出來并表現其生物活性，關鍵在于所選酶的種類、水解時間、加酶量及溫度[25]。經測定未被水解的卵蛋白（空白組）對胰脂肪酶的抑制率為（13.60±0.43）%，5種蛋白酶的卵蛋白源活性肽對胰脂肪酶的活性均表現出抑制作用（見表2）。除胃蛋白酶外，各蛋白酶的PLIPA對胰脂肪酶的抑制率均高于未被水解的卵蛋白對胰脂肪酶的抑制率，經差異顯著性分析，中性蛋白酶、堿性蛋白酶和胃蛋白酶的PLIPA對胰脂肪酶的抑制率與未被水解的卵蛋白對胰脂肪酶的抑制率存在顯著性差異（P<0.05），堿性蛋白酶的PLIPA對胰脂肪酶的抑制率顯著高于其他酶（P<0.05），為（49.77±0.10）%，胃蛋白酶的PLIPA對胰脂肪酶的抑制率最小，僅為（6.46±6.79）%?？赡苁遣煌拿笇β训鞍椎淖饔梦稽c不同，胃蛋白酶主要傾向于剪切氨基端或羧基端芳香族氨基酸或亮氨酸的肽鍵[26]。胰蛋白酶與木瓜蛋白酶主要的水解位點相似，為精氨酸或賴氨酸的羧基端，因此其對胰脂肪酶的抑制率也接近[27]。中性蛋白酶催化位點多，特異性較差，以水解芳香族疏水性氨基酸殘基作為羧基端肽鍵為主[28]。堿性蛋白酶作用范圍較廣，作用位點傾向于羧基側具有芳香烴或疏水性的氨基酸，比中性蛋白酶具有更大的水解能力和耐堿力，有較強的耐熱性且具有一定的酯酶活力[28]，最終選用堿性蛋白酶水解卵蛋白制備PLIPA。

表2 5種蛋白酶的卵蛋白源活性肽對胰脂肪酶的抑制效果Table 2 Inhibitory effect of active peptides from ovalbumin hydrolyzed by five proteases on pancreatic lipase

2.2 堿性蛋白酶水解卵蛋白單因素實驗

2.2.1 水解時間 由圖1可知，PLIPA對胰脂肪酶的抑制率隨水解時間先增大后減小，在3 h時，抑制率最大，隨后呈下降趨勢。其原因可能是隨著水解時間的延長，水解液中具有抑制胰脂肪酶功能的肽類被降解，致使其對胰脂肪酶的抑制率下降。初步選取水解時間為3 h進行下一步實驗。

圖1 水解時間對卵蛋白源活性肽抑制胰脂肪酶效果的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on pancreatic lipase inhibitory rate of active peptides from ovalbumin

圖2 加酶量對卵蛋白源活性肽抑制胰脂肪酶效果的影響Fig.2 Effect of additive amount on pancreatic lipase inhibitory rate of active peptides from ovalbumin

2.2.3 水解溫度 由圖3可以看出，PLIPA對胰脂肪酶的抑制率隨水解溫度的升高呈現先增大后減小的趨勢，在60℃時，抑制率達到最大值，且與其他溫度具有顯著差異（P<0.05）；在45~60℃范圍內，溫度升高，分子間運動加劇，酶與底物間的接觸機會增加，水解產生活性肽的速率增大；當溫度高于60℃時，酶的活性因高溫逐漸降低，底物水解水平降低，產生活性肽的速率減小，對胰脂肪酶的抑制率隨之降低。初步確定卵蛋白的水解溫度為60℃。

圖3 水解溫度對卵蛋白源活性肽抑制胰脂肪酶效果的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on pancreatic lipase inhibitory rate of active peptides from ovalbumin

2.3 卵蛋白水解工藝的響應面優(yōu)化實驗

根據單因素結果，設計響應面實驗（見表3）。用自變量X1、X2、X3分別表示水解時間、加酶量、水解溫度，以PLIPA對胰脂肪酶的抑制率為響應值Y，結果見表4。

表3 響應面實驗因素與水平設計Table 3 Factors and level design for response surface experiment

將表4中的數據進行多元回歸擬合，得到回歸方程：Y=51.79+2.55X1+0.79X2+3.19X3+1.74X1X2+1.02X1X3+0.63X2X3+1.54X12-1.99X22+0.53X32。由表5知，該回歸方程模型的P=0.008 4<0.01，模型極顯著，失擬項P=0.241 7>0.05，差異不顯著，說明模型可靠。各因素對PLIPA抑制胰脂肪酶的效果影響大小為水解溫度>水解時間>加酶量。一次項中水解溫度、時間對PLIPA抑制胰脂肪酶的效果極顯著（P<0.01），加酶量影響不顯著，交互項均不顯著；二次項中僅加酶量顯著?？芍鉁囟葘LIPA抑制胰脂肪酶的效果影響最大，控制好水解溫度對獲得具有高胰脂肪酶抑制活性的PLIPA至關重要。

表4 響應面分析方案及實驗結果Table 4 Analysis scheme and experimental results for response surface

表5 回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance of regression model

由圖4可知，PLIPA對胰脂肪酶的抑制率隨水解時間的增大而增大，隨水解溫度的升高而減小，隨加酶量的增加先增大后減少。結合回歸模型，利用Design-Expert.V 8.0.6軟件得出制備PLIPA的最佳工藝條件為：水解時間4 h，加酶量2 240 U/g，溫度55℃，此時對胰脂肪酶抑制率預測值為59.04%。經3次平行實驗測得對胰脂肪酶抑制率為（56.06±2.64）%，與預測值接近，說明建立模型準確可靠，在最優(yōu)水解條件下，可制備PLIPA。

圖4 各因素交互作用對胰脂肪酶抑制率的影響Fig.4 Interactive effects of various factors on the pancreatic lipase inhibitory rate

2.4 PLIPA模擬胃腸液消化實驗

PLIPA經模擬胃液消化后，對胰脂肪酶的抑制率差異不顯著（P>0.05）；經模擬胃液消化再經過模擬腸液消化后，其每毫克肽對胰脂肪酶的抑制率顯著降至0.46%（P<0.05），但胰脂肪酶抑制率為（43.38±0.02）%（見表6），達到預期效果，說明PLIPA在模擬胃腸道消化后仍具有較高的胰脂肪酶抑制活性。

表6 PLIPA模擬胃腸液消化后對胰脂肪酶的抑制率Table 6 Pancreatic lipase inhibitory rate of PLIPA after simulate gastrointestinal digestion

2.5 PLIPA對肥胖小鼠的影響

2.5.1 PLIPA對小鼠體質量和Lee′s指數的影響實驗開始前小鼠平均體質量(19.00±2.00)g，組間差異不顯著（P>0.05）。建模40 d，高脂飼料喂養(yǎng)組體質量均值27.04 g>（正常對照組均值+2×標準誤差）20.00 g，且高脂組均顯著高于正常組（P<0.01），說明建模成功。小鼠初始體質量、給藥初與給藥28 d后小鼠體質量平均值和Lee′s指數變化結果如表7。

經統計學分析，各處理組與肥胖模型組在攝食量方面差異不顯著（P>0.05），表明灌胃操作對小鼠攝食量影響不大。由表7可知，建模成功后，高脂飼料喂養(yǎng)小鼠體質量均顯著高于正常組（P<0.05）。給藥28 d后，與肥胖模型組相比，各處理組體質量均有下降，表明灌胃PLIPA對減輕小鼠體質量有一定控制作用，其中PLIPA復合組的體質量顯著低于肥胖模型組（P<0.05）。徐方旭等[30]研究原花青素對肥胖小鼠的脂解作用，結果表明，不同劑量的原花青素均能降低肥胖昆明小鼠的體質量，150 mg/(kg·d)原花青素在降低小鼠體質量方面效果最佳，小鼠體質量降低量為4.0 g。吳建章等[31]研究了L-阿拉伯糖對營養(yǎng)型大鼠的減肥效果，發(fā)現給藥L-阿拉伯糖低、高劑量組（給藥劑量分別為1.5、3 g/（kg·d）），飼養(yǎng)20、40 d后，體質量均明顯降低，低劑量組給藥20、40 d體質量分別降低72.8、81.5 g，高劑量組給藥20、40 d分別降低132.8、161.5 g。連麗娜等[32]以昆明種小白鼠為研究對象，研究茶多酚對小鼠營養(yǎng)性肥胖的預防及減肥作用，減肥組分低、中、高劑量組，給藥劑量分別為200、400、600 mg/（kg·d），給藥茶多酚第45天，經與肥胖模型組相比，發(fā)現低、中、高劑量組小鼠體質量差異不顯著，給藥第90天，中、高劑量組顯著降低，體質量分別降低10.7、11.8 g，而本研究中PLIPA低、高劑量組差異不顯著，可能是給藥劑量偏低或給藥時間偏短導致。另外，PLIPA復合組Lee′s指數相對于肥胖模型組顯著降低（P<0.01），表明PLIPA復合物對塑造高脂小鼠良好體形作用顯著。PLIPA低、高劑量及復合組與陽性藥物組無顯著差異性，表明給藥PLIPA可達到與陽性藥物同樣的效果，甚至較奧利司他控制體質量效果更好。

表7 PLIPA對小鼠體質量及Lee′s指數影響Table 7 Effects of PLIPA on body weight and Lee′s index in mice

2.5.2 PLIPA對小鼠脂肪系數和肝指數的影響 與正常組小鼠相比，高脂喂養(yǎng)的小鼠腹部脂肪濕質量、腹部與皮下脂肪系數和肝指數均升高（見表8），其中PLIPA復合組脂肪濕質量較肥胖模型組顯著降低（P<0.05）。與肥胖模型組相比，PLIPA處理組、復合物組與陽性藥物組的腹部脂肪系數降低，表明PLIPA及其復合物對高脂喂養(yǎng)小鼠的腹部脂肪具有控制作用。與正常組相比，陽性藥物組及PLIPA低、高劑量組、復合物組的皮下脂肪系數顯著升高（P<0.05），表明高脂飲食可使小鼠皮下脂肪堆積。與肥胖模型組相比，PLIPA低、高劑量組及復合組肝指數有所降低，其中，PLIPA高劑量組肝指數存在極顯著差異（P<0.01），PLIPA高劑量可控制因肥胖導致肝指數的異常，且與陽性藥物效果相當，說明PLIPA可一定程度抑制小鼠體內的脂肪堆積，對體質量有控制作用。

表8 PLIPA對小鼠脂肪濕重及脂肪系數、肝系數的影響Table 8 Effects of PLIPA on fat wet weight，fat and liver coefficient in mice

2.5.3 PLIPA對小鼠血液指標的影響 與正常組相比，各高脂組小鼠血脂4項指標TC、TG、HDL-C和LDL-C均升高（見表9）。給藥陽性藥物、PLIPA及復合物的處理組，4項指標相比肥胖模型組均降低，表明給藥PLIPA可以控制高脂小鼠血脂指標的上升，其中，PLIPA復合組對LDL-C指標的控制存在顯著作用（P<0.05）。

注：表中*表示與正常對照組相比，P<0.05差異顯著，**表示P<0.01差異極顯著；#表示與肥胖模型對照組相比，P<0.05差異顯著，##表示P<0.01差異極顯著。

3 結語

制備卵蛋白源胰脂肪酶抑制肽（PLIPA）的最佳蛋白酶是堿性蛋白酶，最佳工藝條件是在底物質量濃度80 g/L的卵蛋白，加入堿性蛋白酶2 240 U/g，55℃、pH 9.0條件下酶解4 h，PLIPA對胰脂肪酶抑制率達（56.06±2.64）%。PLIPA經胃腸液消化后，對胰脂肪酶的抑制率有所降低但仍可達到預期。小鼠動物實驗表明，PLIPA低、高劑量及復合組均不同程度控制體質量增長以及脂肪的堆積，達到控制小鼠體形和體質量的目的，且隨著給藥劑量的增大，控制體質量的作用更為明顯。另外，與PLIPA低、高劑量組相比，PLIPA與L-阿拉伯糖、茶多酚、原花青素復合組對小鼠體質量、體形控制效果最佳。需注意的是PLIPA黏性較大，容易堵塞分離柱，未能鑒定出具有抑制脂肪酶酶活的活性肽的結構，需待進一步研究。