豆粕源抗氧化肽的制備、鑒定與活性表征

潘風(fēng)光， 蔡轉(zhuǎn)章， 伍海波， 劉靜波， 劉博群， 張 婷*

（1.吉林大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春130062；2.吉林大學(xué) 吉林省營養(yǎng)與功能食品重點實驗室，吉林長春130062）

豆粕，是豆油加工的主要副產(chǎn)物，含有豐富的蛋白質(zhì)，且80%以上為水溶性蛋白質(zhì)[1]。然而在國內(nèi)通常用于飼料加工，少部分用于發(fā)酵食品加工[2-3]，造成了極大的蛋白質(zhì)資源浪費。研究表明，將豆粕進(jìn)行酶解，可制備出具有良好生物活性的功能肽[4]，包括抗氧化肽[5-6]、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制肽[7-8]、金屬螯合肽[9-10]等，并且隨著自由基理論的提出，天然抗氧化劑的需求量與日俱增[11]。因此，利用豆粕制備抗氧化肽，不僅能減少資源浪費，還能提高豆粕的附加值，在食品工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前國內(nèi)外對于抗氧化肽的研究，僅局限于制備和活性檢測，以及肽序列的鑒定及表征[12-14]層面。HE Shudong等[15]使用胰蛋白酶水解假鮑魚制備抗氧化肽，并鑒定得到八肽序列DTETGVPT；WANG Xueqin等[16]經(jīng)過分離純化太平洋鯡魚抗氧化肽，鑒定出LHDELT和KEEKFE 2條六肽序列；SHENG Jianyong等[17]從脫脂核桃中鑒定得到序列為DWMH的抗氧化肽。多肽結(jié)構(gòu)與其抗氧化活性之間有著密切關(guān)系，因此鑒定抗氧化肽的序列結(jié)構(gòu)是揭示構(gòu)效關(guān)系的基礎(chǔ)，也是后續(xù)定向大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用的前提。

本研究中以大豆粕為原料，采用超聲輔助酶解法制備抗氧化肽并優(yōu)化制備工藝，利用超濾進(jìn)行分離純化獲得相對分子質(zhì)量<1 000組分，應(yīng)用LCMS/MS確證高活性組分中肽序列，最后合成上述肽序列進(jìn)行活性表征。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆粕：市售；堿性蛋白酶：長春市天佳生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉：北京化工廠制造；過硫酸鉀：天津市華東試劑廠制造；ABTS、Trolox、AAPH、熒光素鈉：美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；甲酸、乙腈：美國Fisher Scientific公司產(chǎn)品；羥自由基測定試劑盒：南京建成有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

Starter2C pH計：奧豪斯儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；SynergyHT酶標(biāo)儀：BioTek公司產(chǎn)品；CR20B2高速冷凍離心機：日立有限公司產(chǎn)品；XX8200230小型切向流超濾系統(tǒng)：Millipore有限公司產(chǎn)品；FD-1C-50凍干機：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司產(chǎn)品；Orbitrap Elite高場靜電場軌道離子肼質(zhì)譜儀：美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 豆粕酶解工藝 將豆粕進(jìn)行粉碎并經(jīng)60目篩子篩分，得到豆粕粉用于后續(xù)實驗：

豆粕粉+蒸餾水→超聲處理→90℃變性10 min→酶解（保持溫度及pH波動范圍在±0.1）→90℃滅酶10 min→4℃、4 000 r/min離心20 min→取上清液。

1.3.2 豆粕抗氧化肽制備單因素實驗 按照上述步驟，分別考察酶解條件及超聲條件對制備豆粕抗氧化肽的活性影響，以ABTS自由基清除率為評價指標(biāo)，如表1所示。在各單因素條件下，其他因素條件均選擇中間條件，若條件已得到優(yōu)化，則選擇最優(yōu)條件。

表1 單因素設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels of single factor design

1.3.3 豆粕抗氧化肽制備響應(yīng)面實驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取溫度、加酶量、超聲功率和超聲時間進(jìn)行Box-Behnken Design（見表2）。

表2 響應(yīng)面設(shè)計因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface design

1.3.4 豆粕抗氧化肽的鑒定 通過超濾處理獲得相對分子質(zhì)量<1 000的組分進(jìn)行LC-MS/MS鑒定。色譜條件：使用C18色譜柱（100μm×2 cm，4μm）；流動相：A相為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水，B相為含0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸的乙腈溶液；梯度洗脫：0~60 min，5%~35%B；60~64 min，35%~75%B；64~74 min 75%B；流量為300 nL/min。質(zhì)譜條件：納米ESI源；采用數(shù)據(jù)依賴性采集模式，先在FT模式下以60 000的分辨率進(jìn)行全MS掃描，然后對初始MS掃描中的15種最豐富離子進(jìn)行CID MS/MS掃描。

1.3.5 豆粕源抗氧化肽的合成 委托生工生物工程股份有限公司進(jìn)行合成，純度達(dá)98%。

1.3.6 體外抗氧化活性測定

1）ABTS自由基清除能力 參照Heeger等[18]的實驗方法稍做改動。實驗分組：空白組（200μL PBS），對照組（180μL ABTS工作液+20μL PBS），實驗組（180μL ABTS工作液+20μL樣品）。實驗結(jié)果以ABTS自由基清除率表示，計算公式如下：

式（1）中：Ac為對照組吸光度，As為實驗組吸光度，Ab為空白組吸光度。

2）氧自由基吸收能力 參照ZHENG Li等[19]的實驗方法并略做改動。實驗分組：空白組（120μL熒光素鈉+20μL PBS+60μL AAPH），對照組（120μL熒光素鈉+20μL Trolox+60μL AAPH），實驗組（120μL熒光素鈉+20μL樣品+60μL AAPH）。相鄰2個測定點的時間間隔為2 min，每次讀數(shù)前振板10 s，連續(xù)測定10 h。實驗結(jié)果以O(shè)RAC值（mg TE/mg）表示，計算公式如下：

式（2）中：netAUC為對應(yīng)樣品保護面積，M為對應(yīng)樣品質(zhì)量濃度，mg/mL。

式（3）中：AUC為對應(yīng)樣品的熒光衰退曲線面積。

式（4）中：f0為初始0 min時的熒光強度，fi為第i個測定點的熒光強度。

3）羥自由基清除能力 按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，實驗結(jié)果用羥自由基清除率表示，計算公式如下：

式（5）中：Ac為對照組吸光度；As為實驗組吸光度；Ab為空白組吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），結(jié)果以P<0.05為顯著性差異判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆粕抗氧化肽的單因素實驗

酶解條件主要通過改變酶活性[20-21]來影響酶解反應(yīng)，從而導(dǎo)致酶解產(chǎn)物的抗氧化能力不同。由圖1（a）可知，隨著pH增大，清除率逐漸增大，在pH為11.0時達(dá)到最大值，但通過顯著性分析，在pH為8.0~11.0時，清除能力并沒有太大差異，因此選擇8.0為最優(yōu)pH，此條件更接近中性，不僅能降低成本還能減少后續(xù)處理工作量。隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，清除率亦呈現(xiàn)出不斷增大的趨勢，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)超過9%后，底物過量，酶解速率已達(dá)到最大，此時產(chǎn)物生成速率相對穩(wěn)定，產(chǎn)物抗氧化活性也趨于穩(wěn)定。加酶量的趨勢變化與底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)一致，當(dāng)加酶量為7 000 U/g時達(dá)到峰值，此后繼續(xù)增大酶量，底物不足，酶解體系達(dá)到平衡，酶解產(chǎn)物較為穩(wěn)定，因此抗氧化能力也達(dá)到穩(wěn)定。而隨著溫度升高，清除率先增大后減小，在40℃時清除率最大，之后繼續(xù)升溫，酶結(jié)構(gòu)被破壞，酶活性降低[22]，導(dǎo)致產(chǎn)物生產(chǎn)速率減小，抗氧化能力減弱。酶解時間與酶解溫度的變化趨勢相似，剛開始反應(yīng)時間過短，具有抗氧化活性的氨基酸殘基沒有被充分暴露出來[23]，隨著時間的延長，酶解產(chǎn)物逐漸增多，抗氧化能力增大。4 h后，清除率出現(xiàn)減小，推測可能是反應(yīng)時間過長，產(chǎn)物之間發(fā)生聚集效應(yīng)[24]，導(dǎo)致活性位點被掩蓋，抗氧化能力減弱。

圖1 酶解條件對抗氧化能力的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis conditions on antioxidant capacity

適當(dāng)?shù)某曁幚恚瑢τ诙蛊傻鞍踪|(zhì)溶出具有促進(jìn)作用，并且可改變豆粕蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，使得豆粕蛋白質(zhì)與酶更容易結(jié)合[25]。但底物畢竟有限，當(dāng)超聲時間和功率達(dá)到一定范圍后，再延長時間及增大功率并不能溶出更多的豆粕蛋白質(zhì)，還可能破壞豆粕蛋白質(zhì)的分子構(gòu)象，導(dǎo)致酶解產(chǎn)物的抗氧化能力降低（見圖2）?？梢姡挥羞m宜的超聲處理才有利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行[26]，并使得豆粕肽表現(xiàn)出良好的抗氧化能力。

圖2 超聲條件對抗氧化能力的影響Fig.2 Effect of ultrasonic conditions on antioxidation resistance

2.2 豆粕抗氧化肽的響應(yīng)面實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取溫度（A）、加酶量（B）、超聲功率（C）和超聲時間（D）4個因素為自變量，以ABTS自由基清除率為響應(yīng)值（Y），進(jìn)行Box-Behnken Design，所得結(jié)果如表3、圖3所示。其他未考察單因素均為單因素優(yōu)化得到的最優(yōu)條件。

圖3 各因子交互作用的曲面圖和等高線圖Fig.3 Surface map and contour maps for each factor interaction

如表3所示，模型具有極顯著性（P<0.01），因變量與自變量之間的線性關(guān)系顯著（R2=0.966 5），并且失擬項（P>0.05）差異不顯著，說明該模型擬合程度良好，所得到的回歸方程可信度較高?；貧w方程：Y=-172.487 02+0.026 556C-1.871 66×10-3AC-0.451 87AD-0.010 954A2-6.406 53B2-1.167 9×10-4C2-0.864 79D2+2.480 67×10-6AC2+0.017 045AD2-6.795 94×10-4CD2。

表3 回歸模型方差分析及回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table 3 Significance test for variance analysis and coefficient constants of regression models

通過模型預(yù)測得到最佳工藝條件為：溫度50℃，加酶量6 665.39 U/g，超聲功率300 W，超聲時間9 min，此時模型指標(biāo)值為16.01%。為檢驗響應(yīng)面法的可行性，采用所得最佳工藝條件進(jìn)行驗證實驗，得到ABTS自由基清除率為（15.70±0.06）%，實際值與預(yù)測值的誤差小于1%，因此利用響應(yīng)面法對豆

粕抗氧化肽的制備條件優(yōu)化是可行的，得到的工藝參數(shù)具有實際應(yīng)用價值。通過與前人研究[27]相比，本實驗中所得的pH和溫度更低、加酶量更少、超聲時間更短，在實際應(yīng)用中，能有效降低生產(chǎn)成本。

續(xù)表3

2.3 豆粕抗氧化肽的鑒定

大量的研究結(jié)果表明[28-30]，當(dāng)相對分子質(zhì)量較大時，部分活性基團仍存在于大分子聚集體的內(nèi)部，導(dǎo)致抗氧化能力降低[31]，因此本實驗直接超濾得到相對分子質(zhì)量<1 000的組分進(jìn)行LC-MS/MS鑒定。結(jié)合軟件分析及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（UniProt），確定出氨基酸序列為Ile-Trp-Asn-Leu-Asn（IWNLN），位于大豆蛋白質(zhì)（B2ZF64-1）的639~643殘基位置，其相對分子質(zhì)量為658.75，等電點是6.06，平均親水性-1.3，疏水性較強。如圖4（a）所示，通過CID碰撞斷裂所產(chǎn)生的bn與yn離子系列，除b1、y1離子外，其他離子均成功匹配，匹配度較高。

圖4 IWNLN的二級質(zhì)譜圖和結(jié)構(gòu)式Fig.4 MS/MS and structure formula of IWNLN

2.4 豆粕抗氧化肽的活性表征

由圖5（a）可知，3種樣品對ABTS自由基清除能力均呈現(xiàn)出質(zhì)量濃度依賴性，通過計算，IWNLN的IC50為（0.060±0.003）mg/mL，豆粕抗氧化肽粗提液與豆粕抗氧化肽（相對分子質(zhì)量<1 000）的IC50分別為（0.412±0.022）mg/mL和（0.338±0.005）mg/mL。IWNLN之所以具有較強的ABTS自由基清除能力，是因為IWNLN上具有疏水性氨基酸Ile和Trp，當(dāng)存在于非極性的N端時可增強抗氧化活性[32-33]，且Trp的側(cè)鏈上含有吲哚基，具有供氫能力，可減緩或終止自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[34]。

圖5 （b）和圖5（c）為氧自由基吸收能力，由圖可知，在初始質(zhì)量濃度同為0.01 mg/mL時，3種樣品的抗氧化能力均比Trolox強，其中IWNLN活性最強，ORAC值可達(dá)（7.614±0.138）mg TE/mg。這是由于IWNLN上有芳香族氨基酸Trp，在ORAC反應(yīng)中，易失去氫原子而與自由基發(fā)生反應(yīng)，并且Trp還與Asn相連，可產(chǎn)生共軛效應(yīng)[35-36]，使得氫質(zhì)子更易釋放。

如圖5（d）所示，3種樣品對羥自由基清除能力均呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)，經(jīng)過計算，3種樣品的IC50分別是（0.051±0.002）、（0.038±0.001）mg/mL和（0.008±0.001）mg/mL。研究表明，芳香族氨基酸和疏水性氨基酸因其特殊的結(jié)構(gòu)，具有非常強的自由基清除能力[37]，而五肽IWNLN上不僅具有芳香族氨基酸Trp，還具有疏水性氨基酸Ile和Leu，占整個肽序列的3/5，因此IWNLN具有較強的羥自由基清除能力。

圖5 豆粕抗氧化肽的抗氧化活性Fig.5 Antioxidant activity of soybean meal antioxidant peptides

3 結(jié) 語

以ABTS自由基清除率為主要評價指標(biāo)，通過單因素和響應(yīng)面實驗確定了采用超聲輔助酶解法制備大豆抗氧化肽的最優(yōu)工藝參數(shù)為：酶解pH 8.0、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)9%、加酶量6 665.39 U/g、酶解溫度50℃、酶解時間4.0 h、超聲時間9 min、超聲功率300 W。經(jīng)過超濾處理，獲得相對分子質(zhì)量<1 000的組分進(jìn)行LC-MS/MS鑒定，獲得豆粕源抗氧化肽Ile-Trp-Asn-Leu-Asn（IWNLN），其ABTS自由基清除能力的IC50值為（0.060±0.003）mg/mL，ORAC值為（7.614±0.138）mg TE/mg，羥自由基清除能力的IC50值為（0.008±0.001）mg/mL。研究表明，豆粕源肽IWNLN具有明確的結(jié)構(gòu)和良好的抗氧化活性，可作為抗氧化功能因子為豆粕抗氧化肽功能食品開發(fā)提供新的思路。