• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    熱休克蛋白HSPA1A促進腫瘤細胞增殖的研究

    2021-07-24 14:35:14戚毓敏渠宏雁陳永泉
    食品與生物技術學報 2021年3期
    關鍵詞:數(shù)目細胞周期比例

    戚毓敏, 單 鍇, 崔 靜, 渠宏雁, 王 榮, 陳永泉*

    (1.江南大學 無錫醫(yī)學院,江蘇 無錫214122;2.江南大學 食品學院,江蘇 無錫214122)

    熱休克蛋白(HSP)[1]通常可以在機體遭受應激時大量表達[2],可以幫助細胞耐受外界環(huán)境壓力,也稱為熱應激蛋白,具有高度保守性[3]。熱休克蛋白通常根據(jù)相對分子質量大小進行分類,HSP70指的是相對分子質量在7×104左右的熱休克蛋白,主要有HSPA1A、HSPA5、HSPA8、HSPA9。HSP70是熱休克蛋白家族被研究較多的蛋白質之一[4],也是其中表達量較高的熱休克蛋白之一。HSP70主要起到分子伴侶作用,主要幫助蛋白質正確折疊,清除老舊或者受損的細胞[5]。HSP70主要存在于細胞質中,在細胞質中發(fā)揮保護細胞的作用[6],如HSPA5定位于內(nèi)質網(wǎng),HSPA9則位于線粒體上起到細胞保護的作用。同時也有研究表明,氧化應激時HSP70,如HSPA8會進入細胞核中,發(fā)生核位移,在細胞核中起到保護細胞的作用。誘導型HSP70(HSPA1A),也稱為HSP72[7],在正常生理條件下表達量較低,在發(fā)生應激時,則會大量表達,HSPA1A主要通過應激誘導大量表達從而發(fā)揮作用。HSPA1A誘導后具有保護細胞的作用。例如,HSPA1A基因通過抑制核因子-κB(NF-κB)激活來抑制促炎細胞因子基因轉錄[8],促炎細胞因子的下調保護細胞免受應激反應,防止細胞損傷或死亡從而保護機體免受應激傷害[9]。

    惡性腫瘤是當下發(fā)病死亡率較高的疾病之一。惡性腫瘤的治療是醫(yī)學和生命科學的研究重點也是難點。腫瘤的主要特點就是腫瘤細胞無限制增殖,這種增殖是不受控的,因此抑制腫瘤細胞增殖是行之有效的腫瘤治療方案之一。研究表明,在大多數(shù)腫瘤細胞中均可觀察到HSPA1A蛋白水平的增加[10],Sampson等[11]認為癌細胞擁有額外擴增的中心體,作者確定了一種新的途徑,通過NIMA相關激酶6(NEK6)和HSPA1A促進中心體聚類。NEK6及其上游激活劑可以將HSPA1A靶向到具有擴增中心體的細胞極,因此NEK6-HSPA1A可以用于靶向具有擴增中心體的癌細胞,促進細胞增殖。Wan等[12]發(fā)現(xiàn)在體外建立非小細胞肺癌NCI-H1650的亞系,即用54℃熱處理使其具有較高的耐熱性,發(fā)現(xiàn)其比原來的細胞活力和增殖速率明顯加快,通過Western Blot發(fā)現(xiàn)其HSPA1A表達量上調且用抑制劑VER155008(HSPA1A的抑制劑)能夠抑制這種細胞的活力和增殖速率。這些說明HSPA1A與癌細胞增殖相關,因此推測HSPA1A可能在腫瘤細胞的生存和增殖中扮演著重要角色。

    細胞增殖周期,是細胞從上一個有絲分裂結束到下一個有絲分裂結束的過程。有絲分裂包括分裂間期和分裂期,而分裂間期包括G1期、S期、G2期。G1期主要為DNA復制提供相關物質,G1期決定了細胞是否會發(fā)生分裂,若不發(fā)生分裂則走向G0期,因此G1期也被稱為細胞周期的限制點。S期主要復制染色體,G2期主要為有絲分裂期。調節(jié)細胞周期的蛋白質主要有兩類,它們相互配合,包括細胞周期蛋白,即cyclins;細胞周期蛋白依賴激酶,即CDKs,它們的相互作用能夠共同調節(jié)細胞周期。如cyclin D1能夠與CDK4/CDK6發(fā)生相互作用,從而使G1期的周期抑制蛋白——抑癌基因成視網(wǎng)膜瘤蛋白(Rb)發(fā)生磷酸化并從E2F轉錄因子上解離,E2F可以加速細胞的G1期,cyclin D1起到促進基因轉錄的功能;cyclin E1對應的周期蛋白激酶是CDK2,其可以與CDK2結合,起到作用與cyclin D1-CDK4/CDK6這條途徑相同。研究表明cyclin通常在腫瘤發(fā)生中失調,如cyclin D1是一種原癌基因,推測其過度表達是細胞過度增殖并產(chǎn)生腫瘤的原因之一,目前已經(jīng)在膀胱癌、淋巴癌、肺癌等多種癌癥細胞中發(fā)現(xiàn)cyclin D1的過表達。cyclin E1同樣也與腫瘤細胞的惡性增殖有關,如食管癌、胃癌、肝癌等多種癌癥中發(fā)現(xiàn)cyclin E1增多,也有研究表明cyclin E1的持續(xù)過表達會導致G1期縮短。目前HSPA1A與周期相關蛋白以及激酶的關系尚不清楚。

    作者主要探索HSPA1A對4種腫瘤細胞增殖的影響,并探究HSPA1A發(fā)揮作用的亞細胞定位以及對周期的影響。在此基礎上,HSPA1A有望成為一個新的腫瘤治療靶點。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    Forma371 CO2細胞培養(yǎng)箱、1300系列A2型生物安全柜、Attune NxT流式細胞儀、1510 Multican GO全波長酶標儀:購自Thermo(美國)有限公司;T-SAM倒置熒光顯微鏡:購自Nikon(日本)有限公司。

    PRMI 1640完全培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、體積分數(shù)10%胎牛血清:購自Gibco(美國)有限公司;PI染色試劑盒:購自上海生工(上海)有限公司;轉染試劑Lipofectamine 3000:購自Thermo(美國)有限公司。

    HSPA1A、cyclin D1、CDK4、CDK6、cyclin E1、CDK2:購自Protein tech(中國)有限公司。

    人結腸癌細胞系HT29、人非小細胞肺癌細胞A549、人宮頸癌上皮細胞HeLa、人前列腺上皮細胞PC3:購自中國科學院上海分院。

    1.2 方法

    1.2.1 細胞培養(yǎng)與傳代 輕輕吸去舊培養(yǎng)液,使用磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer saline,PBS)洗1遍后,加入胰酶消化,然后加入完全培養(yǎng)基,吹打5次將細胞懸液移至新離心管中,200g離心5 min,棄去上清液。重新加入新鮮完全培養(yǎng)基,輕吹混勻,將細胞懸液根據(jù)所需密度分配在培養(yǎng)皿或多孔板中,補足新鮮完全培養(yǎng)基,將細胞放回細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后傳代。

    1.2.2 細胞轉染 細胞種板,約1 000個/孔。種板完成后12~24 h內(nèi)完成細胞轉染。準備無菌無酶EP管,配置轉染體系,以96孔板為例,每孔加入5μL轉染體系。轉染體系配置:無血清培養(yǎng)基中加入質粒,按96孔板每個孔0.1μg加入質粒輕輕混勻,按每個孔0.3μL加入轉染試劑,靜置10 min。將配置的轉染體系溶液加入孔板中,4 h后更換成完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,通過觀察熒光判斷轉染效率,進行后續(xù)實驗。

    1.2.3 MTT 配置MTT儲存液,質量濃度為5 mg/mL,溶液為PBS,避光溶解至無沉淀,用0.22μm無菌水系濾膜過濾除菌,避光保存。使用時,用無血清的培養(yǎng)基稀釋至終質量濃度0.5 mg/mL,吸去孔板中原有的培養(yǎng)基,每孔加入100μL稀釋的MTT工作液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,此時底部會有紫色結晶。小心吸出孔內(nèi)的MTT。每孔加入150μL二甲基亞砜,在酶聯(lián)免疫檢測儀上低速振蕩20 min,使結晶物充分溶解,在OD570nm處測量各孔的吸光度。

    1.2.4 PI單染色法測細胞周期 轉染過后培養(yǎng)48 h的細胞,用胰酶消化,200g離心5 min收集細胞。加入2 mL PBS重懸細胞,200g離心5 min進行清洗,加入70%(體積分數(shù))的乙醇(PBS),4℃固定過夜。400g離心10 min,收集細胞去廢液,PBS清洗。加入1 mL PI染液重懸細胞進行染色,冰上避光孵育45 min。流式細胞儀檢測,通道為FL2。

    1.2.5 Western Blot 配制SDS-PAGE膠,上樣,每孔25μg蛋白質,設置90 V電壓進行電泳,當條帶分開至需要的位置,開始轉膜,設置300 mA,冰上進行轉膜(NC膜,GE)120 min;轉膜結束,將膜放入含5 g/dL脫脂乳粉的TBST中,室溫搖床封閉1 h。TBST洗膜3次,5 min/次,加入一抗4℃孵育過夜。吸出一抗,TBST清洗3次,5 min/次。加入相應二抗10 mL室溫孵育1 h,TBST洗膜3次,5 min/次。配制發(fā)光液,凝膠成像儀顯影成像。

    1.2.6 免疫熒光 在12孔板中將處理結束的細胞爬片用預冷的PBS清洗,用4%(體積分數(shù))的多聚甲醛在37℃培養(yǎng)箱中避光固定45 min,TBST清洗玻片5次,1 min/次,用含0.5%(體積分數(shù))Triton X-100、5%(體積分數(shù))FBS(PBS配制)的封閉液進行封閉打孔,室溫避光封閉打孔45 min,棄去封閉液,將爬片從孔板中取出,放在載玻片上,滴加稀釋好的一抗,完全覆蓋爬片并放入濕盒,4℃過夜。棄去一抗,PBST清洗爬片5次,1 min/次。加熒光二抗至完全覆蓋爬片,濕盒中室溫避光孵育45 min,PBST清洗爬片5次,1 min/次,滴加DAPI避光孵育30 min,PBST清洗爬片5次,1 min/次。吸干爬片上的液體,用含抗淬滅劑的封片液封片,激光共聚焦觀察。

    2 結果與分析

    2.1 過表達HSPA1A對癌細胞增殖的影響

    采用作者所在實驗室構建成功的HSPA1A大腸桿菌重組載體(含有GFP標簽(非融合表達)的pEB),將質粒轉染HeLa、HT29、PC3細胞,48 h后收集pEB細胞蛋白質,通過Western Blot驗證能否在這3個細胞中表達成功,Western Blot顯示HSPA1A在轉染重組質粒的細胞中表達成功。

    將驗證過的質粒分別再次轉染HeLa、HT29、PC3,轉染24 h后拍攝細胞圖片,48 h后進行MTT實驗。24 h后通過細胞圖片(見圖1~圖3)可以明顯觀察到瞬時轉入HSPA1A質粒后癌細胞密度增加,細胞增殖加快。48 h后通過MTT實驗可知轉染后活細胞數(shù)目增多(見圖4),進一步證明了HSPA1A能夠加快腫瘤細胞的增殖。

    圖1 HeLa轉染pEB空載(a)與HSPA1A(b)后的細胞形態(tài)Fig.1 Cell morphology after pEB (left)and HSPA1A(right)transferred into HeLa

    圖3 PC3轉染pEB空載(a)與HSPA1A(b)后的細胞形態(tài)Fig.3 Cell morphology after pEB (left)and HSPA1A(right)transferred into PC3

    圖4 HeLa、HT29、PC3轉染pEB空載與HSPA1A后48 h的細胞存活率Fig.4 Cell viability of HeLa,HT29,PC3 transfected pEB at no load(left)and HSPA1A(right)for 48 h

    圖2 HT29轉染pEB空載(a)與HSPA1A(b)后的細胞形態(tài)Fig.2 Cell morphology after pEB (left)and HSPA1A(right)transferred into HT29

    2.2 免疫熒光

    為探究HSPA1A在腫瘤細胞中的亞細胞定位,進行免疫熒光實驗。轉染48 h后進行免疫熒光處理。pEB載體帶GFP基因,因此轉染成功的細胞帶彌散性綠色熒光。HSPA1A蛋白用紅色熒光標記,細胞核用DAPI進行染色。

    轉染HSPA1A后,紅色熒光標記的HSPA1A停留于細胞質中,并未與細胞核重疊,可得出結論HSPA1A主要在腫瘤細胞的細胞質中發(fā)揮作用(見圖5)。

    圖5 3種細胞轉染pEB空載與HSPA1A的免疫熒光Fig.5 Immunofluorescence of three cells transfected pEB and HSPA1A

    2.3 周期實驗

    由于細胞周期各階段的DNA含量不同,而PI可以與DNA結合,因此其熒光強度直接反映了細胞內(nèi)DNA含量。通過流式細胞儀檢測PI熒光強度可以估計細胞內(nèi)DNA含量繼而確定細胞周期。

    HT29細胞轉染pEB空載后,位于G1期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為65.38%;位于G2期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為0.54%;位于S期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為34.08%。轉染HSPA1A后位于G1期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為57.15%;位于G2期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為1.69%;位于S期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為41.16%(見圖6)。

    圖6 HT29轉染pEB空載(a)與HSPA1A(b)后的細胞周期Fig.6 Cell cycle after HT29 transfection of pEB empty(left)and HSPA1A(right)

    HeLa細胞轉染pEB空載后,位于G1期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為53.71%;位于G2期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為1.58%;位于S期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為44.72%。轉染HSPA1A后位于G1期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為48.26%;位于G2期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為1.40%;位于S期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為50.34%(見圖7)。

    圖7 HeLa轉染pEB空載(a)與HSPA1A(b)后的細胞周期Fig.7 Cell cycle after HeLa transfection of pEB empty(left)and HSPA1A(right)

    PC3細胞轉染pEB空載后,位于G1期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為56.42%;位于G2期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為2.38%;位于S期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為41.20%。轉染HSPA1A后位于G1期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為53.46%;位于G2期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為2.71%;位于S期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為43.83%(見圖8)。

    圖8 PC3轉染pEB空載(a)與HSPA1A(b)后的細胞周期圖Fig.8 Cell cycle after PC3 transfection of pEB empty(left)and HSPA1A(right)

    G1期稱為DNA合成前期,由細胞周期實驗可知HSPA1A過表達后,處于G1期的細胞明顯變少。大多數(shù)細胞處于S期和G2/M期即DNA合成中后期。因此,過表達HSPA1A可以加速腫瘤細胞的G1期。

    2.4 HSA1A對周期蛋白的影響

    通過周期實驗確定,HSPA1A能夠加速細胞的G1期,推測可能是腫瘤細胞增殖加快的原因。為探究過表達HSPA1A以后對G1/S檢查點相關的細胞周期蛋白(cyclin D1,cyclin E1)、細胞周期蛋白依賴激酶(CDK4、CDK6、CDK2)的影響,對3種腫瘤細胞進行轉染,轉染48 h后,收集細胞進行Western Blot。

    結果表明過表達HSPA1A在細胞中可以促進cyclin D1、cyclin E1、CDK4、CDK6、CDK2的表達(見圖9)。cyclin D1、cyclin E1、CDK4、CDK6、CDK2作為確定的G1/S檢查點相關周期蛋白和周期蛋白依賴性激酶,其表達量增多,可以幫助細胞周期加快。其 中HeLa細 胞 中CDK4、CDK6、cyclin D1、cyclin E1明顯增加,HT29中CDK2、CDK4、CDK6、cyclin D1、cyclin E1均發(fā)生明顯上調,PC3中CDK4發(fā)生明顯上調。推測HSPA1A可能促進cyclin D1和CDK4/CDK6的結合和(或)cyclin E1和CDK2的結合,HSPA1A作為伴侶蛋白質可能通過穩(wěn)定cyclin D1-CDK4/CDK6和(或)cyclin E1-CDK2這兩條途徑中相關蛋白質,上調相應蛋白質含量,使細胞增殖加快。

    圖9 HSPA1A對周期蛋白相關蛋白質的影響Fig.9 Effect of HSPA1A on cyclins and CDKs

    2.5 討論

    當細胞受到應激時,細胞中的應激誘導型HSP70發(fā)揮保護細胞的作用[13]。HSP70家族由幾個高度同源的成員組成[14],包括HSPA1A、HSPA5、HSPA8、HSPA9[15]。HSPA1A定位與細胞質和細胞核中[16],HSPA5定位于細胞內(nèi)質網(wǎng)上,是一個鈣離子結合蛋白質,HSPA8蛋白質均勻分布于整個細胞,HSPA9作為線粒體伴侶蛋白質,主要定位于線粒體中[17]。有證據(jù)表明HSP70在癌癥中過表達,這種伴侶蛋白質的高表達與腫瘤的產(chǎn)生和預后不良反應有關[18]。例如,HSP70過表達是早期肝細胞和前列腺癌的標志,也是大腸癌和乳腺癌晚期癌細胞結轉移的標志之一[19]。

    目前HSPA1A對細胞的增殖作用及相關機制尚未有明確的研究。已有的研究表明,外源性的HSPA1A可以促進腫瘤的生長。HSPA1A通過TLR2和TLR4信號傳導促進H22肝癌細胞的增殖,推測HSPA1A充當TLR2和TLR4的內(nèi)源性配體,以促進腫瘤生長[20]。

    3 結 語

    本研究發(fā)現(xiàn)HSPA1A可以促進PC3、HT29、HeLa這3種腫瘤細胞增殖。通過免疫熒光發(fā)現(xiàn)HSPA1A主要在細胞質中發(fā)揮增殖作用,PI染色發(fā)現(xiàn)HSPA1A主要加速了腫瘤細胞的G1期。在過表達HSPA1A后,發(fā)現(xiàn)G1/S檢查點相關的周期蛋白和周期蛋白依賴激酶表達量均上調。腫瘤細胞中,基礎氧化應激與蛋白質合成均有上調,HSPA1A作為伴侶蛋白質,可以幫助蛋白質正確折疊,同時穩(wěn)定蛋白質構象。因此,腫瘤中高表達HSPA1A可能通過穩(wěn)定cyclin D1-CDK4/CDK6和(或)cyclin E1-CDK2這兩條途徑中的相關蛋白質幫助細胞加速通過G1/S檢查點。

    HSPA1A能夠有效促進癌細胞增殖,因此通過尋找靶向HSPA1A的藥物有望抑制腫瘤細胞的增殖,對于臨床腫瘤的治療有重要作用。但是HSPA1A在細胞質中起到伴侶作用,以及在其他腫瘤細胞中的作用尚待研究。

    猜你喜歡
    數(shù)目細胞周期比例
    有機物“同分異構體”數(shù)目的判斷方法
    中學化學(2024年4期)2024-04-29 22:54:35
    人體比例知多少
    紅霉素聯(lián)合順鉑對A549細胞的細胞周期和凋亡的影響
    《哲對寧諾爾》方劑數(shù)目統(tǒng)計研究
    NSCLC survivin表達特點及其與細胞周期的關系研究
    X線照射劑量率對A549肺癌細胞周期的影響
    癌癥進展(2016年10期)2016-03-20 13:15:43
    牧場里的馬
    按事故責任比例賠付
    紅土地(2016年7期)2016-02-27 15:05:54
    熊果酸對肺癌細胞株A549及SPCA1細胞周期的抑制作用
    限制支付比例只是治標
    精品人妻1区二区| 免费av中文字幕在线| 国产欧美亚洲国产| 欧美成人午夜精品| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 91国产中文字幕| 国产成人系列免费观看| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美 日韩 精品 国产| 黄片播放在线免费| 成熟少妇高潮喷水视频| 美女 人体艺术 gogo| 日韩精品免费视频一区二区三区| 窝窝影院91人妻| 亚洲五月天丁香| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产99久久九九免费精品| 成人手机av| 国产欧美日韩一区二区三| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 男人舔女人的私密视频| 正在播放国产对白刺激| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 精品国产美女av久久久久小说| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 99久久国产精品久久久| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产一区有黄有色的免费视频| 中文字幕精品免费在线观看视频| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲一区二区三区欧美精品| 深夜精品福利| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 女性被躁到高潮视频| 在线播放国产精品三级| 波多野结衣一区麻豆| 国产精品.久久久| 午夜福利视频在线观看免费| 高清欧美精品videossex| 夫妻午夜视频| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久久久久久午夜电影 | 水蜜桃什么品种好| 最新美女视频免费是黄的| 国产熟女午夜一区二区三区| 天天添夜夜摸| 午夜福利欧美成人| 日韩中文字幕欧美一区二区| netflix在线观看网站| 国产精品 欧美亚洲| 久久精品成人免费网站| 久久久国产成人免费| 最近最新免费中文字幕在线| 免费看十八禁软件| 1024视频免费在线观看| 一二三四在线观看免费中文在| 国产成人啪精品午夜网站| 黄片大片在线免费观看| 国产三级黄色录像| 精品国产一区二区三区四区第35| 久久久久久人人人人人| 咕卡用的链子| 亚洲情色 制服丝袜| 在线观看免费日韩欧美大片| 高清视频免费观看一区二区| 精品电影一区二区在线| 色播在线永久视频| 伦理电影免费视频| 欧美精品一区二区免费开放| 国产有黄有色有爽视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 女同久久另类99精品国产91| 91精品国产国语对白视频| 国产97色在线日韩免费| 免费看十八禁软件| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产av一区二区精品久久| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 欧美性长视频在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 色综合欧美亚洲国产小说| 夜夜爽天天搞| 欧美日本中文国产一区发布| 国产精品久久久av美女十八| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲在线自拍视频| 欧美一级毛片孕妇| av一本久久久久| 中亚洲国语对白在线视频| 99在线人妻在线中文字幕 | 视频区欧美日本亚洲| 国产日韩欧美亚洲二区| 在线观看免费视频日本深夜| 国产99久久九九免费精品| 久久久国产一区二区| 免费看十八禁软件| 国产有黄有色有爽视频| 深夜精品福利| 精品亚洲成a人片在线观看| 九色亚洲精品在线播放| 一区二区三区国产精品乱码| 777米奇影视久久| 后天国语完整版免费观看| 香蕉丝袜av| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲精品在线观看二区| 老司机靠b影院| 国产精品国产高清国产av | 欧美在线黄色| 美女视频免费永久观看网站| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 777米奇影视久久| 欧美日韩一级在线毛片| 免费人成视频x8x8入口观看| 黄色视频不卡| 热99久久久久精品小说推荐| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 日日爽夜夜爽网站| 多毛熟女@视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 性色av乱码一区二区三区2| 色94色欧美一区二区| 亚洲精品一二三| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产一区有黄有色的免费视频| avwww免费| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 91精品国产国语对白视频| 黑人猛操日本美女一级片| bbb黄色大片| 久久亚洲真实| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产1区2区3区精品| 丰满迷人的少妇在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 丝袜人妻中文字幕| 黄频高清免费视频| 午夜福利免费观看在线| 日本精品一区二区三区蜜桃| 日韩欧美一区视频在线观看| 涩涩av久久男人的天堂| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 丰满饥渴人妻一区二区三| av电影中文网址| 又黄又粗又硬又大视频| 久久青草综合色| 欧美中文综合在线视频| 久久这里只有精品19| 成人黄色视频免费在线看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 91国产中文字幕| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲黑人精品在线| 天天添夜夜摸| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲七黄色美女视频| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲中文av在线| 国产午夜精品久久久久久| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产精品久久久人人做人人爽| 一区二区日韩欧美中文字幕| 在线观看免费视频网站a站| 午夜影院日韩av| 亚洲成人免费av在线播放| 无遮挡黄片免费观看| ponron亚洲| 老熟妇仑乱视频hdxx| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲精品国产区一区二| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲片人在线观看| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 黄色成人免费大全| 成年版毛片免费区| a级毛片黄视频| 国产在视频线精品| 又黄又粗又硬又大视频| 成人永久免费在线观看视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 在线观看舔阴道视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 国产激情欧美一区二区| 色综合婷婷激情| 欧美人与性动交α欧美软件| 超碰成人久久| 欧美 亚洲 国产 日韩一| a级毛片黄视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 一本综合久久免费| 色综合婷婷激情| 一本综合久久免费| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 老司机亚洲免费影院| 老司机深夜福利视频在线观看| 老司机深夜福利视频在线观看| 咕卡用的链子| 国产在视频线精品| 一本大道久久a久久精品| 免费日韩欧美在线观看| av不卡在线播放| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 久久久久久久国产电影| 精品福利观看| 国产精品免费视频内射| 女同久久另类99精品国产91| 下体分泌物呈黄色| 九色亚洲精品在线播放| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 一二三四在线观看免费中文在| 不卡av一区二区三区| 黑人操中国人逼视频| 黄色毛片三级朝国网站| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产成+人综合+亚洲专区| 91在线观看av| 99国产精品99久久久久| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 看片在线看免费视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 精品高清国产在线一区| 欧美激情高清一区二区三区| 他把我摸到了高潮在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 俄罗斯特黄特色一大片| videosex国产| 日韩视频一区二区在线观看| 久久狼人影院| 一级a爱片免费观看的视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 久久亚洲精品不卡| 日韩欧美三级三区| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 99国产精品一区二区蜜桃av | 亚洲中文日韩欧美视频| 中文字幕精品免费在线观看视频| 97人妻天天添夜夜摸| 日韩中文字幕欧美一区二区| 日韩免费av在线播放| 国产野战对白在线观看| 午夜福利一区二区在线看| 亚洲成人国产一区在线观看| 一二三四社区在线视频社区8| 国产精品av久久久久免费| 精品福利永久在线观看| 久9热在线精品视频| 很黄的视频免费| 欧美一级毛片孕妇| 精品第一国产精品| 精品久久久精品久久久| 又黄又爽又免费观看的视频| 91在线观看av| 久久久久国产一级毛片高清牌| 久久狼人影院| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产精品久久久人人做人人爽| 极品少妇高潮喷水抽搐| 一级a爱片免费观看的视频| 国产免费av片在线观看野外av| 欧美激情极品国产一区二区三区| 黄频高清免费视频| 久久九九热精品免费| 三级毛片av免费| 男女高潮啪啪啪动态图| 欧美不卡视频在线免费观看 | 国产精品免费一区二区三区在线 | 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲精品自拍成人| bbb黄色大片| 人妻久久中文字幕网| 9色porny在线观看| 不卡av一区二区三区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 午夜免费成人在线视频| 一进一出好大好爽视频| 天天添夜夜摸| 久久亚洲真实| 在线观看免费午夜福利视频| 高清av免费在线| 丁香六月欧美| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 麻豆乱淫一区二区| 午夜两性在线视频| ponron亚洲| 一a级毛片在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| 国产又爽黄色视频| 男人舔女人的私密视频| 国产一区在线观看成人免费| 国产精品成人在线| 久9热在线精品视频| 婷婷丁香在线五月| 亚洲在线自拍视频| av不卡在线播放| 欧美亚洲日本最大视频资源| 欧美在线黄色| av有码第一页| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲少妇的诱惑av| 久久精品国产清高在天天线| 大陆偷拍与自拍| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 人人妻人人澡人人看| 最近最新中文字幕大全电影3 | cao死你这个sao货| 麻豆国产av国片精品| 中文字幕色久视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲一区中文字幕在线| av天堂在线播放| 宅男免费午夜| 欧美日韩乱码在线| 亚洲,欧美精品.| 成年动漫av网址| 亚洲熟妇熟女久久| 黄频高清免费视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 两人在一起打扑克的视频| 欧美久久黑人一区二区| 老司机深夜福利视频在线观看| 少妇粗大呻吟视频| 精品人妻在线不人妻| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲中文av在线| a在线观看视频网站| 中文字幕色久视频| 欧美最黄视频在线播放免费 | 久久性视频一级片| 久久草成人影院| 看黄色毛片网站| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 新久久久久国产一级毛片| 国产亚洲欧美在线一区二区| 久久香蕉激情| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产成人系列免费观看| 久久久国产精品麻豆| 99riav亚洲国产免费| 老司机午夜福利在线观看视频| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 久久久久久免费高清国产稀缺| 另类亚洲欧美激情| 母亲3免费完整高清在线观看| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲欧美一区二区三区久久| 韩国精品一区二区三区| 国产一区二区三区综合在线观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 大码成人一级视频| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲美女黄片视频| 免费观看人在逋| 国产成人欧美在线观看 | 他把我摸到了高潮在线观看| 男女下面插进去视频免费观看| 欧美一级毛片孕妇| 国产免费男女视频| 日本欧美视频一区| 久久性视频一级片| 亚洲精品久久午夜乱码| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 免费观看人在逋| 午夜老司机福利片| 久久青草综合色| 老熟妇仑乱视频hdxx| 90打野战视频偷拍视频| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 在线观看舔阴道视频| 十八禁高潮呻吟视频| 午夜福利免费观看在线| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 免费看a级黄色片| 精品久久久久久久毛片微露脸| 免费在线观看亚洲国产| 国产亚洲精品一区二区www | 欧美日韩成人在线一区二区| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 日韩有码中文字幕| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 午夜福利视频在线观看免费| 男女下面插进去视频免费观看| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲三区欧美一区| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲熟女精品中文字幕| 日日爽夜夜爽网站| 99久久人妻综合| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 777米奇影视久久| 757午夜福利合集在线观看| av欧美777| 在线观看免费日韩欧美大片| 看免费av毛片| 老熟妇仑乱视频hdxx| 成人免费观看视频高清| 热99re8久久精品国产| 精品久久久精品久久久| 亚洲国产精品sss在线观看 | 亚洲伊人色综图| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲精品久久午夜乱码| 999精品在线视频| 99国产精品免费福利视频| 黄色片一级片一级黄色片| 91在线观看av| 国产不卡一卡二| 久久精品成人免费网站| 亚洲在线自拍视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 99国产综合亚洲精品| 狂野欧美激情性xxxx| 少妇 在线观看| 久久久水蜜桃国产精品网| 性少妇av在线| 国产精品久久久久成人av| 免费看a级黄色片| 欧美日韩乱码在线| av一本久久久久| 不卡一级毛片| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 香蕉国产在线看| 中文字幕高清在线视频| 99久久综合精品五月天人人| 热99国产精品久久久久久7| 午夜福利乱码中文字幕| 在线观看午夜福利视频| 亚洲情色 制服丝袜| 纯流量卡能插随身wifi吗| 叶爱在线成人免费视频播放| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲第一青青草原| 一级作爱视频免费观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 两个人免费观看高清视频| 免费观看a级毛片全部| 国产免费男女视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 十八禁人妻一区二区| 99国产精品99久久久久| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 嫁个100分男人电影在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲第一av免费看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | av电影中文网址| 中文欧美无线码| 亚洲情色 制服丝袜| 涩涩av久久男人的天堂| 这个男人来自地球电影免费观看| 脱女人内裤的视频| 日韩成人在线观看一区二区三区| 超色免费av| 亚洲国产欧美网| 国产免费av片在线观看野外av| 麻豆国产av国片精品| 激情在线观看视频在线高清 | 国产精品欧美亚洲77777| 成人av一区二区三区在线看| 久久人妻熟女aⅴ| 制服人妻中文乱码| 嫩草影视91久久| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 午夜福利一区二区在线看| 麻豆国产av国片精品| 老司机深夜福利视频在线观看| 久久亚洲精品不卡| 国产色视频综合| 欧美乱色亚洲激情| 人妻一区二区av| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲三区欧美一区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 成人国产一区最新在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 99香蕉大伊视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产成人av教育| 国产高清视频在线播放一区| 欧美激情高清一区二区三区| 久久久久久久久免费视频了| 又紧又爽又黄一区二区| 美女午夜性视频免费| 久久国产精品大桥未久av| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 两个人看的免费小视频| 欧美成人午夜精品| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产伦人伦偷精品视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 欧美成人免费av一区二区三区 | 老鸭窝网址在线观看| 十八禁人妻一区二区| 亚洲人成电影免费在线| 久久久国产成人精品二区 | 日韩欧美一区视频在线观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 三级毛片av免费| 黄色怎么调成土黄色| 日本黄色视频三级网站网址 | 国产精品久久视频播放| 一级片'在线观看视频| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 丝袜美腿诱惑在线| 很黄的视频免费| 男男h啪啪无遮挡| 好男人电影高清在线观看| 久久人妻熟女aⅴ| xxx96com| av在线播放免费不卡| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 女同久久另类99精品国产91| 国产亚洲精品久久久久5区| 在线观看免费高清a一片| 精品国产美女av久久久久小说| 女人精品久久久久毛片| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲黑人精品在线| 韩国av一区二区三区四区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 人妻久久中文字幕网| 亚洲全国av大片| 一级,二级,三级黄色视频| 午夜影院日韩av| 午夜精品在线福利| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲av电影在线进入| 最近最新中文字幕大全电影3 | 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 亚洲人成77777在线视频| 精品久久久久久久久久免费视频 | 午夜91福利影院| 啦啦啦 在线观看视频| 搡老乐熟女国产| 国产一区在线观看成人免费| 国产成人欧美在线观看 | 18在线观看网站| 岛国在线观看网站| 极品教师在线免费播放| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产深夜福利视频在线观看| 波多野结衣一区麻豆| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 狠狠狠狠99中文字幕| 美国免费a级毛片| 一个人免费在线观看的高清视频| 黄色a级毛片大全视频| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产一区二区三区视频了| 国产成人影院久久av| 激情在线观看视频在线高清 | 啦啦啦在线免费观看视频4| 99re6热这里在线精品视频| 正在播放国产对白刺激| 在线观看免费视频网站a站| 中出人妻视频一区二区| 亚洲少妇的诱惑av| 午夜老司机福利片| 91字幕亚洲| 国产国语露脸激情在线看| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲五月婷婷丁香| 一边摸一边做爽爽视频免费| 中亚洲国语对白在线视频| 女性被躁到高潮视频| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 91在线观看av| 亚洲av电影在线进入| 在线观看免费高清a一片| 久久久水蜜桃国产精品网| 精品国产乱子伦一区二区三区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 久久热在线av| a级片在线免费高清观看视频| 日韩欧美在线二视频 | 色婷婷av一区二区三区视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 久久这里只有精品19| 韩国精品一区二区三区| 99热网站在线观看| 亚洲少妇的诱惑av| 欧美丝袜亚洲另类 | 一边摸一边抽搐一进一小说 | 免费观看人在逋| 欧美乱色亚洲激情| 性色av乱码一区二区三区2| 欧美人与性动交α欧美软件| 黄频高清免费视频| 丝袜美足系列| 亚洲,欧美精品.| 久久草成人影院| 美女视频免费永久观看网站| 高清黄色对白视频在线免费看| 一级毛片精品|