不同產(chǎn)地中華絨螯蟹鑒定方法及其研究進展

陳 卉， 成夢情， 董轉(zhuǎn)章， 趙 閱

（1.長江大學 生命科學學院/濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北 荊州434025；2.長江大學 麋鹿健康與生境研究中心，湖北 荊州434025；3.河南省水體污染防治與修復重點實驗室，河南 平頂山467036）

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis），俗稱河蟹、大閘蟹，是我國特有名貴水產(chǎn)品，也是重要的淡水養(yǎng)殖種類。中華絨螯蟹的天然群體，在我國曾廣泛分布于遼河、黃河、長江，以及甌江、閩江、珠江和南流江等水系。在中華絨螯蟹人工育苗技術取得突破后，各地迅速發(fā)展了中華絨螯蟹的人工養(yǎng)殖。目前，養(yǎng)殖較集中的區(qū)域包括長江流域、黃河流域和遼河流域，其中長江流域的養(yǎng)殖規(guī)模、總產(chǎn)量和成蟹平均規(guī)格均占首位[1-2]。不同產(chǎn)區(qū)養(yǎng)殖模式差異大，不同產(chǎn)地的地理環(huán)境不同，優(yōu)良環(huán)境所產(chǎn)的中華絨螯蟹不僅形成了許多知名品牌，也被賦予了更高的價值。知名品牌大閘蟹常供不應求，市場上出現(xiàn)了消費者難以識別的“洗澡蟹”“過水蟹”，假冒原產(chǎn)地危害日趨嚴重。同時，為了獲得更好的蟹種，在養(yǎng)殖和生產(chǎn)過程中也常需要判別蟹種的優(yōu)劣。因此，為了探索建立客觀、有效的產(chǎn)地判別方法，越來越多的學者開展了不同產(chǎn)地、不同性別、不同養(yǎng)殖方式、不同等級中華絨螯蟹的鑒定與研究，研究方法也有了較大的補充和完善。目前，常見的判別方法包括形態(tài)指標鑒定[3-13]，生化指標鑒定[14-24]，元素指紋特征鑒定[25-31]，穩(wěn)定同位素技術鑒定[30，32]，電子鼻[33-37]、電子舌鑒定[24，38-39]及分子生物學鑒定[40-46]等方法。本文中綜述了中華絨螯蟹產(chǎn)地判別的常用方法，并介紹了應用上述方法開展中華絨螯蟹鑒定的優(yōu)缺點和發(fā)展趨勢。

1 中華絨螯蟹產(chǎn)地判別方法

為了客觀、有效地開展不同產(chǎn)地、不同養(yǎng)殖方式和不同等級中華絨螯蟹的鑒定和研究，研究者們常采用的研究方法包括形態(tài)指標鑒定，感官評價，生化指標鑒定，元素指紋特征鑒定，穩(wěn)定同位素技術鑒定，電子鼻、電子舌鑒定及分子生物學鑒定等（見表1）。其中，形態(tài)鑒定方法操作較為簡便、直觀、成本低，已開展的相關研究較多。然而，由于背甲等形態(tài)特征易受到個體發(fā)育、環(huán)境等影響，其形態(tài)指標體系量化不足、主觀性較明顯等原因使其判別效果不佳，而且該方法無法區(qū)分同一水系內(nèi)不同產(chǎn)區(qū)的蟹群體。元素指紋特征鑒定方法雖然具有樣品量適中、易于規(guī)范、判別準確性高等優(yōu)點，但元素分析的數(shù)據(jù)量較大且計算煩瑣，樣品處理也較為復雜。相對于元素指紋特征鑒定，穩(wěn)定同位素技術對產(chǎn)區(qū)判別的穩(wěn)定性好、可重復性高，但其缺點是必須建立相應產(chǎn)區(qū)的穩(wěn)定同位素數(shù)據(jù)庫及判別模型。

表1 中華絨螯蟹常見鑒定方法比較Table 1 Comparison of common identification methods of Eriocheir sinensis

2 中華絨螯蟹產(chǎn)地判別方法的應用

2.1 形態(tài)指標鑒定

不同產(chǎn)區(qū)中華絨螯蟹的生存環(huán)境、養(yǎng)殖模式和遺傳特性的不同，是應用形態(tài)指標鑒別中華絨螯蟹產(chǎn)地的理論依據(jù)[3，47-48]。許加武等[3]選用24個形態(tài)學度量性狀，首次將逐步判別法成功用于不同水系中華絨螯蟹的形態(tài)判別。之后，許多研究者們通過測定中華絨螯蟹的外部形態(tài)差異，采用聚類分析、主成分分析、判別分析等多元分析方法，進一步將不同產(chǎn)區(qū)中華絨螯蟹進行歸類[8，10，13]。針對不同地方種群，王武等[8]選取了17個外部形態(tài)特征（體長、齒間距、步足長、節(jié)長等），開展合浦、綏芬河、長江和遼河4個水系內(nèi)蟹種群的聚類和判別分析，可將不同地方種群分開，整體判別率達74%。何杰等[10]開展的長江水系野生和養(yǎng)殖中華絨螯蟹扣蟹形態(tài)學比較研究也表明，通過形態(tài)指標建立的判別方程可有效區(qū)分野生和養(yǎng)殖扣蟹，準確率高達95%以上。此外，盧義等[12]采用多個形態(tài)特征比較長江、黃河和遼河水系的野生扣蟹，也發(fā)現(xiàn)雌雄個體間存在多處顯著差異，綜合判別率達87.5%，且長江水系和黃河水系的野生扣蟹親緣關系較近。

然而，楊建等[49]和楊文斌等[50]在研究不同產(chǎn)地中華絨螯蟹的形態(tài)學特征時，并未發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的中華絨螯蟹個體間有顯著的形態(tài)差異。因此，近年來，研究者們進一步在背甲形態(tài)學特征基礎上進一步建立了地標點法，能將長江水系的太湖、洪澤湖、高寶湖、長蕩湖、陽澄湖，以及巴城、興化“泓膏”養(yǎng)殖水域和長江口崇明自然水域等知名產(chǎn)區(qū)產(chǎn)的中華絨螯蟹進行有效區(qū)分，判別準確率達100%[13]?？梢?，上述形態(tài)指標鑒定方法能區(qū)分不同水系、野生和養(yǎng)殖中華絨螯蟹個體，但對同一水系不同產(chǎn)區(qū)個體的判別精度尚不理想。形態(tài)指標鑒定方法雖然操作較為簡便、直觀、成本低，但因背甲等形態(tài)特征易受到個體發(fā)育、環(huán)境等影響，形態(tài)指標體系量化不足、主觀性較明顯等原因使得該方法的判別效果不佳。

2.2 生化指標鑒定

中華絨螯蟹的營養(yǎng)豐富，其可食部分的比例和營養(yǎng)含量在很大程度上決定了它的價值，因此研究者們常通過定量分析中華絨螯蟹的可食部分來開展不同蟹群體判別[17-18，51-53]。朱清順和柏如發(fā)[17]通過研究養(yǎng)殖和野生中華絨螯蟹的生物學指數(shù)、可食部分比例、營養(yǎng)成分組成等發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖雌蟹的性腺指數(shù)、性肝指數(shù)高于野生蟹，養(yǎng)殖雄蟹的粗蛋白質(zhì)含量顯著高于野生雄蟹；養(yǎng)殖蟹的粗脂肪、氨基酸和無氮浸出物高于野生蟹，但養(yǎng)殖蟹的多不飽和脂肪酸含量低于野生蟹。在研究養(yǎng)殖和野生扣蟹時，何杰等[10]的研究結(jié)果表明長江水系野生扣蟹的肝胰腺指數(shù)、總脂含量和常規(guī)營養(yǎng)成分均顯著高于養(yǎng)殖群體，肝胰腺中多種脂肪酸也存在顯著差異。上述研究中野生和養(yǎng)殖蟹群體的生化組成均存在較大差異，結(jié)合形態(tài)學[10]、元素分析[17]等方法，可以建立有效的中華絨螯蟹產(chǎn)地判別方程。

在研究長江、黃河和遼河水系野生扣蟹生化組成時，發(fā)現(xiàn)長江雌蟹的肝胰腺指數(shù)最高，其肝胰腺的水分、粗蛋白質(zhì)和總糖含量最低，遼河雌蟹的肝胰腺指數(shù)最低，但其肝胰腺的水分和蛋白質(zhì)含量較高[12]。遼河蟹肌肉的水分含量最高，長江蟹的甘油三酯含量均顯著高于黃河和遼河水系的，此外，黃河蟹游離脂肪酸和膽固醇含量相對較低，但磷脂含量最高[12]。黃河蟹肝胰腺和軀體肌肉中18∶1n9和18∶2n6含量最低，但其20∶5n3和22∶6n3含量最高，3個水系蟹的肝胰腺中脂肪酸差異大于肌肉間的差異。由此可見，可以將野生扣蟹的生化組成差異作為不同水系野生扣蟹鑒別的一個輔助指標[12]。趙恒亮等[22]也比較了相同養(yǎng)殖條件下長江、黃河和遼河水系中華絨螯蟹雌蟹的性腺和營養(yǎng)組成特征，結(jié)果顯示：長江水系雌蟹肌肉和肝胰腺的灰分含量最高；長江水系雌蟹卵巢的C22∶6n3含量顯著高于黃河水系，其卵巢的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸和絲氨酸含量均顯著高于遼河水系；黃河水系雌蟹肌肉各種氨基酸含量均最高；長江水系雌蟹卵巢和黃河水系雌蟹肌肉的必需氨基酸最高，且雌蟹卵巢中的必需氨基酸均高于肌肉組織的。

朱獻輝等[21]比較研究了江蘇陽澄湖、荷蘭某地、上海南匯地區(qū)、上海寶山地區(qū)、浙江嘉興地區(qū)和蘇州太湖中華絨螯蟹可食部分的主要呈味物質(zhì)，結(jié)果顯示江蘇陽澄湖中華絨鰲蟹可食部分的谷氨酸、甘氨酸和肌苷酸含量高于其他地區(qū)。谷氨酸和肌苷酸的呈味效果具有相乘作用，使得江蘇陽澄湖的中華絨鰲蟹更加美味[21]。采用養(yǎng)殖實驗和生化分析方法，何杰等[20]比較了長江水系野生和養(yǎng)殖蟹種經(jīng)池塘養(yǎng)成成蟹的可食率、肥滿度、常規(guī)生化成分、脂肪酸和氨基酸組成，結(jié)果顯示成蟹的性腺指數(shù)、肝胰腺指數(shù)和脂肪酸組成在野生和養(yǎng)殖蟹間存在顯著差異。對于不同養(yǎng)殖模式的中華絨螯蟹而言，其脂肪酸種類基本相同，但含量有差異，其中以湖泊放流的中華絨螯蟹品質(zhì)最優(yōu)[18]。

張家奇等[24]對稻田養(yǎng)殖和池塘養(yǎng)殖的中華絨螯蟹的性腺、肝胰腺指標進行分析討論，結(jié)果表明：在總游離氨基酸方面，肝胰腺含量（X）中X稻田Y池塘，性腺含量（Z）中Z稻田（雌性）>Z池塘（雌性）、Z稻田（雄性）

2.3 元素指紋特征鑒定

生物體內(nèi)元素的含量和分布與其生境特征相關，許多學者依此建立了元素指紋分析方法，利用元素種類、含量、組成等信息開展中華絨螯蟹原產(chǎn)地判定[17，24，28-31，54]。柏如法等[26]的實驗分析結(jié)果表明，江蘇主要產(chǎn)區(qū)八大養(yǎng)殖品牌蟹可食部分礦物質(zhì)元素主要由Na、P、K、Ca、Mg等9種元素組成。其中，固城湖雌蟹的微量元素含量最高，滆湖雌蟹的微量元素含量最低，而高寶湖雄蟹的微量元素含量最高，太湖雄蟹的微量元素含量最低[26]。針對養(yǎng)殖和野生中華絨螯蟹個體，通過比較可食組織肌肉、肝臟和性腺微量元素可區(qū)分野生和養(yǎng)殖雌蟹群體，但無法區(qū)分雄蟹群體，而鈣含量可用于區(qū)分野生和養(yǎng)殖的雌、雄蟹群體[17]。此外，我國學者還探索建立了非致死的元素指紋鑒定方法，將中華絨螯蟹的第三步足作為標準化試料，開展了遼寧盤錦地區(qū)、江蘇洪澤湖、江蘇興化地區(qū)、湖北梁子湖[24]、江蘇太湖、石臼湖和固城湖[50]，以及江蘇陽澄湖、涌湖、長蕩湖和江西軍山湖[49]等產(chǎn)地的中華絨螯蟹判別，元素指紋判別準確率高達100%。

在利用中華絨螯蟹的第三步足進行元素指紋特征鑒定時，元素指紋鑒定方法的操作簡單，試樣大小合適、樣品量適中，樣品包含軟、硬組織，能夠綜合體現(xiàn)各類組織中元素積累特征，因此該方法具有操作易于規(guī)范、客觀、快速、判別準確性高等優(yōu)點，但元素分析的數(shù)據(jù)量較大且計算煩瑣，樣品處理也較為復雜[30]。

2.4 穩(wěn)定同位素技術鑒定

穩(wěn)定同位素技術具有整合、指示、示蹤的功能，目前已成功應用于多種特色高值農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)地溯源、真?zhèn)舞b定，表現(xiàn)出快速、準確、判別性強等優(yōu)勢[2]。姜濤等[32]選取第三步足進行δ13C和δ15N分析，將江蘇、上海等地區(qū)的中華絨螯蟹進行有效區(qū)分，判別率可達90%~100%。也有學者將元素組成和穩(wěn)定同位素比值組合，開展中華絨螯蟹多產(chǎn)地判別[30]。Luo等[30]測定了取自8個不同地點（當湖、高郵湖、洪澤湖、太湖、陽澄湖；長江口自然生境，東灘；養(yǎng)殖生境，巴城、紅高）中華絨螯蟹的δ13C、δ15N和10種微量元素，當元素組成與穩(wěn)定同位素比值結(jié)合時，原始判別率達到99.4%（交叉驗證率為98.2%）。應用穩(wěn)定同位素進行中華絨螯蟹產(chǎn)區(qū)判別具有穩(wěn)定性好、可重復性高、系統(tǒng)誤差小、客觀性和判別高等優(yōu)點，但其缺點是必須建立相應產(chǎn)區(qū)的穩(wěn)定同位素數(shù)據(jù)庫及判別模型。

2.5 電子鼻、電子舌等鑒定

由于不同產(chǎn)地中華絨螯蟹攝食餌料及生境中水體和底泥中的異味物質(zhì)不同，使得不同產(chǎn)區(qū)的中華絨螯蟹風味品質(zhì)和滋味物質(zhì)有差異，因此，也可通過檢測可食部位香氣、滋味等來判別中華絨螯蟹的產(chǎn)地及等級[33，36-39]。對樣品香氣、滋味物質(zhì)的檢測主要有感官評價、高效液相色譜、電子鼻、電子舌等手段。顧賽麒[33]和張晶晶等[38]通過分析中華絨螯蟹可食部位的香氣輪廓和滋味輪廓，檢測了來自陽澄湖、松江地區(qū)和崇明地區(qū)的不同等級養(yǎng)殖蟹?；趩蝹€部位的香氣輪廓或滋味輪廓所建模型無法將不同產(chǎn)地蟹群體完全分開，然而基于多個部位的香氣輪廓或滋味輪廓建模，獲得的樣品整體差異信息更豐富，通過偏最小二乘回歸法可以建立中華絨螯蟹的等級評定模型[38]。Wang等[39]采用吸附萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法對不同產(chǎn)地中華絨螯蟹（野生、陽澄地區(qū)養(yǎng)殖、崇明地區(qū)養(yǎng)殖）的揮發(fā)性物質(zhì)進行提取，將電子鼻、電子舌技術聯(lián)合檢測，可將3個地區(qū)中華絨螯蟹的香氣和滋味特征進行區(qū)分。

何珊等[34]以江蘇陽澄湖和遼寧盤錦地區(qū)的中華絨螯蟹為材料，采用電子鼻研究蟹肉揮發(fā)性物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)遼寧盤錦蟹的醛類和醇類物質(zhì)較多，而江蘇陽澄湖蟹的酯類和酚類物質(zhì)較多。何珊等[35]也運用電子鼻分析不同產(chǎn)地（陽澄湖、遼河和寧海）蟹類，建立了風味指紋模型和特征風味雷達圖，其結(jié)果表明新鮮陽澄湖蟹的肝胰腺在W2W傳感器的響應值最高，且新鮮陽澄湖蟹肌肉在W1S和W2S傳感器的響應值始終較高。此外，利用電子舌和人工感官開展蟹肌肉的滋味品質(zhì)綜合分析，也能較好地區(qū)分稻田養(yǎng)殖和池塘養(yǎng)殖的中華絨螯蟹，且雌蟹的區(qū)分度高于雄蟹[24]。

在利用香氣、滋味等判別中華絨螯蟹產(chǎn)區(qū)的研究中，感官評價容易受到個體因素的影響，高效液相色譜法操作步驟較多、檢測周期較長，而電子鼻和電子舌作為新型檢測系統(tǒng)，具有客觀、準確、重復性好、安全無損、可對整體香氣和滋味輪廓進行響應等優(yōu)點[33]。

2.6 分子生物學方法鑒定

DNA微衛(wèi)星多態(tài)性來源于其核心序列重復次數(shù)的變化，能揭示動物的遺傳特性。目前，DNA微衛(wèi)星也已應用于中華絨螯蟹的種群遺傳和遺傳育種方面[40]。熊良偉等[41]以長江水系天然群體為對照，利用微衛(wèi)星分子標記分析江蘇興化、安徽宣城、遼寧盤錦地區(qū)中華絨螯蟹養(yǎng)殖群體遺傳分化。結(jié)果表明，長江水系天然群體遺傳多樣性水平高于養(yǎng)殖群體，4個地區(qū)群體處于低等遺傳分化水平，江蘇興化地區(qū)養(yǎng)殖群體與長江水系天然群體同屬一種群，安徽宣城養(yǎng)殖群體與遼寧盤錦養(yǎng)殖群體為另一種群。潘建林等[56]也采用微衛(wèi)星DNA分型技術對江蘇地區(qū)2個地理種群（本地種與荷蘭種）的中華絨螯蟹進行了2個微衛(wèi)星基因座的遺傳多態(tài)性分析，結(jié)果表明2個地理種群的微衛(wèi)星基因座（Esin67和Esin87）都有較好的多態(tài)性，荷蘭種蟹種群的雜合度和多態(tài)性信息含量高于本地種蟹種群。

針對長江、黃河和遼河3個水系的中華絨螯蟹，劉青[44]和劉皓等[43]利用微衛(wèi)星標記進行了遺傳特征分析。研究表明，3個水系群體具有較高的遺傳多樣性，而且野生蟹群體的遺傳分化與地理距離有一定的相關性，作為育種基礎群體進行遺傳改良的潛力較大。李晶晶等[46]利用10個微衛(wèi)星分子標記分析了中華絨螯蟹3個不同水系人工選育群體（“長江1號”“光合1號”和七里海河蟹）和1個海河流域自然群體的遺傳多樣性和遺傳分化水平。表明4個中華絨螯蟹群體間的遺傳分化水平較低，群體遺傳多樣性較高。此外，許多研究也表明微衛(wèi)星標記能較全面地反映各水系中華絨螯蟹的遺傳多樣性和種群結(jié)構信息[40，42，45，47]。微衛(wèi)星標記多態(tài)性高、操作簡便、結(jié)果清晰易讀、可重復性好，但缺點是必須在已知序列的基礎上進行引物設計和擴增檢驗。

3 展 望

近年來，學者們從外部形態(tài)、生化組成、種質(zhì)來源、遺傳多樣性等方面開展了不同產(chǎn)地、不同養(yǎng)殖方式和不同等級中華絨螯蟹的鑒定和研究。同時，針對傳統(tǒng)鑒定方法的不足和差異，許多學者將形態(tài)學、生化指標、元素分析等方法結(jié)合，進行了較大的補充和完善，建立了有效的野生和養(yǎng)殖蟹群體產(chǎn)地判別方程[10，17]。此外，新型檢測系統(tǒng)電子鼻和電子舌等方法準確和重復性較好，可對中華絨螯蟹的整體香氣和滋味輪廓進行響應[33，38-39]。針對遺傳多樣性較高的絨螯蟹群體或不同水系中華絨螯蟹，通過微衛(wèi)星標記能較全面地反映其遺傳多樣性和種群結(jié)構信息，但缺點是必須在已知序列的基礎上進行引物設計和擴增檢驗。

針對不同中華絨螯蟹群體，不同鑒定方法的判別率差異較大，各有其優(yōu)缺點和適應性。在開展同一水系不同產(chǎn)區(qū)的中華絨螯蟹個體研究時，形態(tài)指標、微衛(wèi)星標記等方法的判別效果較差，應考慮與其他鑒定指標如生化指標、元素指紋等結(jié)合[10，17]。穩(wěn)定同位素技術具有穩(wěn)定性好、可重復性高、判別率高和前處理簡單等優(yōu)勢[30，32，55]。如果能在揭示中華絨螯蟹穩(wěn)定同位素組成影響機制的基礎上，建立我國主要產(chǎn)區(qū)中華絨螯蟹的穩(wěn)定同位素溯源圖譜及判別模型，將能為同一水系不同產(chǎn)區(qū)或未知產(chǎn)區(qū)蟹群體的判別提供客觀、有效、快速的方法。