尿激酶靜脈溶栓干預(yù)急性腦梗死模型大鼠的實驗研究

李盛善，肖瑞霞

腦梗死即為臨床常說的缺血性腦卒中，主要是指椎動脈、頸動脈閉塞導(dǎo)致機(jī)體腦供血不足、腦組織壞死的癥狀，是一種臨床較為常見的腦血管疾病，主要臨床表現(xiàn)為眩暈、感覺障礙、突發(fā)對側(cè)肢體麻木、肢體偏癱等[1-2]。中老年人是腦梗死癥狀的主要發(fā)病群體，隨著我國人口老齡化現(xiàn)象的不斷加重，腦梗死發(fā)病率呈逐年上升趨勢[3]。腦梗死具有發(fā)病突然、病情嚴(yán)重程度較高的特點(diǎn)，急性腦梗死的發(fā)生發(fā)展嚴(yán)重威脅病人身體健康，因此，尋找一種安全有效的治療手段具有重要意義[4-5]。本研究通過建立急性腦梗死大鼠模型，并使用尿激酶靜脈溶栓進(jìn)行干預(yù)，觀察尿激酶靜脈溶栓對急性腦梗死大鼠的干預(yù)效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取40只SD健康雄性大鼠，由吉林大學(xué)動物實驗中心提供，鼠齡8～10(8.9±0.5)個月，體質(zhì)量217～242(230.2±10.3)g。在相對濕度30%～35%、溫度(23.8±1.5)℃的環(huán)境中喂養(yǎng)大鼠1周，每日光照12 h。本研究獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 小鼠抗大鼠白細(xì)胞介素-8(IL-8)、白細(xì)胞介素-17(IL-17)抗體(Invitrogen公司)；兔抗小鼠超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)抗體(Selleck公司)；大鼠抗小鼠超氧化物歧化酶(SOD)抗體(Hyclone公司)；兔抗大鼠MMP-3抗體(Sigma公司)；小鼠抗兔Bcl-2抗體(BD公司)；兔抗小鼠Bax抗體(Dako公司)；大鼠抗兔Caspase-3抗體(Gibco公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 建模及分組 隨機(jī)選取30只大鼠，建立急性腦梗死模型，對大鼠進(jìn)行麻醉處理后按照仰臥位將其固定在操作臺上，消毒頸部皮膚，正中部位剪開頸部皮膚，顯微鏡下將頸總動脈(CCA)、頸內(nèi)動脈(ICA)、頸外動脈(ECA)分離，近心端將近端ECA結(jié)扎，使用微動脈夾將ICA夾住，使用尼龍線對CCA進(jìn)行結(jié)扎固定，對大鼠腦組織中動脈進(jìn)行阻斷，之后將ICA松開，將多余尼龍線剪去，于ICA根部進(jìn)行固定，對大鼠創(chuàng)口進(jìn)行消毒后將創(chuàng)口縫合。建模過程中共死亡2只大鼠，將剩余28只大鼠隨機(jī)分為模型組(10只)及藥物對照組(9只)、尿激酶組(9只)，其余10只為正常組。正常組、模型組大鼠灌胃生理鹽水，藥物對照組大鼠靜脈注射阿托伐他汀注射液10 mL/(kg·d)，尿激酶組大鼠頸外靜脈注射5×104U/kg 尿激酶，每日2次。

1.2.2 梗死灶體積 對大鼠進(jìn)行頭部磁共振成像(MRI)檢測，使用線圈固定大鼠頭部，統(tǒng)計急性腦梗死大鼠梗死灶體積。

1.2.3 神經(jīng)功能評分 使用改良大鼠神經(jīng)功能缺損評分(mNSS)評價大鼠神經(jīng)功能狀況，評價項目包括運(yùn)功實驗、感覺實驗、反射喪失以及異常運(yùn)動試驗，最高分為18分，評分越高表示大鼠神經(jīng)功能受損情況越嚴(yán)重。

1.2.4 指標(biāo)檢測 對各組大鼠進(jìn)行全身麻醉處理，采用斷頭法處死，取大鼠腦組織，液氮冷凍后進(jìn)行切片處理。酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)檢測IL-8、IL-17、hs-CRP水平，檢測過程嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行；免疫透射比濁法檢測SOD、基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)水平；蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 4組大鼠梗死灶體積、神經(jīng)功能評分比較 藥物對照組、尿激酶組大鼠梗死灶體積均低于模型組，且尿激酶組大鼠梗死灶體積低于藥物對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；模型組、藥物對照組、尿激酶組大鼠神經(jīng)功能評分均高于正常組，藥物對照組、尿激酶組大鼠神經(jīng)功能評分均低于模型組，且尿激酶組大鼠神經(jīng)功能評分低于藥物對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 4組大鼠梗死灶體積、神經(jīng)功能評分比較(±s)

2.2 4組大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平比較 模型組、藥物對照組、尿激酶組大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平均高于正常組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；藥物對照組、尿激酶組大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平均低于模型組，且尿激酶組大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平均低于藥物對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

2.3 4組大鼠SOD、MMP-3水平比較 模型組、藥物對照組、尿激酶組大鼠SOD水平均低于正常組，MMP-3水平均高于正常組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；藥物對照組、尿激酶組大鼠SOD水平均高于模型組，MMP-3水平均低于模型組，尿激酶組大鼠SOD水平高于藥物對照組，MMP-3水平低于藥物對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 4組大鼠SOD、MMP-3水平比較(±s)

2.4 4組大鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)比較 模型組、藥物對照組、尿激酶組大鼠Bcl-2、Caspase-3表達(dá)均高于正常組，Bax表達(dá)低于正常組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；藥物對照組、尿激酶組大鼠Bcl-2、Caspase-3表達(dá)均低于模型組，Bax表達(dá)均高于模型組，且尿激酶組大鼠Bcl-2、Caspase-3表達(dá)低于藥物對照組，Bax表達(dá)高于藥物對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表4、圖1。

圖1 4組Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)條帶圖 (A：正常組；B：模型組；C：藥物對照組；D：尿激酶組)

3 討 論

目前臨床較為常用的治療腦梗死的方法包括介入治療、溶栓治療等[6-7]。急性腦梗死作為一種臨床較為常見的腦缺血性損傷性疾病，其發(fā)生發(fā)展與機(jī)體血脂水平異常具有密切聯(lián)系。阿托伐他汀作為一種3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，能夠抑制機(jī)體膽固醇合成，抑制炎癥反應(yīng)，減輕腦組織氧化應(yīng)激損傷，對急性腦梗死預(yù)后的改善具有重要意義。尿激酶是自健康人腎臟或尿液中分離培養(yǎng)并獲取的酶蛋白，能夠直接作用于內(nèi)源性纖維蛋白溶解系統(tǒng)，催化裂解纖溶酶原為纖溶酶，對新形成的血栓組織具有較好的干預(yù)效果。本研究成功建立急性腦梗死大鼠模型，并使用尿激酶靜脈溶栓進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，使用尿激酶靜脈溶栓進(jìn)行干預(yù)的急性腦梗死大鼠梗死灶體積明顯縮小，說明尿激酶靜脈溶栓能夠縮小梗死灶體積，從而起到一定的腦保護(hù)作用。

實驗研究表明，急性腦梗死的發(fā)生發(fā)展會嚴(yán)重影響機(jī)體神經(jīng)功能[8]。黎希年等[9]研究表明，使用降纖酶治療急性腦梗死，能夠通過改善病人腦血流狀況，起到提升機(jī)體神經(jīng)功能的作用。本研究結(jié)果顯示，相比正常大鼠，急性腦梗死大鼠神經(jīng)功能評分明顯升高，說明急性腦梗死伴隨著機(jī)體神經(jīng)功能損傷，使用尿激酶靜脈溶栓進(jìn)行干預(yù)的急性腦梗死大鼠神經(jīng)功能評分明顯下降，說明尿激酶靜脈溶栓干預(yù)能夠改善大鼠神經(jīng)功能，原因可能是尿激酶靜脈溶栓可縮小急性腦梗死大鼠梗死灶體積，改善腦血流狀況，從而起到了減輕神經(jīng)功能受損程度的作用。有研究表明，急性腦梗死的發(fā)生發(fā)展通常伴隨著機(jī)體腦組織炎癥反應(yīng)[10-11]。IL-8、IL-17、hs-CRP是廣譜的炎性因子，對IL-8、IL-17、hs-CRP水平進(jìn)行檢測，能夠較為直觀、準(zhǔn)確地對機(jī)體炎癥反應(yīng)進(jìn)行評價。IL-8能夠吸引、激活中性粒細(xì)胞，誘發(fā)機(jī)體局部炎癥反應(yīng)，對機(jī)體組織細(xì)胞造成損傷[12]。IL-17是一種致炎因子，由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生，能夠促進(jìn)IL-6、IL-8等炎性因子的生成，進(jìn)而誘發(fā)炎癥反應(yīng)[13]。hs-CRP是一種主要由肝臟組織合成的C反應(yīng)蛋白，是一種廣譜的機(jī)體炎癥反應(yīng)的標(biāo)志物[14]。本研究結(jié)果顯示，相比正常大鼠，急性腦梗死大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平明顯較高，說明急性腦梗死大鼠腦組織存在較為嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)；使用尿激酶靜脈溶栓進(jìn)行干預(yù)的急性腦梗死大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平明顯下降，說明尿激酶靜脈溶栓能夠抑制IL-8、IL-17、hs-CRP水平，減輕腦組織炎癥反應(yīng)，從而起到腦保護(hù)作用，有助于大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。

急性腦梗死的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體腦組織細(xì)胞損傷密切相關(guān)[15]。SOD是較為常用的氧化應(yīng)激指標(biāo)，其水平變化與機(jī)體組織細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)[16]。MMP-3作為一種蛋白水解酶，與機(jī)體細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)定性具有密切聯(lián)系[17]。本研究結(jié)果顯示，使用尿激酶靜脈溶栓對急性腦梗死大鼠進(jìn)行干預(yù)，急性腦梗死大鼠SOD水平明顯上升，MMP-3水平明顯下降，說明尿激酶靜脈溶栓干預(yù)能夠調(diào)控SOD、MMP-3水平，減輕大鼠腦組織細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，維持腦組織細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)定，減輕急性腦梗死大鼠腦損傷嚴(yán)重程度。

急性腦梗死的發(fā)生發(fā)展、機(jī)體神經(jīng)功能受損嚴(yán)重程度與腦組織細(xì)胞凋亡情況具有密切聯(lián)系。Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)的變化與細(xì)胞凋亡能力密切相關(guān)。Bcl-2、Bax是線粒體細(xì)胞凋亡通路中的重要基因，二者表達(dá)水平變化與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[18-19]。Caspase家族與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，Caspase-3是Caspase家族的重要一員[20]。本研究結(jié)果顯示，使用尿激酶靜脈溶栓對急性腦梗死大鼠進(jìn)行干預(yù)，Bcl-2、Caspase-3表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)，說明尿激酶靜脈溶栓干預(yù)能夠調(diào)控Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)，抑制急性腦梗死大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡，從而起到腦保護(hù)作用。

綜上所述，使用尿激酶靜脈溶栓對急性腦梗死大鼠進(jìn)行干預(yù)，能夠有效縮小腦梗死灶體積，減輕大鼠神經(jīng)功能受損情況以及腦組織炎性反應(yīng)，調(diào)控SOD、MMP-3水平，抑制海馬區(qū)細(xì)胞凋亡，具有一定神經(jīng)保護(hù)作用。