基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討強(qiáng)心膠囊治療慢性心力衰竭的作用機(jī)制

侯志濤 宋曉晨 宋麗穎

摘要 目的：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析預(yù)測強(qiáng)心膠囊治療慢性心力衰竭的作用機(jī)制。方法：應(yīng)用中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）篩選出強(qiáng)心膠囊所含有效成分和相關(guān)靶標(biāo)蛋白。根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)ADME參數(shù)，以口服生物利用度（OB）≥30%，藥物相似性（DL）≥0.18，生物半衰期（HL）≥4.00為條件篩選出活性成分。從數(shù)據(jù)庫Uniprot中獲得預(yù)測的活性成分作用靶點(diǎn)。通過CTD、TTD、DrugBanK數(shù)據(jù)庫挖掘疾病相關(guān)的作用靶點(diǎn)。通過基因注釋工具M(jìn)atescape分析強(qiáng)心膠囊干預(yù)慢性心力衰竭的分子機(jī)制。結(jié)果：獲得強(qiáng)心膠囊活性成分108個(gè)，作用靶點(diǎn)267個(gè)，疾病相關(guān)靶點(diǎn)32 730個(gè)，最終獲得強(qiáng)心膠囊干預(yù)心力衰竭關(guān)鍵靶點(diǎn)264個(gè)。PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)47個(gè)。富集分析強(qiáng)心膠囊干預(yù)慢性心力衰竭的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要參與MAPK、HIF-1、TNF、FoxO、PI3K-AKT、促性腺激素、癌癥、T細(xì)胞受體和鈣離子信號通路等。結(jié)論：強(qiáng)心膠囊不僅可直接對慢性心力衰竭起到治療作用，還可通過激素、細(xì)胞代謝、炎性機(jī)制及免疫因子等間接發(fā)揮療效。

關(guān)鍵詞 強(qiáng)心膠囊;慢性心力衰竭;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);作用機(jī)制

Abstract Objective：To analyze and predict the mechanism of Qiangxin Capsule in the treatment of chronic heart failure based on network pharmacology.Methods：The active ingredients and related target proteins in Qiangxin Capsules were screened by the systematic pharmacology database and analysis platform of traditional Chinese medicine （TCMSP）.According to the pharmacokinetic ADME parameters，the active ingredients were screened under the conditions of oral bioavailability （OB） ≥ 30%，drug similarity （DL） ≥ 0.18，and biological half-life （HL） ≥ 4.00.The predicted target of active ingredient were obtained from the database （Uniprot）.CTD，TTD，DrugBanK databases were used to explore disease-related targets.The molecular mechanism of Qiangxin Capsule′s intervention in chronic heart failure were analyzed through gene annotation tool Matescape.Results：A total of 108 active components，267 action targets and 32，730 disease-related targets of Qiangxin Capsules were obtained，and finally 264 key targets of Qiangxin Capsules for the intervention of heart failure were obtained.The PPI network was constructed and 47 key targets were selected.Enrichment analysis showed that the key target of Qiangxin Capsule intervention in chronic heart failure mainly involved in MAPK signaling，HIF-1 signaling，TNF signaling，F(xiàn)OXO signaling，PI3K-AKT signaling，gonadotropin signaling，cancer signaling，T-cell receptor signaling and calcium signaling，etc.Conclusion：Qiangxin Capsule can not only directly treat chronic heart failure，but also play an indirect role through hormone，cell metabolism，inflammatory mechanism and immune factors.

Keywords Qiangxin Capsule; Chronic heart failure; Network pharmacology; Mechanism

中圖分類號：R289.5;R541文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.07.010

心力衰竭指因?yàn)樾呐K結(jié)構(gòu)異?；蚬δ軗p傷引發(fā)的心室充盈或射血能力受損的一系列復(fù)雜綜合征，臨床上以呼吸困難、乏力、體液潴留等為主要表現(xiàn)[1]。心力衰竭呈現(xiàn)進(jìn)行性進(jìn)展，為各種心血管疾病的終末期階段，亦是造成心血管疾病患者死亡的重要因素[2]。慢性心力衰竭（Chronic Heart Failure，CHF）是在其他舊有的心血管病的基礎(chǔ)上出現(xiàn)心力衰竭癥狀及體征時(shí)的心力衰竭類型[1]，急性心力衰竭患者經(jīng)治療后癥狀平穩(wěn)大多也可轉(zhuǎn)為CHF[3]。西醫(yī)治療方法主要包括藥物治療（強(qiáng)心、利尿、擴(kuò)血管藥以及神經(jīng)內(nèi)分泌抑制劑）和器械治療[1]。根據(jù)相似的臨床表現(xiàn)與發(fā)病特點(diǎn)，可將CHF參照中醫(yī)里“水腫”“心水”“心悸”“喘證”等進(jìn)行診治，常見脈證表現(xiàn)有心慌氣短、水腫、小便不利、舌淡苔白、脈細(xì)等，分為氣陰兩虛、脾腎陽虛、心血瘀阻等證。

強(qiáng)心膠囊的組方成分為茯苓、白術(shù)、白芍、附子、紅參、黃芪、丹參、三七、延胡索和葶藶子。其中，茯苓、白術(shù)為臨床常用的健脾利水祛濕藥。白芍活血利水。附子溫化陽氣。紅參、黃芪補(bǔ)氣固表。丹參、三七、延胡索化瘀活血定痛。葶藶子具有下氣行水的作用。如此共奏溫補(bǔ)腎陽、強(qiáng)心利水之功。中藥復(fù)方由多種藥材以配伍的方式構(gòu)成，其藥效成分與作用靶點(diǎn)間具有極為復(fù)雜的多點(diǎn)對多點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)樣關(guān)系。強(qiáng)心膠囊可通過多靶點(diǎn)、多通路、多機(jī)制的協(xié)同或拮抗作用，改善CHF的癥狀。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是近年來的一門新興學(xué)科，具有多學(xué)科融合的特征，在對多個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索、整理后，通過建立復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)模型推測藥物的作用機(jī)制，這種復(fù)雜性恰好與中藥成分和靶點(diǎn)的復(fù)雜性相契合，是中醫(yī)藥現(xiàn)代探索的新方向[4]，正好符合中醫(yī)的“整體觀念”。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分、靶點(diǎn)以及疾病靶點(diǎn)的篩選

在中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp）及收錄了4 500余種中草藥的化學(xué)成分庫里查找強(qiáng)心膠囊所含有的藥物活性成分，并運(yùn)用TCMSP根據(jù)成分藥動(dòng)學(xué)ADME參數(shù)，按照口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18進(jìn)一步篩選。將篩選后所得的活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)運(yùn)用Uniprot數(shù)據(jù)庫的UniprotKB功能經(jīng)過人類基因名規(guī)范化處理，即獲得藥物的可能靶點(diǎn)蛋白。分別在CTD數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫和DrugBan數(shù)據(jù)庫中搜索關(guān)鍵詞“chronic heart failure”，手動(dòng)篩選后取得CHF的發(fā)病基因。

1.2 活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用Venny在線繪畫工具繪制強(qiáng)心膠囊的藥物靶點(diǎn)與CHF的疾病靶點(diǎn)的關(guān)系圖，其交集所得即或許為強(qiáng)心膠囊干預(yù)CHF的潛在作用靶點(diǎn)。再借助Cytoscape3.7.1展示分子間作用關(guān)系的可視化平臺畫出藥物干預(yù)CHF的活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為明確強(qiáng)心膠囊干預(yù)CHF潛在靶點(diǎn)之間的作用關(guān)系，將交集靶點(diǎn)蛋白輸入String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），獲得蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）信息圖。設(shè)置選取最高置信度0.90的PPI關(guān)系數(shù)據(jù)，構(gòu)建強(qiáng)心膠囊對治療CHF的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 KEGG通路分析和GO功能富集分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫（https：///david.ncifcrf.gov/home.jsp）對關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG信號通路和GO功能富集分析，研究強(qiáng)心膠囊干預(yù)CHF可能靶點(diǎn)的關(guān)鍵作用通路及生物學(xué)過程。

2 結(jié)果

2.1 強(qiáng)心膠囊活性成分、靶點(diǎn)和CHF相關(guān)靶點(diǎn)

應(yīng)用TCMSP查找強(qiáng)心膠囊所含的化合物，并以O(shè)B≥30%和DL≥0.18作為篩選條件，篩選出活性化合物共126種。其中白芍7種，白術(shù)3種，丹參48種，茯苓5種，附子4種，紅參3種，黃芪15種，三七6種，葶藶子9種，延胡索26種。所有活性化合物經(jīng)去重后共108種。各化合物詳細(xì)信息如表1。獲得藥物靶點(diǎn)267個(gè)，CHF靶點(diǎn)32 730個(gè)。

2.2 活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

CHF相關(guān)靶點(diǎn)共32 730個(gè)。通過Venny取交集得到強(qiáng)心膠囊中參與CHF的靶點(diǎn)267個(gè)（圖1）。將獲得的公共靶蛋白運(yùn)用Cytoscape3.7.1網(wǎng)絡(luò)繪圖軟件繪制并分析強(qiáng)心膠囊干預(yù)CHF成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。度與介數(shù)中心性量化各個(gè)節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要性的重要拓?fù)鋮?shù)，前者表示網(wǎng)絡(luò)圖中和節(jié)點(diǎn)相連的路線條數(shù)，后者是網(wǎng)絡(luò)中所有最短路徑中經(jīng)過該節(jié)點(diǎn)的路徑的數(shù)目與最短路徑總數(shù)的比。根據(jù)度和介數(shù)中心性預(yù)測強(qiáng)心膠囊干預(yù)CHF關(guān)鍵化合物，深入分析發(fā)現(xiàn)強(qiáng)心膠囊中活性成分按度值排序前8位的為槲皮素（表2），度=602;山柰酚，度=189;beta-谷甾醇，度=152;異鼠李素，度=72;常春藤皂苷元，度=68;豆甾醇，度=64;木犀草素，度=55;丹參酮ⅡA，度=42。

2.3 強(qiáng)心膠囊治療CHF的PPI網(wǎng)絡(luò)

利用String將靶點(diǎn)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并利用Cytoscape可視化（圖3），按照度值排列，節(jié)點(diǎn)由內(nèi)向外，度值由大變小，顏色越來越淺。度均值為10.597，介數(shù)中心性均值為0.009，共得到47個(gè)高于度均值的靶點(diǎn)，介數(shù)中心性也位于前列。關(guān)鍵靶點(diǎn)詳細(xì)拓?fù)鋮?shù)分析見表3。

2.4 GO功能富集分析結(jié)果和KEGG通路分析

對取交集后所得到結(jié)果借助DAVID線上應(yīng)用軟件依次采取GO功能富集的方法與KEGG通路分析的方法。經(jīng)基因本體論方法獲得43條相關(guān)結(jié)果（圖4），分別是生物過程28條、細(xì)胞組分4條、分子功能11條。強(qiáng)心膠囊干預(yù)CHF的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要參與MAPK信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路、FoxO信號通路、PI3K-AKT信號通路、促性腺激素信號通路、癌癥通路、T細(xì)胞受體信號通路和鈣離子通路等。見圖5。

3 討論

對于心力衰竭的中醫(yī)理論研究認(rèn)為，其病因多見于心病遷延日久或氣血陰陽虧損，從而引發(fā)臟腑功能失調(diào)，氣血水液運(yùn)行失常，形成瘀血、水飲等病理產(chǎn)物;病機(jī)可歸納為臟腑虛損為本，血瘀、水停等為標(biāo)[5]。如《素問·逆調(diào)論篇》言“若心氣虛衰，可見喘息持續(xù)不已”及“夫不得臥則喘者，是水氣之客也”，將心力衰竭的病機(jī)闡述為心陽虛衰，水飲上泛。《金匱要略·痰飲咳嗽病脈證并治第十二》言：“凡食少飲多，水停心下，甚者則悸，微者短氣?！睂⑿牧λソ叩牟C(jī)歸納為氣虛痰飲積聚心下。陳瑩等[6]認(rèn)為脾氣虛損，生化不足，則氣血虧虛，無力運(yùn)化，則痰飲瘀血內(nèi)生，為心力衰竭的病理機(jī)制。《傷寒治例》中也記載了類似的觀點(diǎn)：“氣虛停飲，陽氣內(nèi)弱，心下空虛，正氣內(nèi)動(dòng)而悸也?！鼻宕跚迦卧凇夺t(yī)林改錯(cuò)》中曾提出：“元?dú)饧忍?，必不能達(dá)于血管，血管無氣必停留而瘀?！睆闹嗅t(yī)解剖層面上揭示了CHF的病機(jī)為氣虛血瘀，元?dú)馓澨摬荒艹溆}，推動(dòng)作用不足，氣血運(yùn)行不暢，必將發(fā)生瘀血等病理產(chǎn)物的停滯，同時(shí)造成心失濡養(yǎng)。因此，對于心力衰竭的治療方法應(yīng)以溫陽益氣為首，輔以活血化瘀、化飲利水等，進(jìn)行標(biāo)本同治。為此，根據(jù)溫陽化飲、益氣活血的治療方法所創(chuàng)立的強(qiáng)心膠囊，其基本方主要由丹參、黃芪、紅參、茯苓等組成。且強(qiáng)心膠囊已經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)具有降低Caspase-12蛋白表達(dá)、減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生的作用[7]。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)合目前已報(bào)道的文獻(xiàn)，本研究發(fā)現(xiàn)強(qiáng)心膠囊發(fā)揮抗心力衰竭作用的主要信號通路包括：MAPK信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路、FoxO信號通路、PI3K-AKT信號通路、促性腺激素信號通路、癌癥通路、T細(xì)胞受體信號通路和鈣離子信號通路等。MAPK信號通路和一些常見的心血管疾病，如心肌梗死、CHF等的發(fā)病關(guān)系緊密[8]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CHF的疾病進(jìn)程中多存在線粒體結(jié)構(gòu)異常及功能受損，影響正常的能量合成途徑，MAPK信號通路則在心肌細(xì)胞線粒體發(fā)生結(jié)構(gòu)改變時(shí)為關(guān)鍵環(huán)節(jié)[9]。HIF-1在心血管的生理及病理方面發(fā)揮了重要作用。正?；驊?yīng)激狀態(tài)下，HIF-1對心肌細(xì)胞的大小、結(jié)構(gòu)和功能具有保護(hù)作用[10]。實(shí)驗(yàn)顯示，心肌細(xì)胞凋亡對急性心力衰竭有重要意義，而HIF-lα表達(dá)的增加有利于心肌細(xì)胞的成活[11]。同時(shí)，CHF患者急性失代償期時(shí)的HIF-lα水平與其臨床癥狀、體征正相關(guān)，說明在CHF急性失代償過程中，HIF-lα水平代償性升高。且HIF-lα對于CHF急性失代償?shù)念A(yù)測作用與BNP基本相似，提示HIF-lα可能對于CHF急性失代償期的轉(zhuǎn)歸具有潛在的預(yù)測作用[10]。TNF-α作為一種常見的炎癥介質(zhì)，對于免疫炎癥反應(yīng)和心力衰竭發(fā)病及進(jìn)程具有關(guān)鍵意義[12]。TNF-α可直接減弱心肌的收縮力，并可激發(fā)心肌細(xì)胞的凋亡，介導(dǎo)心肌重塑[13]。臨床試驗(yàn)證明，TNF-α水平與心力衰竭的程度具有正比例關(guān)系。FoxO對細(xì)胞的一系列生命活動(dòng)如代謝、應(yīng)激和凋亡均具有一定的意義[13]，其中FoxO3a的表達(dá)部位大多為心臟，對心肌細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)具有正向作用[14]。研究結(jié)果顯示，AKT活化可通過誘導(dǎo)蛋白酶體降解，導(dǎo)致其下游分子FoxO3a總蛋白水平下降[15];同時(shí)FoxO3a能夠干擾前凋亡蛋白BIM表達(dá)，降低其含量，阻斷細(xì)胞凋亡發(fā)生。PI3K主要由調(diào)節(jié)亞基P85和催化亞基P110兩部分構(gòu)成。當(dāng)接收刺激信號時(shí)，使P85募集到質(zhì)膜周圍，P110與P85結(jié)合，將PIP2催化成PIP3;PIP3激活A(yù)KT，從而將AKT由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜，激活A(yù)KT[16]。過度活化的AKT可減少心肌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)BAX基因表達(dá)，增加心肌細(xì)胞凋亡，引發(fā)CHF的發(fā)生和發(fā)展[17-18]。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對強(qiáng)心膠囊治療CHF多成分、多靶點(diǎn)、多通路的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)其主要活性成分不僅可以直接對CHF起到治療作用，還可以通過激素、細(xì)胞代謝、炎性機(jī)制及免疫因子等間接發(fā)揮療效?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的作用機(jī)制探索為治療CHF提供了重要線索，同時(shí)強(qiáng)心膠囊干預(yù)CHF的多成分-多靶點(diǎn)-多通路，體現(xiàn)了復(fù)方君臣佐使及七情配伍協(xié)同增效的中醫(yī)整體思想的作用特點(diǎn)。

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（2020-07-07收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）