澤瀉湯治療梅尼埃病作用機制的網絡藥理學探討

陳與豐 陳建新 王雅蕾

摘要 目的：通過網絡藥理學方法探討澤瀉湯治療梅尼埃?。∕eniere Disease，MD）的作用機制。方法：利用SymMap、TCMSP、TCMID、BATMAN-TCM等中醫(yī)藥數據庫及TargetNet藥物-靶點譜在線計算平臺，獲取澤瀉湯有效成分及作用靶點;通過OMIM、Gene Cards、TTD、CTD等疾病基因數據庫，獲取MD相關靶標基因;利用STRING蛋白質數據庫，構建蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡;利用Cytoscape信息分析軟件，獲取關鍵靶標基因、構建中藥-有效成分-靶標基因網絡圖;利用R軟件進行信號通路分析。結果：澤瀉湯中69種有效成分可作用于88個MD相關基因，以核受體（如糖皮質激素受體）為主要作用靶點，參與IL-17、腫瘤壞死因子（TNF）相關的核因子κB信號通路介導的炎癥反應。結論：由核受體糖皮質激素受體-核因子κB介導的炎癥反應通路，可能是澤瀉湯減少MD炎癥反應，緩解膜迷路水腫的重要作用途徑之一。

關鍵詞 梅尼埃病;糖皮質激素受體;澤瀉湯;網絡藥理學;炎癥反應

Abstract Objective：To explore the mechanism of Zexie Decoction in the treatment of Meniere disease（MD） based on network pharmacology.Methods：SymMap，TCMSP，TCMID，BATMAN-TCM and other Chinese medicine databases and TargetNet drug-target spectrum online computing platform were used to obtain the effective ingredients and targets of Zexie Decoction; through OMIM，Gene Cards，TTD，CTD and other disease gene databases，MD-related target genes were obtained; STRING protein database were used to construct a protein interaction network; Cytoscape information analysis software was used to obtain key target genes，a network diagram of traditional Chinese medicine-active ingredients-target genes was constructed; R software was used to analyze signal pathways.Results：A total of 69 active components were screened from Zexie Decoction.These components acted on 88 related targets of MD.It took nuclear receptors （such as glucocorticoid receptors） as the main targets，and participated in the inflammatory response mediated by IL-17 and TNF-related NFκB signaling pathways.Conclusion：The inflammatory response pathway mediated by the nuclear receptor glucocorticoid receptor-NFκB may be one of the important pathways for Zexie Decoction to reduce MD inflammatory response and relieve membrane labyrinth edema.

Keywords Meniere Disease; Glucocorticoid receptor; Zexie Decoction; Network pharmacology; Inflammation

中圖分類號：R289.5;R276文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.07.008

梅尼埃病（Meniere Disease，MD）是一種病因復雜、發(fā)病機制尚不明確的內耳疾病，以自發(fā)性的發(fā)作性眩暈、感音神經性耳聾（Sensorineural Hearing Loss，SNHL）、耳鳴和耳脹悶感為主要臨床表現，膜迷路積水為主要病理學特征[1]。流行病學研究顯示，MD在全球范圍內均有發(fā)生，10萬人中有3.5～513人患病，近10年來發(fā)病率呈上升趨勢[2-3]。MD高發(fā)年齡為40～60歲，且患病率隨年齡增長而增加，發(fā)病時常表現為單側耳癥狀，并可持續(xù)數十年，每年發(fā)作6～11次[3]。近50%的MD患者合并抑郁癥，78%～89%的MD患者正常工作、生活受到限制，嚴重影響生命質量[4-6]。盡管MD發(fā)病機制尚不明確，但研究普遍認為，膜迷路積水是其主要病理機制之一。氧化應激和炎癥反應是膜迷路積水發(fā)生的核心[7];自由基過量產生和氧化應激引起的微血管損傷參與膜迷路積水的發(fā)展[8]。

目前，美國耳鼻喉頭頸外科學會（American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery Foundation，AAO-HNSF）指出，MD治療的目標是預防或降低眩暈發(fā)作的嚴重程度和頻率，緩解或預防聽力損失、耳鳴和耳脹滿感，改善整體生命質量[10]。西醫(yī)多以利尿、改善微循環(huán)、免疫調節(jié)等原則，依據病程選擇藥物或手術改善臨床癥狀，以眩暈發(fā)作次數減少為療效指標，然而，對于長期發(fā)作造成的聽力損害難以恢復[10]。戴春富和李軒毅[11]研究顯示，鼓室內慶大霉素注射可有效控制90%的眩暈，通過鼓室內給藥后，僅5%～10%的MD患者眩暈控制不佳，需要手術治療。中醫(yī)在MD治療中也具有明顯優(yōu)勢。2018年中華中醫(yī)藥學會提出，MD是中醫(yī)治療的優(yōu)勢病種，以澤瀉湯為代表的中藥配伍，可以有效改善MD患者眩暈、耳鳴等癥狀[12]。臨床研究發(fā)現，加味澤瀉湯聯合敏使朗治療多種證型MD，可明顯緩解眩暈、耳鳴及耳悶癥狀，療效優(yōu)于單用敏使朗[13-14]。循證醫(yī)學研究顯示，澤瀉湯在治療MD方面有頻次眾多的大樣本臨床對照試驗支持，且其中的中高級質量證據較多，屬于治療MD的優(yōu)勢高頻方[15]。

然而，澤瀉湯治療MD的作用靶點以及分子機制尚不明確。為探討這一問題，我們采用網絡藥理學融合傳統藥理學和計算機技術，研究“藥物-靶點-疾病”復雜關系，在大數據背景下展開中藥復方多靶點、多通路作用機制的探討，為澤瀉湯治療MD有效成分篩選、作用靶點及分子途徑等，提供數據支持。

1 資料與方法

1.1 MD相關靶點的獲得

基于OMIM（https：//omim.org/search/advanced/geneMap）、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）、CTD（http：//ctdbase.org/）、Gene Cards（https：//www.genecards.org/）等疾病基因數據庫，以“Meniere Disease”（MeSH ID D008575）為檢索詞，搜索關于MD的相關靶點。整合各數據庫結合Uniprot（https：//www.uniprot.org/），校正得到MD相關靶蛋白點。

1.2 澤瀉湯有效成分和靶點的獲得

通過SymMap（https：//www.symmap.org/）、TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、TCMID（http：//www.megabionet.org/tcmid/）等中醫(yī)藥數據庫，查詢澤瀉、白術的所有化學成分。在中醫(yī)藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）數據庫中設定口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為篩選條件，在SymMap數據庫中設定DL≥30%為篩選條件獲得有效成分。利用BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php）、SymMap獲取澤瀉、白術有效成分對應的靶點基因，利用TargetNet（http：//targetnet.scbdd.com/）對靶點基因進行補充。BATMAN-TCM靶點篩選條件為Score off≥48，P-value為0.5，TargetNet靶點篩選條件為曲線下面積（AUC≥0.7），可能性（Probability>0.9）。通過Uniprot校正得到澤瀉、白術有效成分及相關靶點基因。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建與關鍵靶點基因篩選

通過Venny2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）將MD相關基因與澤瀉、白術靶點基因映射篩選出共同基因，作為澤瀉湯治療MD的潛在作用靶點。通過STRING 11.0（https：//string-db.org/cgi/input.pl）構建蛋白質-蛋白質相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）網絡?；騺碓礊槿祟悾℉omo sapiens），最低交互分數（Minimum Required Interaction Score）要求為高置信度（High Confidence）（0.700）。接著通過Cytoscape3.8.0中CytoHubba插件，分別使用MCC、DMNC、MNC、Degree、EPC、BottleNeck、EcCentricity、Closeness、Radiality、Betweenness、Stress、ClusteringCoefficient共12種算法得到關鍵靶點基因，算法的不同可能導致某些重要靶點基因的遺漏或過度評價某些作用較小的靶點，因此對每種算法得出的評分在前20的關鍵靶點基因進行整合，得到在12種算法結果中至少出現2次的35個關鍵靶標基因。

1.4 GO功能和KEGG通路分析

利用R軟件“BiocManager”及“org.Hs.eg.db”工具包，對潛在作用靶點進行ID轉換，之后利用“clusterProfiler”工具包對其進行基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路分析，得到細胞組分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）、生物學過程（Biological Process，BP）和KEGG通路分析結果。利用R軟件“clusterProfiler”工具包，對88個潛在作用靶點進行GO功能分析，包括它們的細胞組分（Cellular Component，CC），參與的分子功能（Molecular Function，MF）和生物學過程（Biological Process，BP）。進一步，利用R軟件“clusterProfiler”工具包，對88個潛在作用靶點進行KEGG信號通路分析，探討澤瀉湯調節(jié)潛在作用靶點的作用途徑。

2 結果

2.1 MD和澤瀉湯相關靶點

通過OMIM、Gene Cards、TTD、CTD等疾病基因數據庫共得到MD相關靶點2 891個。通過TCMSP、SymMap、TCMID、BATMAN-TCM等中醫(yī)藥數據庫檢索澤瀉湯中2味中藥的化合物，結合OB和DL等指標篩選，得到潛在活性成分：澤瀉27個，白術42個。將1.2預測的靶點去重后，共得到澤瀉湯的活性成分作用靶點共222個。將澤瀉湯活性成分作用靶點與MD疾病靶點相匹配，得到澤瀉湯治療MD的潛在作用靶點88個，將活性成分和潛在作用靶點導入Cytoscape 3.8.0軟件進行網絡構建，得到“藥物-活性成分-潛在作用靶點”網絡圖（圖1）。結果發(fā)現，白術中的白術內酯Ⅰ（Atractylenolide Ⅰ）、甘氨酸（Gly）、刺芒柄花素（Formononetin），澤瀉中的澤瀉二萜醇（Oriediterpenol）、谷甾醇（Sitosterol）與9個以上靶點相連接。

為預測澤瀉湯治療MD的作用靶點，首先，在“藥物-活性成分-潛在作用靶點”網絡圖中得出，4個靶點與藥物成分關系密切，即與成分連接>10次的靶點，這些靶點依次是：前列腺素內過氧化物合酶2（Prostaglandin G/H Synthase 2 Precursor，PTGS2）連接29次，前列腺素內過氧化物合酶1（Prostaglandin G/H Synthase 1 Precursor，PTGS1）連接20次，核孕酮受體（Progesterone Receptor，PGR）連接12次，核受體亞家族3 C組成員1（Nuclear Receptor Subfamily 3 Group C Member 1，NR3C1）連接11次。

為進一步驗證上述預測結果，使用Venny 2.1.0，將澤瀉、白術和MD的靶點相映射，并繪制韋恩圖。見圖2。與上述結果一致，篩選出包含PGR、NR3C1、PTGS1、PTGS2，以及BCL2、JUN、PON1、CYP17A1、CDC25B、ESR1、ACHE、ANXA1、NOS2、GRIN1、TRPA1、KCNH2、GRIA2在內的17個靶點。

2.2 GO功能分析

得到CC、MF、BP前20個結果，澤瀉湯作用于MD的基因主要在膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等細胞膜區(qū)域表達（圖3）;這些靶基因主要參與配體門控離子通道的分子功能（圖4），與類固醇代謝生物學過程密切相關（圖5）。

2.3 KEGG信號通路分析

發(fā)現IL-17信號通路、Th17細胞分化、TNF信號通路等炎癥反應相關通路為澤瀉湯治療梅尼埃病的主要作用通路。見圖6。

3 討論

3.1 澤瀉湯治療梅尼埃病的中醫(yī)理論依據

中醫(yī)認為MD屬于“耳眩暈”，是一種由耳病所致的以頭暈目眩、天旋地轉為主要特征的疾病[16]。早在《黃帝內經》時期就有關于眩暈與耳病相關的記載：“厥陰之勝，耳鳴頭眩，憒憒欲吐，胃鬲如寒?！睗蔀a湯出自《金匱要略》，由澤瀉、白術兩味藥物組成，具有健脾化飲、降逆止眩之效，系治療痰飲所致眩暈之經方[17]。方中澤瀉甘、淡，寒，有利水滲濕，行痰飲之功;白術甘、苦、溫，歸脾、胃經，可補氣健脾以制水，杜生痰之源[18]。二者合用使水濕從小便而出，水飲下滲，濁陰得降，清陽可升，利水滲濕而不傷陰，從而共制痰飲上犯清竅，使眩暈得止[19]。

3.2 澤瀉湯治療梅尼埃病的成分分析

本研究發(fā)現，白術中的白術內酯Ⅰ（Atractylenolide Ⅰ）、甘氨酸（Gly）、刺芒柄花素（Formononetin），澤瀉中的澤瀉二萜醇（Oriediterpenol）、谷甾醇（Sitosterol）這5個成分可能是澤瀉湯治療MD的主要活性成分。邱美榕等[20]實驗也表明，澤瀉湯中白術多糖+澤瀉多糖組分群可能是抗膜迷路積水的有效組分群;澤瀉湯瀉醇B、白術內酯的超臨界萃取物可通過直接抑制內耳血管紋、螺旋韌帶的水通道蛋白AQP2表達，通過AVP-V2R-cAMP途徑，減輕耳蝸積水，治療MD[21]。臨床上，除膜迷路積水病理現象外，越來越多研究發(fā)現，MD患者伴有內耳局部甚至全身的炎癥反應。Gazquez等[22]通過對690例MD患者的調查發(fā)現這些患者合并自身免疫性疾病的比例顯著高于普通人群，B淋巴細胞數量的增加與耳聾和眩暈的持續(xù)正相關;Kim等[23]收集MD患者內耳淋巴液，發(fā)現分子量在23～48 kDa和63～75 kDa間的抗原抗體復合物，尤其是γ干擾素比正常對照組高10倍?；仡櫻装Y反應的反應類型，以炎癥反應蛋白產物如γ干擾素為特征的炎癥反應屬于急性期炎癥反應的一種;慢性炎癥反應主要以單核細胞增高為主要特征。這些臨床發(fā)現表明，MD無論是急性發(fā)作期還是恢復期，都具有炎癥反應的典型特征。

3.3 澤瀉湯治療梅尼埃病的關鍵靶點分析

基于網絡藥理學分析，我們發(fā)現PTGS1和PTGS2二者在治療MD中居于重要地位。其中，PTGS1和PTGS2屬于前列腺素內過氧化物合酶（PTGS），是前列腺素（PG）生物合成中的關鍵酶，PG是一種炎癥介質，介導炎癥反應發(fā)生，抑制表達PTGS能減少炎癥反應發(fā)生[24]。PGR是核孕酮受體，可被類固醇激素影響從而減輕炎癥反應發(fā)生[25]。NR3C1編碼糖皮質激素受體（Glucocorticoid Receptor，GR），參與炎癥反應[26]。PGR、GR均屬于核受體家族。在MD治療中，澤瀉和白術具有協同作用，可能通過核受體發(fā)揮抗炎作用。基于此，我們預測GR是澤瀉湯的重要作用靶點之一。澤瀉活性成分如谷甾醇（Sitosterol）、澤瀉醇B醋酸酯（Alisol B monoacetate）、11-去氧澤瀉醇-a（11-deoxyalisol a）、澤瀉醇a（Alisol a）、澤瀉醇E-23-醋酸酯（Alisol e 23-acetate），白術活性成分如白術內酯Ⅰ（Atractylenolide Ⅰ）、雙白術內酯（Biatractylolide）、蒼術酮（Hinesol）等均可作用于GR。分子對接技術還發(fā)現，澤瀉醇M-23-乙酸酯和澤瀉醇A-23-醋酸酯可作為拮抗劑，作用于GR，發(fā)揮抗炎作用[27]

。動物實驗中，澤瀉總三萜可有效抑制IL-6分泌，減輕小鼠耳郭腫脹及大鼠棉球肉芽腫脹程度[28];陳琴華等[29]指出白術內酯Ⅰ、Ⅲ還能夠促進炎性巨噬細胞細胞因子表達，參與抗炎反應。細胞實驗中，白術內酯Ⅰ可以通過抑制核因子κB、ERK1/2和p38信號通路，抑制LPS處理的RAW264.7細胞炎癥反應[30]。核因子κB炎癥反應通路是糖皮質激素（Glucocorticoid，GC）與GR結合后抗炎的重要途徑之一;炎癥反應條件下，核因子κB成員p50/p65異二聚體是轉錄激活過程中最重要的形式，與相應DNA結合元件結合，轉錄激活TNF-α，IL-1，IL-2，IL-6，IL-8等下游因子，促進炎癥介質、黏附分子等分泌和表達[31-32]。此外，1996年，Rarey和Curtis[33]首次在人類內耳中發(fā)現了糖皮質激素受體。內耳毛細胞內大量分布著GR[34]。臨床觀察發(fā)現，糖皮質激素（Glucocorticoids，GC），如地塞米松（Dexamethasone，DEX），可以有效控制MD患者的眩暈，用藥6個月，可以緩解92%患者的臨床癥狀[35];鼓室內注射GC治療MD效果顯著，可有效改善眩暈及聽力[36]。GC通過與內耳GR結合，參與耳蝸內淋巴穩(wěn)態(tài)調節(jié)[37-39]。然而，也有研究發(fā)現，長期使用DEX，不但有效率下降，還可增加不良反應風險[40]。因此，以GR為靶點，參與抗炎反應，是緩解MD局部或全身炎癥反應的有效途徑之一;找到具有糖皮質激素樣抗炎作用，又不引起不良反應的藥物，是提高MD臨床療效的關鍵。

3.4 GO和KEGG結果分析

GO功能分析結果與2.1靶點預測結果相一致。一方面表明澤瀉湯可能直接作用于細胞膜上的靶蛋白，另一方面顯示其與炎癥反應相關的核受體、細胞因子等作用通路密切相關。進一步，基于KEGG信號通路分析，發(fā)現IL-17、Th17和TNF等炎癥反應信號參與澤瀉湯治療MD中，與上述功能分析一致。結合文獻研究發(fā)現，與炎癥反應相關的核因子κB通路為上述三條炎癥反應相關通路的下游通路，核因子κB通路可能是澤瀉湯抗炎的主要途徑之一。IL-17家族是由IL-17A-F組成的細胞因子的一個子集，在急性和慢性炎癥反應中都起著至關重要的作用。IL-17A是T輔助細胞17（Th17）亞群的標志物，保護宿主免受細胞外病原體的侵害，在自身免疫性疾病中參與炎癥反應[41];Th細胞的平衡分化對機體的免疫和宿主保護至關重要[42]。IL-17家族通過與相應受體結合，激活包括核因子κB，MAPK和C/EBP等在內的下游途徑，導抗菌肽、細胞因子和趨化因子的表達，參與炎癥反應[43]。臨床研究發(fā)現，富集在IL-17信號通路上的IL-1β、MMP-9、TNF和MAPK等基因，與內耳疾病密切相關。在于中耳炎中耳積液和細菌性腦膜炎患者的腦脊液，炎癥介質IL-1β大量釋放[44];在慢性中耳炎、內耳積水中，MMP-9的表達水平與病程正相關[45]。TNF是一種重要的細胞因子，可誘導多種細胞內信號途徑，包括細胞凋亡、細胞成活、炎癥反應和免疫等?；罨腡NF組裝成一個高三聚體，與受體（TNFR 1，TNFR 2）結合，誘導多種基因激活，該通路主要受核因子κB通路和MAPK級聯反應控制[46-47]。TNF-α會誘導豚鼠感覺神經性聽力損失和突觸退化[48]。在IL-1β誘導內耳損傷模型中，DEX可以通過抑制IL-1β介導的MMP-9途徑，保護內耳免受損傷[49]。研究表明，參與炎癥反應的IL-17通路、TNF通路，均與核因子κB信號通路存在交互作用。

因此，我們提出假說：澤瀉湯有效成分與靶蛋白GR結合，抑制下游核因子κB通路，參與抗炎反應，是澤瀉湯治療MD的重要分子通路之一。然而，澤瀉湯激活GR途徑抗炎的同時，是否激活下游與不良反應相關的作用途徑;GR-核因子κB通路如何參與膜迷路積水調節(jié)，目前還尚未見報道，有待進一步探討。

內耳由半規(guī)管、前庭、耳蝸3部分組成。毛細胞是內耳上的特殊感受器，是感受聲波刺激的感覺上皮細胞。內耳毛細胞上GR表達豐富。澤瀉湯活性成分Sitosterol、Alisol B monoacetate、11-deoxyalisol a、Alisol a、Alisol e 23-acetate、Atractylenolide ⅠBiatractylolide、Hinesol等可作用于GR。澤瀉湯有效成分與GR結合后，入核與核內靶基因上的特定DNA序列結合，抑制核因子κB炎癥反應通路，即核因子κB成員p50/p65異二聚體，與DNA結合元件結合，抑制TNF-α，IL-6等下游因子分泌。IL17、TNF信號通路與核因子κB信息通路交互作用。

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（2020-12-01收稿 責任編輯：楊覺雄）