第7天囊胚培養(yǎng)及其凍融移植的妊娠結(jié)局分析

陽(yáng)娟，于慧君，孫健，黃衛(wèi)東

(新疆佳音醫(yī)院，烏魯木齊 830001)

近年來(lái)，隨著臨床促排卵方案的優(yōu)化和胚胎培養(yǎng)技術(shù)的提高，體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的成功率已顯著升高。為了降低多胎率、提高著床率，囊胚培養(yǎng)技術(shù)在臨床上得到越來(lái)越多的重視。然而，胚胎從卵裂期發(fā)育至囊胚階段的時(shí)間不一致，有的在獲卵后第5天形成囊胚，有的要到第6天甚至第7天才形成囊胚[1]。通常，只有在第5天和第6天發(fā)育成囊胚才被認(rèn)為是適合用于移植、冷凍保存或活檢的胚胎，而第6天后以較慢的速度發(fā)育成的囊胚被常規(guī)丟棄。目前研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)第7天形成的囊胚移植后可以獲得一定的臨床妊娠和活產(chǎn)[2-3]，因此第7天囊胚的冷凍是否具有臨床價(jià)值仍值得探討。本中心2018年10～12月將胚胎培養(yǎng)觀察時(shí)間延長(zhǎng)至第7天，并冷凍了第7天的可用囊胚。2019年解凍并移植了8例第7天囊胚，現(xiàn)分析報(bào)道如下。

一、臨床資料

2018年10～12月我中心行囊胚培養(yǎng)周期137個(gè)，形成第7天可用囊胚周期36個(gè)，其中僅有第7天可用囊胚周期12個(gè)，占總囊胚培養(yǎng)周期的8.76%。第7天有可用囊胚的36個(gè)周期，可用囊胚形成率26.89%，第5、6、7天可用囊胚占比分別是21.36%、51.94%、26.70%。本中心囊胚質(zhì)量評(píng)估采用Gardner囊胚評(píng)分系統(tǒng)[4]，可用囊胚標(biāo)準(zhǔn)：囊胚形態(tài)≥4BB。

2019年解凍并移植了8例第7天囊胚。8例女方患者平均年齡(31.75±3.07)歲。其中，6例因女方輸卵管因素行IVF，2例因男方嚴(yán)重弱精子癥行卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)。8例中5例曾行鮮胚移植未妊娠或早期流產(chǎn)，3例行全胚冷凍。4例分別解凍移植了2枚第7天囊胚，另外4例分別解凍移植了1枚第7天囊胚。最終3例臨床妊娠并足月活產(chǎn)(表1)。

表1 患者一般資料、凍融囊胚移植及臨床結(jié)局

病例1女方29歲，繼發(fā)不孕，雙側(cè)輸卵管粘連、宮腔粘連。新鮮周期采用超長(zhǎng)方案促排卵，獲卵14枚，其中MⅡ卵11枚，行IVF授精，受精10枚，卵裂10枚，形成優(yōu)質(zhì)胚胎5枚。新鮮周期第3天移植2枚優(yōu)質(zhì)胚胎，未妊娠。剩余胚胎行囊胚培養(yǎng)，冷凍2枚第7天可用囊胚。凍融移植內(nèi)膜準(zhǔn)備采用促排卵方案，移植日內(nèi)膜厚度7.0 mm、形態(tài)C型，解凍2枚第7天囊胚(5BB、5AB)移植，術(shù)后10 d查血HCG陰性。

病例2女方32歲，繼發(fā)不孕，左側(cè)輸卵管缺如(異位妊娠術(shù)后)、右側(cè)輸卵管阻塞，助孕治療6次。新鮮周期采用標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)方案促排卵，獲卵9枚，其中MⅡ卵8枚，行IVF授精，受精7枚，卵裂7枚，形成優(yōu)質(zhì)胚胎3枚。新鮮周期第3天移植2枚優(yōu)質(zhì)胚胎，未妊娠。剩余胚胎行囊胚培養(yǎng)，冷凍1枚第6天可用囊胚和2枚第7天可用囊胚。凍融移植內(nèi)膜準(zhǔn)備采用激素替代(HRT)方案，移植日內(nèi)膜厚度10.0 mm、形態(tài)C型，解凍1枚第6天囊胚(4AB)和1枚第7天囊胚(6BA)，其中第6天4AB囊胚解凍后凋亡丟棄，僅移植1枚第7天囊胚，術(shù)后10 d查血HCG陽(yáng)性。術(shù)后第26天B超顯示宮內(nèi)活單胎?；颊咴?1周活產(chǎn)1女嬰。

病例3女方38歲，原發(fā)不孕，男方嚴(yán)重弱精子癥。新鮮周期采用標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)方案促排卵，獲卵8枚，其中MⅡ卵5枚，行ICSI授精，受精5枚，卵裂5枚，形成優(yōu)質(zhì)胚胎2枚。新鮮周期第3天移植2枚優(yōu)質(zhì)胚胎，術(shù)后42 d B超未見(jiàn)胎心遂行清宮術(shù)。剩余胚胎行囊胚培養(yǎng)，冷凍1枚第7天可用囊胚。凍融移植內(nèi)膜準(zhǔn)備采用自然周期方案，移植日內(nèi)膜厚度13.0 mm、形態(tài)C型，解凍1枚第7天囊胚(5BB)移植，術(shù)后10 d查血HCG陰性。

病例4女方30歲，原發(fā)不孕，雙側(cè)輸卵管阻塞，助孕治療2次。新鮮周期采用超長(zhǎng)方案促排卵，獲卵20枚，其中MⅡ卵20枚，行IVF授精，受精17枚，卵裂17枚，無(wú)第3天優(yōu)質(zhì)胚胎。冷凍2枚Ⅱ級(jí)胚胎，剩余胚胎行囊胚培養(yǎng)，形成1枚第5天、2枚第6天和2枚第7天可用囊胚。新鮮周期第6天移植2枚可用囊胚，生化妊娠。第1次凍融移植解凍1枚第5天囊胚(5BA)移植，生化妊娠。第2次凍融移植內(nèi)膜準(zhǔn)備采用HRT方案，移植日內(nèi)膜厚度11.3 mm、形態(tài)C型，解凍2枚第7天囊胚(5BB、5BA)移植，術(shù)后10 d查血HCG陰性。

病例5女方34歲，原發(fā)不孕，雙側(cè)輸卵管粘連。新鮮周期采用標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)方案促排卵，獲卵20枚，其中MⅡ卵19枚，行IVF授精，受精18枚，卵裂17枚，形成優(yōu)質(zhì)胚胎7枚。新鮮周期第3天移植2枚優(yōu)質(zhì)胚胎，未妊娠。剩余胚胎行囊胚培養(yǎng)，冷凍2枚第7天可用囊胚。凍融移植內(nèi)膜準(zhǔn)備采用促排卵方案，移植日內(nèi)膜厚度9.5 mm、形態(tài)C型，解凍2枚第7天囊胚(5BB、5BB)移植，術(shù)后10 d查血HCG陽(yáng)性，術(shù)后第26天 B超顯示宮內(nèi)活單胎。患者孕38周活產(chǎn)1男嬰。

病例6女方32歲，原發(fā)不孕，雙側(cè)輸卵管阻塞并積水，助孕治療1次。新鮮周期采用超長(zhǎng)方案促排卵，獲卵13枚，其中MⅡ卵13枚，行IVF授精，受精13枚，卵裂13枚，形成優(yōu)質(zhì)胚胎8枚。冷凍2枚優(yōu)質(zhì)胚胎，剩余胚胎行囊胚培養(yǎng)，形成1枚第6天、3枚第7天可用囊胚。第1次凍融移植解凍1枚第6天囊胚(6BB)移植，未妊娠。第2次凍融移植內(nèi)膜準(zhǔn)備采用HRT方案，移植日內(nèi)膜厚度9.6 mm、形態(tài)C型，解凍1枚第7天囊胚(5AA)移植，術(shù)后10 d查血HCG陰性。

病例7女方27歲，繼發(fā)不孕，男方嚴(yán)重弱精子癥，助孕治療4次。新鮮周期采用超長(zhǎng)方案促排卵，獲卵25枚，其中MⅡ卵20枚，行ICSI授精，受精16枚，卵裂14枚，無(wú)第3天優(yōu)質(zhì)胚胎。全部胚胎行囊胚培養(yǎng)，冷凍1枚第7天可用囊胚。凍融移植內(nèi)膜準(zhǔn)備采用HRT方案，移植日內(nèi)膜厚度9.7 mm、形態(tài)C型，解凍1枚第7天囊胚(5BA)移植，術(shù)后9 d查血HCG陽(yáng)性。術(shù)后第24天B超顯示宮內(nèi)活單胎?；颊咴?9周活產(chǎn)1男嬰。

病例8與病例6是同一例患者，第3次凍融移植內(nèi)膜準(zhǔn)備采用自然周期方案，移植日內(nèi)膜厚度10.2 mm、形態(tài)C型，解凍2枚第7天囊胚(6BB、4BA)移植，術(shù)后10 d查血HCG陰性。

二、討論

在2013年美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)委員會(huì)關(guān)于囊胚培養(yǎng)和移植的共識(shí)中，建議目前實(shí)驗(yàn)室通常在受精后第5天或第6天進(jìn)行囊胚冷凍保存[5]。另外，歐洲伊斯坦布爾共識(shí)也指出“囊胚發(fā)育延遲(第7或8天)被認(rèn)為植入預(yù)后不良”[6]，其原因在于普遍認(rèn)為受精后第7天囊胚為發(fā)育過(guò)緩胚胎[7]，不僅囊胚形成率低，而且胚胎種植率也較低，因此建議不在第7天進(jìn)行胚胎評(píng)估和冷凍保存。

對(duì)于囊胚發(fā)育延遲的機(jī)制，有研究者認(rèn)為可能受患者年齡、FSH劑量、促排卵方案、周期數(shù)等相關(guān)因素的影響，并且單個(gè)胚胎形成囊胚的時(shí)機(jī)很可能是由不同周期因素的組合產(chǎn)生的，包括每個(gè)患者體內(nèi)的聚集效應(yīng)[8]。這些因素影響配子質(zhì)量和非整倍性，并可能導(dǎo)致囊胚發(fā)育延遲。雖然有證據(jù)表明非整倍體是囊胚發(fā)育延遲的關(guān)鍵因素[9]，但并不是所有的研究都支持這一點(diǎn)[10-12]。Amir等[13]進(jìn)行植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)分析發(fā)現(xiàn)，與平衡的胚胎相比，攜帶不平衡易位的胚胎預(yù)期會(huì)導(dǎo)致植入失敗或流產(chǎn)，它們的分裂速度較慢，并且分裂到4細(xì)胞期和囊胚形成開(kāi)始時(shí)間有所延遲(P<0.05)。另外還有研究發(fā)現(xiàn)第7天的囊胚中有40.5%可能是整倍體[14]，表明發(fā)育緩慢并不是在所有情況下均是錯(cuò)誤的染色體互補(bǔ)的直接結(jié)果。

近年來(lái)的臨床研究發(fā)現(xiàn)，雖然第7天的囊胚比第5天和第6天的囊胚生長(zhǎng)慢，但如果可以達(dá)到形態(tài)的最高水平，其整倍體率與第6天的囊胚相似[15]，并且可能有健康的活產(chǎn)[3，15]。Niu等[16]在一項(xiàng)復(fù)蘇卵母細(xì)胞體外受精研究中發(fā)現(xiàn)35.1%的周期在第7天形成囊胚，而3.5%的周期僅在第7天才形成囊胚，第7天形成的囊胚占囊胚總數(shù)的15.6%，但第7天高評(píng)分的囊胚比例低于第5天或第6天，并且非整倍體率與發(fā)育天數(shù)沒(méi)有相關(guān)性；與第5或第6天的囊胚移植相比，第7天的囊胚移植后獲得相似的臨床妊娠、持續(xù)妊娠和胚胎著床率。Tiegs等[17]研究顯示非整倍體隨著囊胚形成時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但是如果控制了囊胚的形態(tài)質(zhì)量和子宮內(nèi)膜的異步性，那么與第5天和第6天的整倍體囊胚相比，第7天整倍體胚胎具有相似的著床率。

雖然第7天的囊胚活檢數(shù)占總囊胚的比例不到2%，但植入前遺傳學(xué)篩查(PGS)可以是確定哪些第7天囊胚具有高植入潛能的有用工具[18]。研究發(fā)現(xiàn)有18.5%的患者在第7天有囊胚，而3.3%的患者只有第7天囊胚，這表明具有先天生長(zhǎng)較慢的胚胎的患者可能會(huì)受益于額外1天的胚胎培養(yǎng)[2]。對(duì)于第6天胚胎可能尚未準(zhǔn)備好進(jìn)行活檢或在嘗試進(jìn)行活檢后皺縮的情況下，延長(zhǎng)培養(yǎng)至第7天也有一定價(jià)值。最近Whitney等[19]發(fā)現(xiàn)第7天形成的囊胚活檢后35.9%為整倍體，此外，該研究還觀察到了第7天囊胚移植后獲得臨床妊娠和活產(chǎn)，第7天活檢增加了有正常胚胎移植患者的比例。Du等[20]發(fā)現(xiàn)第7天囊胚凍融移植，臨床妊娠和活產(chǎn)率均顯著低于第5天囊胚，但對(duì)嬰兒的評(píng)估顯示，在第5、6和7天凍融囊胚移植組中出生的嬰兒，低出生體重、先天畸形和新生兒早期死亡的發(fā)生率并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

綜上所述，第7天囊胚相比第5、6天囊胚有較高的非整倍體率、較低的臨床妊娠率[2，18-19]。但對(duì)于沒(méi)有第5、6天囊胚的患者而言，延遲培養(yǎng)至第7天可增加這部分患者每周期的可用胚胎，在一定程度上減輕患者精神上和經(jīng)濟(jì)上的壓力，減少患者多次促排卵進(jìn)行取卵的痛苦，提高累計(jì)妊娠率。因此臨床上可以個(gè)體化考慮將培養(yǎng)延長(zhǎng)至第7天的策略。