非整倍體篩查周期中發(fā)生早期妊娠丟失的影響因素分析

范英英，李蕾，李凈羽，王雪，張翠蓮

(鄭州大學(xué)人民醫(yī)院 河南省人民醫(yī)院 河南省生殖醫(yī)院，鄭州 450003)

在輔助生殖技術(shù)中，有大型數(shù)據(jù)顯示妊娠丟失率可高達(dá)18.3%[1]，其中早期妊娠丟失占50%以上[2]，早期妊娠丟失會(huì)增加患者的身體、心理以及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。目前臨床對(duì)早期妊娠丟失也有較多的研究，有文獻(xiàn)報(bào)道早期妊娠丟失與子宮畸形、高齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、既往流產(chǎn)史、多囊卵巢綜合征(PCOS)、胚胎染色體異常等多因素有關(guān)[4-6]，其中以胚胎染色體異常為主要因素[4]。Murugappan等[7]發(fā)現(xiàn)胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)-非整倍篩查(PGT-A)周期中的流產(chǎn)率顯著低于常規(guī)IVF/ICSI周期。但在臨床工作中我們觀察到，經(jīng)過(guò)胚胎篩選正常后植入的PGT-A患者仍有早期妊娠丟失發(fā)生，其原因不明，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。本文主要對(duì)此進(jìn)行相關(guān)探討。

資料和方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2017年1月至2020年6月于河南省人民醫(yī)院生殖中心行PGT-A周期的患者。納入/排除標(biāo)準(zhǔn)：行PGT-A周期后獲得可利用囊胚且凍融移植后獲得妊娠的患者；排除診斷為先天性或后天子宮畸形，或有明確影響胚胎著床的其他因素如輸卵管積水、宮腔粘連史等患者。

本研究共納入214個(gè)周期。根據(jù)最終是否持續(xù)妊娠分為持續(xù)妊娠組(n=187)和早期妊娠丟失組(n=27)。

二、研究方法

1.促排卵方案：卵巢刺激方案主要包括早卵泡期長(zhǎng)效長(zhǎng)方案、黃體中期短效長(zhǎng)方案、拮抗劑方案、高孕激素狀態(tài)下促排卵治療(PPOS)方案及微刺激方案，按照我中心ICSI常規(guī)進(jìn)行。

2.胚胎檢測(cè)：采用滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢(TEB)，抽吸5～10個(gè)細(xì)胞送檢，篩選出染色體正?？梢浦驳哪遗?。

3.凍融胚胎移植(FET)周期內(nèi)膜準(zhǔn)備：(1)自然周期，在優(yōu)勢(shì)卵泡排卵后第5日移植囊胚。(2)激素替代周期：月經(jīng)第2～4日給予補(bǔ)佳樂(lè)(拜耳，法國(guó))每日4～6 mg，后根據(jù)子宮內(nèi)膜厚度調(diào)整其用量，最大劑量為每日8 mg。取卵周期HCG注射日內(nèi)膜厚度≥7 mm時(shí)，達(dá)芙通(蘇威，荷蘭)口服每日20 mg聯(lián)合雪諾同(默克雪蘭諾，德國(guó))陰道給藥每日90 mg轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，轉(zhuǎn)化內(nèi)膜后第6日進(jìn)行囊胚移植。(3)降調(diào)節(jié)后激素替代周期：于月經(jīng)周期第2～4日給予長(zhǎng)效促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a，達(dá)菲林，默克雪蘭諾，德國(guó))3.75 mg肌肉注射，注射后第14日，當(dāng)達(dá)到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)給予補(bǔ)佳樂(lè)，適時(shí)轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，轉(zhuǎn)化后第6日進(jìn)行囊胚移植。

4.黃體支持：胚胎移植后維持內(nèi)膜轉(zhuǎn)化時(shí)雌、孕激素用藥不變，直到移植后14 d查血β-HCG，若≥25 U/L，繼續(xù)用藥至超聲檢查到胎心后開(kāi)始逐漸減量至孕10周停藥。

5.妊娠判斷：以移植術(shù)后4周陰道B超示子宮內(nèi)外有妊娠囊者為臨床妊娠；發(fā)生在12周以內(nèi)的流產(chǎn)定義為早期流產(chǎn)；胚胎移植后14 d血β-HCG≥25 U/L，但B超未見(jiàn)妊娠孕囊者為生化妊娠。早期妊娠丟失包括早期流產(chǎn)和生化妊娠；早期妊娠丟失率=(早期流產(chǎn)周期數(shù)+生化妊娠周期數(shù))/妊娠周期數(shù)×100%。

6.囊胚評(píng)分：按照Gardner評(píng)分系統(tǒng)[8]進(jìn)行，根據(jù)囊腔擴(kuò)張程度進(jìn)行分級(jí)。囊腔不足胚胎體積的50%為1級(jí)；≥50%為2級(jí)；囊腔幾乎占滿整個(gè)胚胎為3級(jí)；囊腔擴(kuò)張、透明帶變薄為4級(jí)；囊胚開(kāi)始從透明帶破口孵出為5級(jí)；囊胚完全孵出，脫離透明帶為6級(jí)。對(duì)處于3～6級(jí)的囊胚，進(jìn)一步對(duì)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)和滋養(yǎng)外胚層(TE)進(jìn)行評(píng)分。ICM評(píng)分：細(xì)胞數(shù)量多且分布緊密成團(tuán)，突起明顯為A級(jí)；細(xì)胞數(shù)量較少且分布松散為B級(jí)；細(xì)胞數(shù)量非常少，難以辨別明顯的ICM結(jié)構(gòu)則為C級(jí)。TE評(píng)分：較多的細(xì)胞形成連接緊密的上皮層為A級(jí)；較少的細(xì)胞，上皮樣結(jié)構(gòu)不連續(xù)，連接松散為B級(jí)；細(xì)胞少且體積大為C級(jí)。4BB及以上囊胚定義為優(yōu)質(zhì)囊胚。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、兩組患者基礎(chǔ)資料分析

共收集到341個(gè)PGT-A周期，F(xiàn)ET后共有214個(gè)妊娠周期，其中27個(gè)周期為早期妊娠丟失，早期妊娠丟失率為12.62%(27/214)。繼續(xù)妊娠組與早期妊娠丟失組間基礎(chǔ)資料及抗β2糖蛋白抗體、抗心磷脂抗體IgM血清學(xué)免疫指標(biāo)比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者基本資料[(-±s)，n(%)]

二、兩組患者促排卵及胚胎移植情況分析

持續(xù)妊娠組的移植日子宮內(nèi)膜厚度高于早期妊娠丟失組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余指標(biāo)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 兩組患者的促排卵及胚胎移植情況[(-±s)，n(%)]

三、早期妊娠丟失多因素分析

將女方年齡、BMI、孕次、胚胎發(fā)育天數(shù)、移植日子宮內(nèi)膜厚度、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病史納入多因素分析，結(jié)果顯示，僅移植日子宮內(nèi)膜厚度對(duì)妊娠結(jié)局的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

表3 早期妊娠丟失患者多因素分析

討 論

染色體異常包括結(jié)構(gòu)異常和數(shù)量異常，目前認(rèn)為早期妊娠丟失中以染色體異常為主要原因，其中染色體非整倍體率異常占大部分[9]。PGT-A周期可篩選出整倍染色體的胚胎。多項(xiàng)研究均指出女性年齡是發(fā)生胎兒染色體異常的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[10-11]，本研究中移植的都是經(jīng)過(guò)篩選的具有正常的整倍體染色體的胚胎，發(fā)現(xiàn)女性的年齡并不影響早期妊娠丟失率，可能是女性年齡影響早期妊娠丟失主要是因?yàn)榕阅挲g影響胎兒的染色體；也有可能是獲得妊娠的患者基本情況較好，都較年輕。需要進(jìn)一步累積樣本量。胎兒的染色體還有一半來(lái)自父親，有研究發(fā)現(xiàn)男方年齡不會(huì)影響胚胎質(zhì)量及妊娠率，但隨著男性年齡的增長(zhǎng)，早期流產(chǎn)率增高[12]，原因可能與男性高齡導(dǎo)致胚胎染色體異常相關(guān)[13]，本研究中發(fā)現(xiàn)男方年齡對(duì)早期妊娠丟失率無(wú)影響，同樣可能與本研究中男性都偏年輕有關(guān)。

本研究在對(duì)移植的胚胎質(zhì)量及胚胎發(fā)育天數(shù)進(jìn)行討論發(fā)現(xiàn)，早期妊娠丟失與持續(xù)妊娠組中優(yōu)質(zhì)胚胎占比(37.04% vs. 39.04%)、D5胚胎占比(55.56% vs. 54.01%)無(wú)顯著差異。有研究結(jié)果提示移植D5的優(yōu)質(zhì)囊胚的臨床結(jié)局較D6者更好，考慮可能與D6囊胚中非整倍體率相較于D5囊胚增加有關(guān)[14-15]，而本研究中移植的都是經(jīng)過(guò)整倍性篩選的胚胎。成功的妊娠不僅需要好的胚胎，同時(shí)需要合適的子宮內(nèi)膜。當(dāng)子宮內(nèi)膜厚度保持在8.7～14.5 mm范圍內(nèi)時(shí)，可獲得最佳的活產(chǎn)率；如果子宮內(nèi)膜太薄或太厚，活產(chǎn)率將降低。也有研究指出內(nèi)膜厚度大于14 mm后，異位妊娠的發(fā)生會(huì)升高[16-17]。本研究中早期妊娠丟失組的子宮內(nèi)膜厚度低于持續(xù)妊娠組(9.59 mm vs. 9.73 mm)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，是早期妊娠丟失的影響因素。目前也有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜厚度及胚胎植入的深度也可作為ART成功的預(yù)測(cè)指標(biāo)[18-19]，這些指標(biāo)對(duì)于早期妊娠的丟失是否有影響，還有待進(jìn)一步的研究。

既往研究指出隨著流產(chǎn)次數(shù)的增加，再發(fā)流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)升高[20]。但既往流產(chǎn)次數(shù)與胚胎染色體異常是否相關(guān)仍存在爭(zhēng)議。一項(xiàng)均移植整倍體胚胎的研究顯示，流產(chǎn)史與持續(xù)妊娠、妊娠丟失無(wú)關(guān)[21]。本研究中兩組患者間的復(fù)發(fā)流產(chǎn)史占比也無(wú)顯著性差異，結(jié)果與上述研究一致。從另一個(gè)角度分析，隨著孕次和流產(chǎn)次數(shù)的增加，會(huì)對(duì)子宮內(nèi)膜造成一定的損傷從而導(dǎo)致早期妊娠丟失。本研究中未顯示孕次對(duì)早期妊娠丟失產(chǎn)生影響，可能的原因是本研究樣本量比較小，且平均孕次為(1.74±1.81)，孕次相對(duì)較少。確切證據(jù)還需大樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行研究探討。

肥胖是指BMI>28 kg/m2，肥胖可通過(guò)影響患者的體內(nèi)的脂肪酸含量及卵子卵泡液的環(huán)境，從而影響ART助孕的臨床結(jié)局[22-23]。但也有研究指出，肥胖及超重在凍融胚胎移植周期中不會(huì)增加流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)[24]。本研究中移植的胚胎都經(jīng)過(guò)篩選，且本研究中患者的BMI都相對(duì)較低，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMI對(duì)早期妊娠的流產(chǎn)率無(wú)顯著影響，與上述結(jié)論相一致。肥胖患者中PCOS的發(fā)病率也較高，PCOS是影響育齡婦女最常見(jiàn)的內(nèi)分泌疾病之一，PCOS患者的流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)仍在爭(zhēng)論之中。本研究未發(fā)現(xiàn)持續(xù)妊娠組與早期妊娠丟失組PCOS患者占比有顯著差異，與徐麗清等[9]研究結(jié)果相一致。

生殖免疫重要的篩查指標(biāo)包括抗β2糖蛋白抗體以及抗心磷脂抗體等。近年來(lái)研究顯示，抗β2糖蛋白抗體與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)有關(guān)[25]?？剐牧字贵w是一種凝血活性物質(zhì)，可影響子宮內(nèi)膜的血供從而引起流產(chǎn)；Zhong等[26]發(fā)現(xiàn)抗心磷脂抗體陽(yáng)性與不良妊娠結(jié)局顯著相關(guān)。但本研究中抗β2糖蛋白抗體和抗心磷脂抗體在持續(xù)妊娠組和早期妊娠丟失組間陽(yáng)性占比未見(jiàn)顯著差異，這可能與本研究中抗β2糖蛋白抗體和抗心磷脂抗體陽(yáng)性者均已接受治療有關(guān)。

綜上所述，本研究從臨床實(shí)際問(wèn)題出發(fā)，對(duì)經(jīng)過(guò)PGT-A胚胎篩選正常后植入?yún)s仍發(fā)生早期妊娠丟失的患者做了相關(guān)的統(tǒng)計(jì)分析，表明移植日子宮內(nèi)膜厚度是PGT-A周期中早期妊娠丟失的影響因素。但本研究還存在以下局限：樣本量??；流產(chǎn)的胚胎并未全部做流產(chǎn)組織檢測(cè)，PGT-A檢測(cè)正常的胚胎仍然存在嵌合體的可能。PGT-A的應(yīng)用在謹(jǐn)慎的原則下越來(lái)越廣泛，影響其胚胎早期丟失的原因仍需進(jìn)一步明確以指導(dǎo)臨床。