circLMNB1誘導(dǎo)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移發(fā)生

何春萍 黃超 周瑞 孫軍 阮鵬 于紅剛 姚濤

武漢大學(xué)人民醫(yī)院1消化內(nèi)科，2神經(jīng)內(nèi)科（武漢430060）

結(jié)直腸癌（CRC）是最常見的惡性腫瘤之一［1］，超過50%的CRC患者將在其一生中發(fā)生肝轉(zhuǎn)移［2］。目前對于轉(zhuǎn)移性晚期CRC 尚無有效治療方法。絕大多數(shù)CRC 病例是散發(fā)性的和非遺傳性的［3］。大量的CRC 零星的腫瘤前病變逐漸積累了遺傳和表觀遺傳修飾，使細(xì)胞增殖和存活不受控制，并逐步發(fā)展成為具有典型的浸潤和轉(zhuǎn)移特性［4］。了解這些轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制，對于優(yōu)化CRC 的治療策略非常重要。環(huán)狀RNA（circRNA）是一種保守且穩(wěn)定的共價(jià)閉合的RNA，它可能是潛在的疾病標(biāo)志物［5］。ZENG 等［6］發(fā)現(xiàn)，circHIPK3 在結(jié)直腸癌的生長與轉(zhuǎn)移過程中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。越來越多的研究聚焦于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在腫瘤中的作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被證明可誘發(fā)細(xì)胞凋亡［7］。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激失調(diào)存在相關(guān)性［8］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的激活可以誘導(dǎo)CRC 細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤發(fā)生與發(fā)展［9］。而circRNA 與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間存在調(diào)控關(guān)系。circHIPK2 可通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制，控制星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活［10］。然而，目前在結(jié)直腸癌中，通過circRNA 調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制，干預(yù)腫瘤發(fā)生進(jìn)展的鮮有報(bào)道。本研究首先對circLMNB1 在CRC 組織和癌旁組織及細(xì)胞系中的表達(dá)特征進(jìn)行探索，隨后，在CRC 細(xì)胞中對circLMNB1 表達(dá)進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)而檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力，同時對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制進(jìn)行探索。本研究將明確circLMNB1 在結(jié)直腸癌的作用機(jī)制，為結(jié)直腸癌的治療提供潛在的分子靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料研究收集2017年4月至2018年5月武漢大學(xué)人民醫(yī)院胃腸外科20 例結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織，并同時收集患者癌緣（3 ～5 cm）處組織作為癌旁組織。病例年齡在40 ～75 歲之間。納入標(biāo)準(zhǔn)：a.經(jīng)病理及影像檢查確診為結(jié)直腸癌；b. 未合并其他結(jié)直腸疾?。籧. 未合并其他腫瘤；d.術(shù)前無放化療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：a. 病理確診排除結(jié)直腸癌；b.合并其他腫瘤；c.術(shù)前經(jīng)放化療。研究開展前，經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理審查委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)中所采用的結(jié)直腸癌細(xì)胞系LoVO 和HCT116 均購于中科院細(xì)胞庫。circLMNB1 siRNA 由蘇州吉瑪生物設(shè)計(jì)并合成，circLMNB1 過表達(dá)載體pcircRNA2.2 由廣州伯信生物提供，用于細(xì)胞培養(yǎng)的RPMI 1640 細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基購自賽默飛旗下品牌Gibco，Transwell 小室由美國康寧公司提供。CHOP（A00311），ATF6（A00655）和GAPDH（A00227）一抗由博士德生物提供，HRP標(biāo)記的山羊抗兔（ab6721）二抗由Abcam 公司提供。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)蘇后的細(xì)胞，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基中，在5%CO2、37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 d 更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)密度達(dá)到85%以上時，進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.4 免疫印跡加入RIPA裂解液到細(xì)胞中充分混勻，于冰上裂解30 min 后離心，獲得總蛋白液。測得樣品總蛋白含量后，計(jì)算上樣量。取20 μg 總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉后，依次進(jìn)行一抗孵育過夜、TBST 洗滌3 次、二抗室溫下孵育1 h，隨后進(jìn)行顯色和曝光。

1.5 Transwell 遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)板中加入胰蛋白酶處理后制備單細(xì)胞懸液，接種到上室，并放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取出小室進(jìn)行固定和染色。取下小室底置于載玻片上，中性樹脂封片，觀察記錄多個視野下的遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)目。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.6 實(shí)時熒光PCR取50 mg 大小臨床組織或5×105個細(xì)胞，進(jìn)行總RNA 的提取。使用TRIzol 方法提取組織或細(xì)胞中的總RNA，并將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)成為cDNA。cDNA 模板采用如下引物進(jìn)行qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)。GAPDH：F，5′-CCAGCCGAGCCACATCGCTC-3′；R，5′-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3′。circLMNB1：F，5′-GCCAAAATTGAATGCTGTCC-3′；R，5′-TGAGATAGCCCAGCAATCCT-3′。以GAPDH 的表達(dá)為內(nèi)參，計(jì)算circLMNB1 相對表達(dá)水平。

1.7 患者臨床特征分析對納入的結(jié)直腸癌患者的基本信息及臨床特征，包括性別、年齡、腫瘤大小、轉(zhuǎn)移情況及TNM 分期情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩組間數(shù)據(jù)分析采用t檢驗(yàn)方法；多組間統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析進(jìn)行差異分析。計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用Graphpad 8.0 作圖。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circLMNB1 的表達(dá)特征qRT-PCR 結(jié)果顯示，circLMNB1 在結(jié)直腸癌患者的癌組織中表達(dá)水平顯著高于癌旁組織（P＜0.01，圖1A）。另外，circLMNB1 表達(dá)水平與臨床患者特征之間的關(guān)系分析見表1。

表1 CRC 患者特征Tab.1 Features of patients with CRC 例

circLMNB1 表達(dá)水平與年齡和性別均不存在顯著性的差異（P＞0.05）。而腫瘤大小、轉(zhuǎn)移情況均與circLMNB1 表達(dá)水平存在顯著的相關(guān)性（P＜0.05）。然而，TNM 分期與circLMNB1 表達(dá)并不存在相關(guān)性（P＞0.05）見表1。

同時，在人正常結(jié)直腸粘膜細(xì)胞FHC和結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116 和LoVo 中，circLMNB1 的表達(dá)水平也存在顯著差異。circLMNB1 在LoVo 和HCT116細(xì)胞系中的表達(dá)水平較FHC 細(xì)胞顯著上調(diào)（P＜0.05）。見圖1B。

圖1 circLMNB1 在結(jié)直腸癌臨床組織和細(xì)胞系中的表達(dá)特征Fig.1 Expression characteristics of circLMNB1 in Clinical tissues and Cell Lines of Colorectal Cancer

2.2 circLMNB1 對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響分別采用circLMNB1 和circLMNB1 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以對circLMNB1 進(jìn)行過表達(dá)和干擾表達(dá)（圖2A）。在HCT116 進(jìn)行circLMNB1 過表達(dá)后，其遷移和侵襲能力均出現(xiàn)顯著增強(qiáng)（P＜0.05）；而在LoVo 細(xì)胞中，采 用siRNA 對circLMNB1 進(jìn)行敲降后，細(xì)胞的遷移和侵襲能力均顯著減弱（P＜0.05）。

圖2 circLMNB1 對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響Fig.2 Cell migration and invasion was changed by circLMNB1 knockdown or overexpression in CRC cell line

2.3 circLMNB1 對結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制影響在HCT116 中對circLMNB1 進(jìn)行過表達(dá)后，CHOP 和ATF6 的表達(dá)水平出現(xiàn)顯著的下調(diào)；而在LoVo 細(xì) 胞中，使 用siRNA 對circLMNB1 進(jìn)行表達(dá)干擾后，CHOP 和ATF6 的表達(dá)水平則出現(xiàn)顯著的上調(diào)（圖3）。

圖3 circLMNB1 對結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白CHOP 和ATF6 表達(dá)水平影響Fig.3 Expression of CHOP and ATF6 was changed by circLMNB1 knockdown or overexpression in CRC cell line

3 討論

circRNAs 是一種通過選擇性剪接形成的內(nèi)源性RNA，廣泛分布于真核細(xì)胞中［11］。環(huán)狀RNA 由于其封閉的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不易被內(nèi)切酶降解，比線性RNA 更穩(wěn)定［12］。目前被當(dāng)作腫瘤診斷標(biāo)記物而進(jìn)行廣泛的研究［13］。如has_circRNA_102209 被證明其在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)，并可通過miR-761對腫瘤的增長與轉(zhuǎn)移進(jìn)行調(diào)控［14］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，circLMNB1 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)較癌旁組織高，同時，在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平較正常細(xì)胞高；進(jìn)一步的分析初步得知，circLMNB1表達(dá)水平與患者腫瘤的大小、轉(zhuǎn)移情況存在顯著的相關(guān)性，但仍有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本，進(jìn)行綜合分析。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被證實(shí)參與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移過程［15］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)建立了獨(dú)特的方式來對抗應(yīng)激，統(tǒng)稱為未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）［16］。在應(yīng)對來自外界的刺激時，細(xì)胞通常通過一系列的信號分子進(jìn)行調(diào)控，如ATF6、CHOP等［16］。研究表明，ATF6/CHOP 信號參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控，并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡［17］。XU 等［18］的研究證實(shí)，F(xiàn)OXD3 可通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡。HUANG 等［19］的最新研究表明，TSPYL5 可通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激CHOP 等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白表達(dá)，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)胞的遷移、侵襲等生物學(xué)行為。本研究發(fā)現(xiàn)，circLMNB1 的過表達(dá)引起結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激變?nèi)?，同時伴隨遷移和侵襲能力增強(qiáng)。但是對circLMNB1 進(jìn)行干擾，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則增強(qiáng)，同時，細(xì)胞遷移和侵襲能力變?nèi)?。結(jié)果表明，circLMNB1 可以調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，具有潛在的調(diào)控腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的作用。

總之，circLMNB1 可作為結(jié)直腸癌診斷的生物標(biāo)記物，它可能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的方式參與結(jié)直腸癌的發(fā)生與進(jìn)展。circLMNB1 的這種潛在價(jià)值，有望成為臨床診斷的標(biāo)記物及治療靶標(biāo)。