MiR-27b-3p靶向ID-3調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞增殖的研究

李志強(qiáng)，劉樹(shù)江，沈朝，郝玉升，吳文杰，苑萌萌

(河北省滄州市人民醫(yī)院骨科，河北 滄州 061000)

骨肉瘤好發(fā)于兒童和青少年，病理形態(tài)中觀察到明確的腫瘤性骨細(xì)胞形成，惡性程度較高，并具有高增殖的特征[1]。DNA結(jié)合/分化抑制蛋白-3(DNA binding/differentiation inhibitory protein-3，ID-3)是近年關(guān)注到與腫瘤形成相關(guān)的因子，其在骨肉瘤中表達(dá)上調(diào)，能抑制細(xì)胞分化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)微小RNA(microRNA，miRNA)是ID-3的上游因子[2]。miRNA是近年關(guān)注到的與腫瘤形成有關(guān)的非編碼單鏈小RNA，由19～25個(gè)核苷酸組成，通過(guò)與目標(biāo)基因的3′非翻譯區(qū)結(jié)合，調(diào)控病變的形成和進(jìn)展[3]。我們應(yīng)用生物信息分析進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)微小RNA-27b-3p(microRNA-27b-3p，miR-27b-3p)在骨肉瘤中可能異常表達(dá)，同時(shí)應(yīng)用TargetScan和Mirtarbase預(yù)測(cè)到ID-3可能是miR-27b-3p下游的靶基因(見(jiàn)圖1)?；诖耍緦?shí)驗(yàn)檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞系和腫瘤病變組織中miR-27b-3p的表達(dá)，分析miR-27b-3p靶向ID-3對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用。

圖1 miR-27b-3p與ID-3可能的堿基互補(bǔ)序列

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤細(xì)胞系U20S購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。應(yīng)用RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司，貨號(hào)SS16-1209)進(jìn)行培養(yǎng)。兔抗人ID-3多克隆抗體(武漢博士德生物技術(shù)公司，貨號(hào)DR106629-16，稀釋倍數(shù)1∶4 000)和兔抗人增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)多克隆抗體(武漢博士德生物技術(shù)公司，貨號(hào)DR108525-10，稀釋倍數(shù)1∶4 000)，RIPA裂解液(RIPA lysis buffer，RIRP)(武漢博士德生物技術(shù)公司，貨號(hào)DR106623-12)、胰酶消化液(武漢博士德生物技術(shù)公司，貨號(hào)DR106965-01)、質(zhì)粒提取試劑(武漢博士德生物技術(shù)公司，貨號(hào)DR109623-03)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(武漢博士德生物技術(shù)公司，貨號(hào)DR106690-15)、羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司，貨號(hào)DR100023-08，稀釋度1：3500)及二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)(武漢博士德生物技術(shù)公司，貨號(hào)DR100025-05)。Lipofetamine 2000(Invitrogen公司，貨號(hào)6958-7415)和雙熒光素酶試劑盒(Invitrogen公司，貨號(hào)0152-1098)。引物由上海吉瑪生物合成，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)(北京索萊寶生物公司，貨號(hào)CH-171502A)。采用MK3型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)及IQ5聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀(美國(guó)Bio Rad公司)。

1.2 臨床資料 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)首次發(fā)病并手術(shù)切取病變組織，經(jīng)病理確診，符合世界衛(wèi)生組織(world health organization，WHO)中的標(biāo)準(zhǔn)。(2)臨床及病理資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)診斷不明確或合并有其他腫瘤成份；(2)術(shù)前行放、化療；(3)伴有嚴(yán)重內(nèi)科疾病。根據(jù)納入與排除標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用前瞻性研究方法選擇2016年1月至2017年4月確診為骨肉瘤的患者40例，其中男22例，女18例；年齡4～88歲，平均(16.3±4.3)歲。留取新鮮的腫瘤組織(-80℃凍存)。患者或家屬均簽定知情同意書(shū)，研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(醫(yī)學(xué)倫理批準(zhǔn)文號(hào)2016-0105A)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞復(fù)蘇后，應(yīng)用10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換1次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%的融合度時(shí)，接種于12孔板，將細(xì)胞密度調(diào)至5×105個(gè)/孔。構(gòu)建質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，建立空白對(duì)照組(NC組)、空載體轉(zhuǎn)染組、miR-27b-3p mimic組、miR-27b-3p mimic和siRNA ID-3共轉(zhuǎn)染組，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作?？瞻讓?duì)照組：不做轉(zhuǎn)染?？蛰d體轉(zhuǎn)染組：轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒。miR-27b-3p mimic組：轉(zhuǎn)染含miR-27b-3p mimic質(zhì)粒(miR-27b-3p mimic由上海吉瑪基因公司合成)。miR-27b-3p mimic和siRNA ID-3共轉(zhuǎn)染組：共同轉(zhuǎn)染含miR-27b-3p mimic質(zhì)粒和含siRNA ID-3質(zhì)粒(miR-27b-3p mimic和siRNA ID-3由上海吉瑪基因公司合成)。

1.3.2 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 檢測(cè)miR-27b-3p對(duì)ID-3 3'非翻譯區(qū)(3' untranslated region，3' UTR)結(jié)合情況。將含有ID-3 mRNA 3'UTR的野生型(pGL3-ID-3-WT)和突變型(pGL3-ID-3-MT)報(bào)告質(zhì)粒，分別同miR-27b-3p mimic、空白對(duì)照共轉(zhuǎn)染到人骨肉瘤細(xì)胞株U2OS中，轉(zhuǎn)染3 h后換液，在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h后觀察熒光素酶活性。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用RT-qPCR檢測(cè)miR-27b-3p的表達(dá)。Trizol提取總RNA。miR-27b-3p引物上游：5＇-TCGAAAACTGGCCAAGCCTGC-3＇，下游：5＇-TGCTTAAATCCAGGAATTGCT-3＇。U6為內(nèi)參，引物上游：5＇-GGCAGAAAGATTAGC-3＇，下游：5＇-TTGGAACGCAAATTCCG-3＇。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄法合成cDNA。擴(kuò)增程序：95℃ 15 min；95℃ 15 s，55℃ 30 s，70℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)。于60℃采集信號(hào)。讀取CT值，以2-ΔΔCT法表示結(jié)果。ΔΔCT=[CT目的基因(未知樣品)-CT對(duì)照(未知樣品)]-[CT目的基因(校正樣品)-CT對(duì)照(校正樣品)]。

1.3.4 免疫組化實(shí)驗(yàn) 免疫組化二步法檢測(cè)骨肉瘤石蠟包埋組織中ID-3和PCNA的表達(dá)。切取4μm切片，DAB顯色。ID-3的表達(dá)部位是細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞膜，PCNA的表達(dá)部位是細(xì)胞核，隨機(jī)選擇5個(gè)400倍視野(熱點(diǎn)區(qū))，計(jì)算陽(yáng)性率，取平均值。

1.3.5 Western Blot實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用Western Blot法檢測(cè)ID-3和PCNA的表達(dá)。基于新鮮組織，提取總蛋白，依次完成蛋白變性、加樣、電泳、電轉(zhuǎn)膜、免疫雜交步驟后取出膜加入發(fā)光液，膠片盒曝光3 min，顯影15 s。以目的蛋白與GAPDH的比值作為定量結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3.6 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性 各組細(xì)胞消化轉(zhuǎn)染后按每孔3 000個(gè)左右接種，孵育過(guò)液，每孔中加入10 μL CCK-8溶液，避光孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm處的吸光值。細(xì)胞活力計(jì)算公式：細(xì)胞活力(%)=(Absample-Abbland)/(Abcontrol-Abbalnd)×100%。

1.3.7 集落形成實(shí)驗(yàn) 消化轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞收集到離心管中，計(jì)算細(xì)胞濃度，在6孔板中每孔加入500個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每48 h更換培養(yǎng)基1次，培養(yǎng)14 d后吸走培養(yǎng)基，加入無(wú)水乙醇固定20 min，再用0.5%的結(jié)晶紫染色20 min，去離子水清洗觀察。

2 結(jié) 果

2.1 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果 構(gòu)建含有野生型ID-3 mRNA 3'UTR的pGL3-basic質(zhì)粒(pGL3-ID-3-WT)，構(gòu)建含有miR-27b-3p結(jié)合位點(diǎn)缺失的突變型ID-3 mRNA 3'UTR的質(zhì)粒(pGL3-ID-3-MT)。分別與空白對(duì)照組(NC)、miR-27b-3p mimic組進(jìn)行培養(yǎng)，檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-27b-3p mimic與pGL3-ID-3-WT共轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞系中熒光素酶活性顯著降低，而與 pGL3-ID-3-MT共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中無(wú)明顯變化，提示miR-27b-3p與ID-3的3'UTR具有結(jié)合的能力(見(jiàn)圖2)。

注：*P<0.05

2.2 各組細(xì)胞增殖能力 檢測(cè)轉(zhuǎn)染第0～5天細(xì)胞的活性。相對(duì)于空白對(duì)照組、空載體轉(zhuǎn)染組，miR-27b-3p mimic組細(xì)胞活性于第2天開(kāi)始下降，持續(xù)到第5天，而共轉(zhuǎn)染組能夠逆轉(zhuǎn)miR-27b-3p mimic組的細(xì)胞活性(見(jiàn)圖3)。

圖3 各組細(xì)胞增殖能力

2.3 各組細(xì)胞中ID-3和PCNA的表達(dá) 相對(duì)于空白對(duì)照組、空載體轉(zhuǎn)染組，miR-27b-3p mimic組ID-3和PCNA的表達(dá)均下降，而共轉(zhuǎn)染組能逆轉(zhuǎn)上述改變(見(jiàn)圖4～5)。

圖4 各組細(xì)胞中ID-3和PCNA的表達(dá)

圖5 各組細(xì)胞中ID-3和PCNA的表達(dá)

2.4 各組細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn) 相對(duì)于空白對(duì)照組的(51.2±4.3)個(gè)、空載體轉(zhuǎn)染組的(48.8±3.9)個(gè)，miR-27b-3p mimic組(31.5±6.7)個(gè)中肉眼可見(jiàn)的克隆集落數(shù)量明顯減少，而共轉(zhuǎn)染組能逆轉(zhuǎn)上述改變(47.4±4.4)個(gè)(見(jiàn)圖6～7)。

圖6 集落形成實(shí)驗(yàn)圖 圖7 集落形成實(shí)驗(yàn)柱狀圖

2.5 骨肉瘤中miR-27b-3p與ID-3、PCNA的相關(guān)分析 采用RT-qPCR法檢測(cè)骨肉瘤中miR-27b-3p的表達(dá)量為1.2～4.3，平均(2.5±0.8)。免疫組化檢測(cè)ID-3的陽(yáng)性率為6%～70%，平均(34.3±9.0)%；PCNA增殖指數(shù)8%～85%，平均(46.5±8.8)%。相關(guān)分析顯示miR-27b-3p與ID-3(r=-0.58，P=0.014)、miR-27b-3p與PCNA(r=-0.54，P=0.021)呈負(fù)相關(guān)性，ID-3與PCNA(r=0.52，P=0.030)呈正相關(guān)性(見(jiàn)圖8～9)。

圖8 骨肉瘤中miR-27b-3p溶解曲線(RT-qPCR)

a PCNA的表達(dá) b ID-3的表達(dá)

2.6 miR-27b-3p表達(dá)與生存時(shí)間的關(guān)系 患者均進(jìn)行術(shù)后3年(36個(gè)月)生存時(shí)間的隨訪，截止時(shí)間點(diǎn)為2020年4月30日。其中存活19例，死亡20例，失訪1例。死亡患者生存時(shí)間為6～36個(gè)月，中位生存時(shí)間為25個(gè)月。生存分析顯示miR-27b-3p的表達(dá)與生存時(shí)間相關(guān)，即miR-27b-3p低表達(dá)患者的預(yù)后差(見(jiàn)圖10)。

圖10 miR-27b-3p表達(dá)的生存分析

3 討 論

骨肉瘤常用的細(xì)胞株包括鼠源性細(xì)胞株S-SLM、K7M2、Kl2、UMR106-01、Dunn、LM7、LM8和人源性細(xì)胞株MG-63、POS-l、HOS-58及SAOS-2等。ID-3在人源性細(xì)胞株包括MG-63、POS-l、HOS-58及SAOS-2中均有表達(dá)。人骨肉瘤細(xì)胞株U2OS是由Ponten和Saksela在1964年從一名15歲女孩的脛骨中等分化的肉瘤中分離建立。從體外培養(yǎng)看，人骨肉瘤細(xì)胞株U2OS增殖速度快于其他細(xì)胞株，且細(xì)胞呈多形性。U2OS構(gòu)建的裸鼠移植瘤模型生長(zhǎng)速度塊，有很明顯的生長(zhǎng)趨勢(shì)，惡性程度中等，裸鼠存活期大約68 d，允許研究人員有足夠的時(shí)間對(duì)其進(jìn)行干預(yù)和研究，且移植瘤瘤體較大，便于操作和觀察。骨肉瘤的形成涉及DNA、RNA及蛋白的異常表達(dá)[4-5]。近年關(guān)注到miRNAs的表達(dá)失調(diào)是腫瘤形成的重要促進(jìn)因子，其作用途徑主要是通過(guò)調(diào)控靶基因?qū)崿F(xiàn)[6]，主要涉及細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及分化的各種生物學(xué)過(guò)程。microRNA在人類各種腫瘤中扮演著重要的角色，作為致癌基因和抑癌基因，主要作用機(jī)制包括調(diào)控基因擴(kuò)增、缺失、突變和轉(zhuǎn)錄因子的異常表達(dá)等。miR-27b-3p可以促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖，但臨床中尚未明確其調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞的途徑和通路[7]。miR-27b-3p是我們關(guān)注的重要因子，其異常表達(dá)是腫瘤形成的關(guān)鍵事件。ID-3是篩選出的與miR-27b-3p具有互補(bǔ)配對(duì)序列的因子，二者均參與細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的調(diào)控中。分化差的腫瘤常伴有ID-3的高表達(dá)，這類細(xì)胞具有“永生化”的特征[8]。ID-3具有阻止細(xì)胞分化的作用，細(xì)胞趨于原始，腫瘤呈高度的侵襲性及增殖活性[9]。也有學(xué)者認(rèn)為ID-3是誘導(dǎo)癌基因形成的因子之一，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、血管生成及抑制凋亡[10]。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用PCNA作為標(biāo)記增殖指標(biāo)的因子，效果理想，能客觀反映其所標(biāo)記細(xì)胞的增殖特征。

實(shí)驗(yàn)顯示骨肉瘤細(xì)胞系中miR-27b-3p能引起轉(zhuǎn)染pGL3-ID-3-WT的細(xì)胞中熒光素酶活性降低，提示miR-27b-3p能與ID-3的3'UTR區(qū)結(jié)合，證實(shí)了在TargetScan和Mirtarbase預(yù)測(cè)到的miR-27b-3p與ID-3具有互補(bǔ)序列的結(jié)果，也提示二者具有靶向關(guān)系。結(jié)果顯示miR-27b-3p mimic組細(xì)胞活性明顯下降、克隆集落數(shù)量明顯減少、PCNA的表達(dá)下調(diào)，而miR-27b-3p mimic和siRNA ID-3共轉(zhuǎn)染組能逆轉(zhuǎn)上述表達(dá)水平，提示miR-27b-3p和ID-3結(jié)合后對(duì)調(diào)控細(xì)胞增殖有重要作用，即miR-27b-3p通過(guò)負(fù)調(diào)控ID-3抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖。骨肉瘤組織中發(fā)現(xiàn)miR-27b-3p與ID-3、miR-27b-3p與PCNA、ID-3與PCNA具有相關(guān)性，間接證實(shí)了上述結(jié)論。ID-3對(duì)細(xì)胞增殖調(diào)控通路是骨肉瘤形成過(guò)程中細(xì)胞失控性增生時(shí)的重要通路，ID-3高表達(dá)時(shí)細(xì)胞停滯于S期，細(xì)胞活性增強(qiáng)。MiR-27b-3p低表達(dá)時(shí)促進(jìn)ID-3對(duì)細(xì)胞增殖的作用。有資料顯示miR-27b-3p在正常的間葉源性組織中有一定的表達(dá)，而在間葉源性惡性腫瘤和自身免疫性疾病中常伴有miR-27b-3p表達(dá)的下調(diào)，對(duì)腫瘤微環(huán)境的形成有一定的影響[11-12]。MiR-27b-3p可能作為腫瘤抑制基因發(fā)揮作用[13]，其下游基因較多，本實(shí)驗(yàn)觀察到的ID-3即為重要的下游基因[14]。但我們也觀察到miR-27b-3p在腫瘤中的作用是復(fù)雜的，如對(duì)FZD7的調(diào)控發(fā)揮抑制腫瘤進(jìn)展的作用[15]，通過(guò)對(duì)Bmal1的調(diào)節(jié)抑制肝細(xì)胞的異型增生等[16]。研究顯示[17]，加入miR-27b抑制劑可以抑制骨肉瘤細(xì)胞SAOS-2細(xì)胞的增殖。miR-27b-3p可通過(guò)調(diào)控靶基因CDH11而影響宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，促使宮頸癌細(xì)胞發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，從而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[18-20]。因此，miR-27b-3p在腫瘤中是個(gè)多功能的因子[21-22]，從細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，miRNA-27b-3p可以促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，對(duì)miR-27b-3p下游多項(xiàng)靶基因調(diào)控的研究有重要意義。結(jié)果觀察到miR-27b-3p的表達(dá)與生存時(shí)間相關(guān)，提示miR-27b-3p的表達(dá)與預(yù)后有關(guān)，miR-27b-3p可能是判斷骨肉瘤預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。但是關(guān)于miR-27b-3p在腫瘤預(yù)后判斷中的具體價(jià)值需要后續(xù)研究進(jìn)行多中心、大樣本、多因素分析后進(jìn)一步明確。

綜上所述，miR-27b-3p低表達(dá)是骨肉瘤形成的重要分子事件，表明miR-27b-3p可能為一個(gè)潛在的靶點(diǎn)用于骨肉瘤治療。MiR-27b-3p靶向負(fù)調(diào)控ID-3抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，MiR-27b-3p的表達(dá)與腫瘤的預(yù)后相關(guān)。