IL-15Rα及RUNX2基因多態(tài)性與內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族后縱韌帶骨化的相關(guān)性研究

李鵬飛，朱淑芬

(內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院脊柱外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017)

隨著年齡增長，在眾多因素作用下，后縱韌帶組織中新生異位骨結(jié)構(gòu)形成而逐漸發(fā)生骨化，導(dǎo)致椎管、椎間孔狹窄，壓迫脊髓、神經(jīng)根，臨床上出現(xiàn)脊髓損害癥狀及神經(jīng)根刺激癥狀，即為后縱韌帶骨化癥(ossification of posterior longitudinal ligament，OPLL)。OPLL是一種病因尚未明確的病理現(xiàn)象。據(jù)統(tǒng)計(jì)，脊柱OPLL中70%發(fā)生于頸椎，胸椎僅占15%[1]，國內(nèi)外未發(fā)現(xiàn)有發(fā)生于腰椎的報(bào)道。頸椎OPLL是脊髓型頸椎病的主要病因之一[1]，其預(yù)后差異很大，癥狀可以從一直處于無癥狀的穩(wěn)定狀態(tài)到短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)四肢癱瘓[2]。大量臨床研究已經(jīng)證實(shí)，OPLL為一種遺傳因素和外界因素共同作用所致的復(fù)雜疾病。外界因素包括慢性退行性變，內(nèi)分泌和代謝性疾病，糖尿病、飲食、高氟及高銅等均與OPLL有關(guān)[3]。我院脊柱外科2014年1月至2019年12月共收治頸椎OPLL患者620例，其中蒙古族患者為241例，占總數(shù)為31.2%，高于本地區(qū)蒙古族人口比例。雖然在流行病學(xué)上蒙古族OPLL還無相關(guān)調(diào)查，但由臨床上看本地區(qū)蒙古族OPLL發(fā)病率較高，發(fā)病程度較重，因此，蒙古族OPLL基因多態(tài)性研究較有意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年1月至2019年12月就診于內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院脊柱外科門診或住院部的蒙古族OPLL患者，以及同期健康體檢的蒙族人群為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：OPLL患者及健康組均符合祖籍三代及三代以上居住在內(nèi)蒙古地區(qū)無血緣關(guān)系、無異族通婚史疾病病史，無氟骨癥病史、無高血壓、糖尿病等慢性基礎(chǔ)疾病，無腫瘤、自身免疫性疾病及其他家族性遺傳疾病的病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：有血緣關(guān)系、有異族通婚史疾病病史，有氟骨癥病史、有高血壓、糖尿病等慢性基礎(chǔ)疾病，有腫瘤、自身免疫性疾病及其他家族性遺傳疾病的病史。

根據(jù)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，共有110例內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族后縱韌帶骨化患者，其中男75例，女35例；年齡38～78歲，平均(53.0±12.8)歲。118例健康蒙古族人群，其中男65例，女53例；年齡45～68歲，平均(58.0±11.2)歲。研究對象年齡、性別構(gòu)成比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意，并且入選檢測者均簽署知情同意書。

1.2 方法 采用基因測序法對110例內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族后縱韌帶骨化患者和118例健康蒙古族人群進(jìn)行白細(xì)胞介素15受體α亞單位(interleukin-15 receptor α subunits，IL-15Rα)基因及Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(recombinant Runt related transcription factor 2，RUNX2)基因多態(tài)性的檢測。

1.2.1 基因組DNA提取 所有入選對象采外周靜脈血3 mL，乙二胺四乙酸(ethylenediammine tetracetic acid，EDTA)抗凝，采用天根生化科技有限公司提供的全血基因組DNA提取試劑盒提取DNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank提供的基因序列，將單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)作為靶序列，根據(jù)SNP位點(diǎn)兩側(cè)的保守序列設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行，設(shè)置的主要參數(shù)為：引物長度一般為18～24 bp；理論退火溫度Tm值55～65℃；(G+C)含量40%～70%；擴(kuò)增片段大小<800 bp。由天根生化科技公司合成引物序列，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性法(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)引物信息見表1。采用SNaPshot分型方法進(jìn)行分型，對分型結(jié)果進(jìn)行雙盲樣本質(zhì)控和陰性對照質(zhì)控。

1.2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增目片段 引物設(shè)計(jì)合成并確認(rèn)DNA模板質(zhì)量合格的情況下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系總體系為25 μL，包括：基因組DNA 1 μL，酶0.5 μL，10×buffer 2.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，三磷酸堿基脫氧核苷酸(deoxyribonucleoside triphosphate,dNTPs)0.5 μL，dd H2O 19.5 μL；PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，50～65℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃終末延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖電泳檢測，于紫外燈下觀察是否有條帶及條帶亮度。

1.2.4 DNA序列測定 測序PCR反應(yīng)所選用的試劑為ABI公司的BDT3.1測序試劑盒(Big Dye Terminator v3.1)，測序反應(yīng)均按照BDT3.1使用手冊進(jìn)行。測序PCR產(chǎn)物的純化采用BDT3.1使用手冊中的乙醇沉淀方法，干燥后4℃避光保存。甲酰胺變性需加入10 μL甲酰胺，將純化后的干粉充分溶解，隨后置于PCR儀中進(jìn)行變性反應(yīng)。最后上樣測序，將變性后的樣品采用3730XL進(jìn)行測序。

表1 PCR-RFLP引物信息

2 結(jié) 果

健康蒙古族118例與蒙古族OPLL 110例采用χ2檢驗(yàn)對rs1321075位點(diǎn)基因型、等位基因頻率進(jìn)行比較，AC、CC型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，OR值(95%CI)分別為0.584(0.343，0.997)、1.978(1.166，3.353)，等位基因C的OR值(95%CI)為0.588(0.386，0.895)；對rs16873379位點(diǎn)基因型、等位基因頻率進(jìn)行比較，CT、TT型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，OR值(95%CI)分別為2.756(1.595，4.760)、0.266(0.153，0.461)，等位基因C的OR值(95%CI)為2.514(1.678，3.768)；對rs2296139位點(diǎn)基因型、等位基因頻率進(jìn)行比較，AA基因型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，OR值(95%CI)為0.416(0.218，0.797)；其他位點(diǎn)基因型、等位基因頻率進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

表2 兩組RUNX2基因及IL-15Rα基因型和等位基因頻率分布比較

3 討 論

OPLL是一種高發(fā)于東亞地區(qū)的常見病。日本的發(fā)病率為1.9%～4.3%，韓國約為3.6%，中國臺灣約為2.8%，而北美白人僅為0.12%[4-5]。根據(jù)李中實(shí)等[6]的調(diào)查，中國北方人群的OPLL發(fā)病率為0.44%～8.92%。1981年日本頸椎OPLL患者直系親屬與其他親屬的OPLL發(fā)病率分別為23%和22%，而普通人群僅為3.7%[7]，這表明頸椎OPLL有基因遺傳基礎(chǔ)。因調(diào)查人群中兄弟姐妹間種族隔離率為0.26，大于隱性特性的理論最大值0.25，故推測其為顯性遺傳。Terayama[8]調(diào)查了347例OPLL患者家庭，共1 030例家庭成員，發(fā)現(xiàn)影像學(xué)表現(xiàn)為OPLL的患者父母達(dá)26.5%，兄妹中發(fā)現(xiàn)OPLL的占28.89%，符合常染色體顯性遺傳特點(diǎn)。2003年，Tanaka等[9]采用全基因組掃描手段，研究了142例日本OPLL患者，發(fā)現(xiàn)1p、6p、11q、14q、16q和21q可能為OPLL的易感基因區(qū)域，而位于21q22·3的微衛(wèi)星標(biāo)志D21S1903具有強(qiáng)烈的關(guān)聯(lián)性。目前懷疑的易感基因包括膠原11A2(COL11A2)、膠原6A1(COL6A1)、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1，ENPP1)重組蛋白、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)、瘦素受體、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)、視黃酸X受體β(retinoid X receptorretinoid β，RXRβ)、雌激素受體、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1、RUNX2、血管生成素-1(angiopoietin-1，ANG-1)以及G蛋白偶聯(lián)嘌呤受體P2Y1(G protein coupled purinergic receptor，P2RY1)等[10]。2016年陳欣等[11]報(bào)道，利用目標(biāo)基因測序技術(shù)，對11個(gè)已知OPLL致病基因進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)COL11A2是OPLL易感基因。

Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(recombinant Runt related transcription factor 2，RUNX)家族的轉(zhuǎn)錄因子協(xié)調(diào)了細(xì)胞的各種發(fā)育過程，如細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞譜系專項(xiàng)分化。RUNX基因是根據(jù)發(fā)育調(diào)控基因Runt的發(fā)現(xiàn)命名的，Runt被認(rèn)為是早期胚胎分割的關(guān)鍵。RUNX轉(zhuǎn)錄因子包括RUNX1、RUNX2和RUNX3。RUNX2是骨骼發(fā)育的主要調(diào)節(jié)因子，在成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞譜系的規(guī)范和分化中發(fā)揮多種作用[12]。軟組織中的新生骨形成是通過間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)分化為成骨細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的，成骨細(xì)胞成熟為骨細(xì)胞并最終形成骨，這一過程稱為膜內(nèi)骨化，RUNX2基因是MSCs向成骨細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。成骨細(xì)胞的命運(yùn)選擇和導(dǎo)致膜內(nèi)骨化的成熟途徑在很大程度上由RUNX2控制。軟骨分化則由RUNX2和RUNX3共同調(diào)節(jié)[12]。Kishiya等[13]應(yīng)用DNA微陣列檢測RUNX2基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)韌帶骨化癥患者RUNX2基因表達(dá)增強(qiáng)。他們將骨化的后縱韌帶細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，然后應(yīng)用RNA干擾(RNA interference，RNAi)抑制RUNX2基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)骨化細(xì)胞促血管生成素-1表達(dá)明顯下調(diào)，而正常細(xì)胞的表達(dá)沒有明顯差異，提示促血管生成素-1在脊柱韌帶異位骨化過程中也起重要作用。Liu等[14]以COL6A1、RUNX2、BMP-2、維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)4組基因，對82例OPLL患者及118例健康對照進(jìn)行了研究，得出RUNX2的RS1321075及RS12333172兩個(gè)位點(diǎn)與OPLL強(qiáng)烈相關(guān)。

IL-15是繼IL-2之后被發(fā)現(xiàn)的又一重要的T細(xì)胞生長因子，它的生物學(xué)活性廣泛，經(jīng)證明在某些臨床疾病中有其獨(dú)特的作用，IL-15Rα是白細(xì)胞介素15受體異源三聚體(interleukin-15 receptorαβγsubunit，IL-15Rαβγ)的重要組成部分。除了參與高特異、高親和力受體的組成外，IL-15Rα還具有一個(gè)非常罕見的特性，即無需β和γ亞單位的參與，其獨(dú)自便能夠以極高的親和力同IL-15結(jié)合。IL-15Rα在免疫發(fā)展和功能作用上起重要作用，它與IL-15的高度親和性使它在IL-15的信號傳導(dǎo)上起重要作用。IL-15Rα是促炎信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要組成部分，由于其參與多種生理和代謝過程而日益受到人們的重視。IL-15和IL-15Rα水平在運(yùn)動引起的低度炎癥中急劇升高[15]，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等病理?xiàng)l件下也有慢性升高，尤其是在關(guān)節(jié)滑液中可以升高[16]。Petrovic-Rackov等[17]報(bào)道，在骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者血清和滑液中IL-15水平明顯高于骨關(guān)節(jié)炎的患者，且與疾病活動相關(guān)。IL-15Rα基因的SNP與骨量有關(guān)[17]。Loro等[18]研究IL-15Rα在成骨細(xì)胞調(diào)節(jié)和骨礦化中的作用，證明IL-15Rα是保證成骨細(xì)胞/破骨細(xì)胞有效結(jié)合所必需的，在決定成骨細(xì)胞磷酸穩(wěn)態(tài)和礦化能力方面起重要作用，尤其對皮質(zhì)骨礦化至關(guān)重要。

Kim等[19]首先報(bào)道，通過研究166例OPLL患者和230例健康人群對比，IL-15Rα的(rs2228059，Asn182Thr)多態(tài)性可能與韓國人OPLL的易感性有關(guān)。Guo等[20]報(bào)道，通過研究235例漢族OPLL患者和250例漢族健康人群，也得出IL-15Rα的(rs2228059，Asn182Thr)多態(tài)性是OPLL的易感因素。

本實(shí)驗(yàn)采用基因測序法對內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族OPLL患者110例進(jìn)行RUNX2基因及IL-15Rα基因多態(tài)性的檢測，發(fā)現(xiàn)蒙古族OPLL患者都與rs1321075位點(diǎn)、rs16873379位點(diǎn)和rs2296139位點(diǎn)有關(guān)。rs1321075位點(diǎn)AC型、等位基因C可能為保護(hù)因素，CC型可能為危險(xiǎn)因素；rs16873379位點(diǎn)CT型、等位基因C為危險(xiǎn)因素，TT型為保護(hù)因素；rs2296139位點(diǎn)AA基因型為保護(hù)因素，其他位點(diǎn)基因型、等位基因頻率進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)

綜上所述，RUNX2基因及IL-15Rα基因中rs1321075位點(diǎn)、rs16873379位點(diǎn)和rs2296139位點(diǎn)基因多態(tài)性，在內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族OPLL人群中可能起到一定的作用。