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    長(zhǎng)鏈非編碼RNA-ATB對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制研究

    2021-03-16 06:50:58高蜜陽(yáng)張榮明熊亮申錦帆劉暢
    關(guān)鍵詞:共轉(zhuǎn)染疙瘩纖維細(xì)胞

    高蜜陽(yáng),張榮明,熊亮,申錦帆,劉暢

    (錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 燒傷整形科,遼寧 錦州121000)

    瘢痕疙瘩是由于傷口、創(chuàng)傷、燒傷、手術(shù)切口或疾病等導(dǎo)致瘢痕形成,主要與成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的大量沉積有關(guān)[1]。瘢痕疙瘩的臨床表現(xiàn)主要是高出皮膚的瘢痕組織生長(zhǎng),通常伴有瘙癢和疼痛。有研究顯示瘢痕疙瘩的形成與基因調(diào)控、炎癥因子、細(xì)胞因子和免疫因素等密切相關(guān)[2]。由于瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制和調(diào)控機(jī)制尚不清楚,瘢痕疙瘩的治療仍未取得突破性進(jìn)展。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是非編碼RNA的亞類(lèi),其長(zhǎng)度超過(guò)200 nt,且具有比編碼RNA 更強(qiáng)的組織和細(xì)胞特異性。lncRNA 在不同的細(xì)胞、組織及其不同的發(fā)育階段中表達(dá)均不同,并參與各種疾病的發(fā)生、發(fā)展,同時(shí)在細(xì)胞分化、增殖、遷移、凋亡和代謝等過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[3]。有研究顯示大量lncRNAs 在瘢痕疙瘩中存在異常表達(dá),其中l(wèi)ncRNA AC073257.2 能夠調(diào)控GLI2基因,參與成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖;lncRNA HNF1A-AS1 能夠調(diào)控HNF1A基因,參與瘢痕疙瘩的形成[4]。有研究顯示被轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子b 激活的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA-ATB)在腫瘤、外周血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、骨關(guān)節(jié)炎、免疫性等疾病中發(fā)揮著重要作用[5-7]。然而ATB 在瘢痕疙瘩中的作用及機(jī)制尚未完全闡明。因此本研究采用RT-PCR 檢測(cè)瘢痕疙瘩和正常皮膚組織中ATB 的表達(dá)水平,并進(jìn)一步深入探討ATB 調(diào)控miR-200c/DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3B 通路在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和凋亡中的作用,證實(shí)ATB/miR-200c/DNMT3B 軸對(duì)瘢痕疙瘩形成的影響。

    1 材料與方法

    1.1 組織標(biāo)本

    選取2017年12月—2018年7月在錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院燒傷整形科接受瘢痕疙瘩治療的30 例患者。其中,男性19 例,女性11 例;平均年齡(32.7±10.1)歲;在手術(shù)前均未接受藥物治療、放射治療、化學(xué)治療、激光治療等。排除腫瘤、免疫性疾病及嚴(yán)重的肝腎功能不全患者。術(shù)中切除瘢痕疙瘩和少量周?chē)Fつw組織,標(biāo)本保存于液氮中用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。同時(shí)分為瘢痕疙瘩組和正常皮膚組,以及瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞細(xì)胞組與正常成纖維細(xì)胞組?;颊呔炇鹬橥鈺?shū)。

    1.2 主要試劑

    DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,CCK-8 試劑盒購(gòu)自大連碧云天生物技術(shù)有限公司,磷酸鹽緩沖液和胰蛋白酶購(gòu)自上海思吉生物制品有限公司, RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Lipofectamine 2000 購(gòu)自日本TaKaRa 公司,Trizol Reagent 和SYBR Green 購(gòu)自美國(guó)Promega 公司,miRNeasy Mini Kit 購(gòu)自德國(guó)Qiagen 公司,TaqMan MicroRNA Assay 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司,兔抗人DNMT3B、周期素依賴(lài)性激酶6(CDK6)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和β-actin 抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司,HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 購(gòu)自美國(guó)CST 公司。sh-ATB、sh-DNMT3B、miR-NC、miR-200c mimics 和miR-200c inhibitors 由中國(guó)上海Genepharm 公司合成。通過(guò)PCR 擴(kuò)增野生型(o/e-ATB) 或突變體(o/e-NC)ATB 片段,并亞克隆到pcDNA3.1 載體,pcDNA3.1載體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司。

    1.3 方法

    1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù),采用含10%胎牛血清的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基在37℃、5%二氧化碳平衡濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),采用Lipofectamine 2000 按試劑盒說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染sh-ATB、 o/e-ATB、 miR-200c mimics、 miR-200c inhibitors 和sh-DNMT3B,轉(zhuǎn)染24 h 后用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。同時(shí)根據(jù)不同轉(zhuǎn)染方式分為:sh-NC 組、sh-ATB組、o/e-NC 組、o/e-ATB 組、miR-NC 組、miR-200c mimics 組、miR-200c inhibitors 組、共轉(zhuǎn)染sh-ATB+miR-200c inhibitors 組、共轉(zhuǎn)染o/e-ATB+miR-200c inhibitors 組、共轉(zhuǎn)染miR-200c inhibitors+sh-DNMT3B 組、共轉(zhuǎn)染miR-200c mimics+sh-DNMT3B 組。

    1.3.2 qRT-PCR采用miRNeasy Mini Kit 提取miRNA,使用TaqMan MicroRNA Assay 試劑盒檢測(cè)miR-200c 的相對(duì)表達(dá)量,并使用Applied Biosystem 7500 進(jìn)行qRT-PCR,U6 作為內(nèi)參。采用Trizol 提取組織和細(xì)胞中總RNA,使用NanoDrop 1000 分光光度計(jì)測(cè)定RNA 的濃度,使用PrimeScriptTMqRT-PCR試劑盒從總RNA 合成第一鏈互補(bǔ)DNA,并使用SYBR Green PCR Master Mix 進(jìn)行qRT-PCR,以βactin 作為內(nèi)參,按2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析。

    1.3.3 細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)染后24 h 收集各組細(xì)胞,以2×104個(gè)密度接種到96 孔培養(yǎng)板中,各組細(xì)胞分別培養(yǎng)0 d、1 d、2 d 和3 d 后,加入10 μl 的CCK-8 溶液,在37℃下再孵育2 h,使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的吸光度值。

    1.3.4 細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)染后24 h 收集各組細(xì)胞,以2×105個(gè)密度接種到6 孔培養(yǎng)板中,以2×104個(gè)密度接種到96 孔培養(yǎng)板中,加入10 μl Annexin VFITC 和5μl 碘化丙啶染色液(0.25 mg/ml),輕輕混勻,室溫避光孵育20 min,用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

    1.3.5 雙熒光素酶將野生型ATB(ATB-WT)、突變型ATB(ATB-MUT)、野生型DNMT3B(DNMT3B-WT)或突變型DNMT3B (DNMT3B-MUT)克隆到pmirGLO 質(zhì)粒受體中,同時(shí)將miR-200c mimics 或miR-NC 導(dǎo)入293 細(xì)胞中,共培養(yǎng)48 h 后采用雙熒光素酶受體分析系統(tǒng)測(cè)量雙熒光素活性。

    1.3.6 Western blotting轉(zhuǎn)染后24 h 收集各組細(xì)胞,常規(guī)提取細(xì)胞總蛋白,BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度,使用10% SDS-PAGE 凝膠分離等量(50 μg)蛋白質(zhì)樣品,110 V 電泳,250 mA 電轉(zhuǎn)至PVDF 膜,5% 脫脂奶粉37℃封閉2 h。分別加入DNMT3B、CDK6、Caspase-3 和β-actin 一抗4℃孵育過(guò)夜,TBST 洗膜3 次,10 min/次,二抗37℃孵育1 h,TBST洗膜3次,30 min/次,ECL顯影。并使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,以β-actin 作為內(nèi)參,計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,比較用配對(duì)t檢驗(yàn)、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析,進(jìn)一步的兩兩比較用Dunnett-t檢驗(yàn),相關(guān)性分析用Spearman 法,P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 ATB 在瘢痕疙瘩組織和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的表達(dá)

    瘢痕疙瘩組與正常皮膚組ATB 相對(duì)表達(dá)量分別為(2.96±1.07)和(1.11±0.49),經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.561,P=0.000),瘢痕疙瘩組較正常皮膚組高。瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞細(xì)胞組與正常成纖維細(xì)胞組ATB 相對(duì)表達(dá)量分別為(2.37±0.26)和(1.07±0.12),經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.814,P=0.001),瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞細(xì)胞組較正常成纖維細(xì)胞組高。sh-NC 組與sh-ATB 組ATB 的相對(duì)表達(dá)量分別為(0.44±0.10)和(1.01±0.15),經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.476,P=0.005),sh-ATB 組 較sh-NC 組 高。o/e-NC 組與o/e-ATB 組ATB 的相對(duì)表達(dá)量分別為(1.01±0.06)和(1.97±0.21),經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.686,P=0.002),o/e-ATB 組較o/e-NC 組高。

    2.2 低表達(dá)ATB對(duì)成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖和凋亡的影響

    sh-ATB 組與sh-NC 組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的成纖維細(xì)胞OD450 值比較,經(jīng)重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析,結(jié)果:①不同時(shí)間點(diǎn)間的OD450 值比較有差異(F=180.102,P=0.000);②sh-ATB 組與sh-NC 組的OD450 值比較有差異(F=61.130,P=0.000),sh-ATB 組較sh-NC組低;③sh-ATB組與sh-NC組的OD450 值變化趨勢(shì)比較有差異(F=10.612,P=0.000)。同時(shí)sh-NC 組與sh-ATB 組CDK6 的相對(duì)表達(dá)量分別為(0.96±0.12)和(0.57±0.08),經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.678,P=0.010),sh-ATB 組較sh-NC 組低(見(jiàn)圖1)。進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,sh-NC 組與sh-ATB 組細(xì)胞的凋亡率分別為(6.97±1.43)%和(14.00±1.37)%,經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.142,P=0.004),sh-ATB組較sh-NC 組高(見(jiàn)圖2)。sh-NC 組與sh-ATB 組Caspase-3 的相對(duì)表達(dá)量分別為(0.99±0.12) 和(1.74±0.10),經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.839,P=0.004),sh-ATB組較sh-NC組高(見(jiàn)圖3)。見(jiàn)表1。

    圖1 sh-NC組與sh-ATB組CDK6相對(duì)表達(dá)量比較

    圖2 低表達(dá)ATB對(duì)成纖維細(xì)胞凋亡的影響

    圖3 低表達(dá)ATB對(duì)凋亡相關(guān)分子Caspase-3表達(dá)的影響

    表1 sh-ATB組與sh-NC組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的成纖維細(xì)胞OD450值比較 (x±s)

    2.3 ATB靶向結(jié)合miR-200c

    miR-NC 組ATB-WT 和ATB-MUT 雙熒光素酶活性分別為(1.15±0.08) 和(1.07±0.09),miR-200c mimics 組分別為(0.47±0.04) 和(1.10±0.04)。兩組ATB-WT 雙熒光素酶活性比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.083,P=0.000),兩組ATB-MUT雙熒光素酶活性比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.469,P=0.664)。o/e-ATB 組miR-200c 相對(duì)表達(dá)量為(0.45±0.06),o/e-NC 組為(1.02±0.12),經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.190,P=0.002),o/e-ATB 組低于o/e-NC 組。sh-NC 組與sh-ATB 組miR-200c 相對(duì)表達(dá)量分別為(0.97±0.12) 和(1.47±0.12),經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.977,P=0.008),sh-ATB 組高于sh-NC 組。瘢痕疙瘩組與正常皮膚組miR-200c 相對(duì)表達(dá)量分別為(0.66±0.20)和(1.17±0.39),經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.461,P=0.000),瘢痕疙瘩組低于正常皮膚組。經(jīng)Spearman 相關(guān)分析,ATB 與miR-200c 在瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(rs=-3.429,P=0.000)(見(jiàn)圖4)。miR-NC 組miR-200c 相對(duì)表達(dá)量為(1.01±0.13),miR-200c mimics 組相對(duì)表達(dá) 量為(1.54±0.10), miR-200c inhibitors 組為(0.45±0.08),經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=76.010,P=0.000),成纖維細(xì)胞細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-200c mimics 后能夠促進(jìn)miR-200c 的表達(dá),轉(zhuǎn)染miR-200c inhibitors 后能夠抑制miR-200c 的表達(dá)。

    圖4 ATB與miR-200c在瘢痕疙瘩組織中表達(dá)的相關(guān)性

    2.4 過(guò)表達(dá)miR-200c 對(duì)成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖和凋亡的影響

    miR-200c mimics 組和miR-NC 組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的成纖維細(xì)胞OD450 值比較,經(jīng)重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析顯示:①不同時(shí)間點(diǎn)間的OD450 值比較有差異(F=331.764,P=0.000);②兩組的OD450值比較有差異(F=155.169,P=0.000),miR-200c mimics 組較miR-NC 組低;③兩組的OD450 值變化趨勢(shì)比較有差異(F=17.397,P=0.000)。miR-NC組與miR-200c mimics 組CDK6 的相對(duì)表達(dá)量分別為(1.00±0.16)和(0.45±0.07),經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.529,P=0.005),miR-200c mimics組較miR-NC 組低(見(jiàn)圖5)。miR-NC 組與miR-200c mimics 組細(xì)胞凋亡率分別為(7.40±0.28)%和(16.53±1.14)%,經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.252,P=0.001)(見(jiàn)圖6),miR-200c mimics 組較miR-NC 組高。miR-NC 組 與miR-200c mimics 組Caspase-3 的相對(duì)表達(dá)量分別為(1.02±0.22) 和(1.63±0.09),經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.467,P=0.011)(見(jiàn)圖7),miR-200c mimics 組較miR-NC 組高。見(jiàn)表2。

    圖5 過(guò)表達(dá)miR-200c對(duì)增殖相關(guān)分子CDK6表達(dá)的影響

    圖6 過(guò)表達(dá)miR-200c對(duì)成纖維細(xì)胞凋亡的影響

    圖7 過(guò)表達(dá)miR-200c對(duì)凋亡相關(guān)分子Caspase-3表達(dá)的影響

    表2 miR-200c mimics組和miR-NC組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的成纖維細(xì)胞OD450值比較 (±s)

    表2 miR-200c mimics組和miR-NC組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的成纖維細(xì)胞OD450值比較 (±s)

    組別0 d 1 d 2 d 3 d miR-NC組miR-200c mimics組0.56±0.03 0.56±0.01 1.16±0.07 0.65±0.10 1.71±0.10 1.15±0.12 2.22±0.17 1.64±0.14

    2.5 miR-200c能夠靶向結(jié)合DNMT3B

    miR-200c mimics 組DNMT3B-WT 和DNMT3BMUT 熒光素酶活性分別為(0.58±0.04) 和(0.97±0.08),miR-NC 組分別為(0.98±0.07) 和(1.04±0.07)。兩組DNMT3B-WT 熒光素酶活性比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.094,P=0.001),轉(zhuǎn)染miR-200c mimics 后雙熒光素活性下降。兩組DNMT3B-MUT 熒光素酶活性比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.090,P=0.337)。miR-NC 組與miR-200c mimics 組DNMT3B 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(1.02±0.05)和(0.51±0.04),經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.796,P=0.000),miR-200c mimics 組較miR-NC 組低(見(jiàn)圖8)。miR-NC 組 與miR-200c inhibitors 組DNMT3B 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(1.04±0.07)和(1.47±0.11),經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.712,P=0.005),miR-200c inhibitors 組 較miRNC 組高。瘢痕疙瘩組與正常皮膚組DNMT3B 相對(duì)表達(dá)量分別為(2.28±0.70)和(1.03±0.30),經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.025,P=0.000),瘢痕疙瘩組較正常皮膚組高。經(jīng)Spearman 分析,miR-200c與DNMT3B 在瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(rs=-2.011,P=0.001)(見(jiàn)圖9),ATB 與DNMT3B 在瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)水平呈正相關(guān)(rs=0.829,P=0.002)(見(jiàn)圖10)。

    圖8 瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染染miR-NC、miR-200c mimics和miR-200c inhibitors后DNMT3B的表達(dá)水平

    圖9 miR-200c與DNMT3B在瘢痕疙瘩組織中表達(dá)的相關(guān)性

    圖10 ATB與DNMT3B在瘢痕疙瘩組織中表達(dá)的相關(guān)性

    2.6 ATB 調(diào)控miR-200c/DNMT3B 通路參與成纖維細(xì)胞細(xì)胞的增殖和凋亡

    共轉(zhuǎn)染sh-ATB+miR-200c inhibitors 組與sh-NC組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的成纖維細(xì)胞OD450 值比較,經(jīng)重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析,結(jié)果:①不同時(shí)間點(diǎn)間的OD450 值比較有差異(F=192.560,P=0.000);②兩組OD450 值比較無(wú)差異(F=4.339,P=0.054);③兩組OD450 值變化趨勢(shì)比較無(wú)差異(F=1.024,P=0.409)。共轉(zhuǎn)染sh-ATB+miR-200c inhibitors 組與sh-ATB 組成纖維細(xì)胞OD450 值比較,經(jīng)重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析,結(jié)果:①不同時(shí)間點(diǎn)間的OD450 值比較有差異(F=138.352,P=0.000);②兩組OD450值比較有差異(F=27.567,P=0.000);③兩組OD450 值變化趨勢(shì)比較有差異(F=4.235,P=0.022)。sh-NC 組與共轉(zhuǎn)染sh-ATB+miR-200c inhibitors 組細(xì)胞凋亡率分別為(6.97±1.43)%和(7.60±1.35)%,經(jīng)t檢驗(yàn),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.559,P=0.606)。見(jiàn)表3。

    共轉(zhuǎn)染o/e-ATB+miR-200c inhibitors 組與o/e-ATB 組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的成纖維細(xì)胞OD450 值比較,經(jīng)重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析,結(jié)果:①不同時(shí)間點(diǎn)間的OD450 值比較有差異(F=271.965,P=0.000);②兩組OD450 值比較有差異(F=42.868,P=0.000);③兩組OD450 值變化趨勢(shì)比較有差異(F=7.459,P=0.002)。共轉(zhuǎn)染o/e-ATB 和miR-200c inhibitors 組和o/e-ATB 組細(xì)胞凋亡率分別為(2.37±0.85)%和(4.35±0.60)%,經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.302,P=0.030),o/e-ATB 組較共轉(zhuǎn)染o/e-ATB+miR-200c inhibitors組高。見(jiàn)表4。

    共轉(zhuǎn)染miR-200c inhibitors+sh-DNMT3B 組與miR-NC 組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的成纖維細(xì)胞OD450值比較,經(jīng)重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析,結(jié)果:①不同時(shí)間點(diǎn)間的OD450 值比較有差異(F=177.080,P=0.000);②兩組OD450 值比較無(wú)差異(F=0.002,P=0.964);③兩組OD450 值變化趨勢(shì)比較無(wú)差異(F=2.661,P=0.083)。共轉(zhuǎn)染miR-200c inhibitors+sh-DNMT3B 組與miR-200c inhibitors 組成纖維細(xì)胞OD450 值比較,經(jīng)重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析,結(jié)果:①不同時(shí)間點(diǎn)間的OD450 值比較有差異(F=171.475,P=0.000);②兩組OD450 值比較有差異(F=45.448,P=0.000);③兩組OD450 值變化趨勢(shì)比較有差異(F=6.883,P=0.003)。miR-NC 組與共轉(zhuǎn)染miR-200c inhibitors+sh-DNMT3B 組細(xì)胞凋亡率分別為(7.40±1.28)%和(6.63±0.91)%,經(jīng)t檢驗(yàn),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.848,P=0.444)。見(jiàn)表5。

    共轉(zhuǎn)染miR-200c mimics+sh-DNMT3B 組與miR-200c mimics 組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的成纖維細(xì)胞OD450 值比較,經(jīng)重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析,結(jié)果:①不同時(shí)間點(diǎn)間的OD450 值比較有差異(F=83.287,P=0.000);②兩組OD450 值比較有差異(F=14.702,P=0.002);③兩組OD450 值變化趨勢(shì)比較有差異(F=5.401,P=0.009)。共轉(zhuǎn)染miR-200c mimics+sh-DNMT3B 組 與miR-200c mimics 組 細(xì)胞 凋 亡 率分別為(21.17±1.41)% 和(16.53±1.14)%,經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.440,P=0.011),共轉(zhuǎn)染miR-200c mimics+sh-DNMT3B 組較miR-200c mimics 組高。這提示ATB 能夠通過(guò)調(diào)控miR-200c/DNMT3B 通路參與成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡。見(jiàn)表6。

    表3 共轉(zhuǎn)染sh-ATB和miR-200c inhibitors對(duì)成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響 (±s)

    表3 共轉(zhuǎn)染sh-ATB和miR-200c inhibitors對(duì)成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響 (±s)

    組別0 d 1 d 2 d 3 d sh-NC組sh-ATB組共轉(zhuǎn)染sh-ATB+miR-200c inhibitors組0.57±0.05 0.57±0.02 0.59±0.03 0.93±0.15 0.73±0.13 0.88±0.06 1.63±0.13 1.15±0.15 1.45±0.13 2.06±0.17 1.48±0.13 1.90±0.09

    表4 共轉(zhuǎn)染o/e-ATB和miR-200c inhibitors對(duì)成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響 (±s)

    表4 共轉(zhuǎn)染o/e-ATB和miR-200c inhibitors對(duì)成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響 (±s)

    組別0 d 1 d 2 d 3 d o/e-NC組o/e-ATB組共轉(zhuǎn)染o/e-ATB+miR-200c inhibitors組0.58±0.04 0.56±0.03 0.57±0.03 0.98±0.18 1.29±0.19 1.65±0.16 1.58±0.10 2.06±0.17 2.45±0.16 1.97±0.10 2.44±0.17 3.25±0.16

    表5 共轉(zhuǎn)染miR-200c inhibitors和sh-DNMT3B對(duì)成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響 (±s)

    表5 共轉(zhuǎn)染miR-200c inhibitors和sh-DNMT3B對(duì)成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響 (±s)

    組別0 d 1 d 2 d 3 d miR-NC組miR-200c inhibitors組共轉(zhuǎn)染miR-200c inhibitors+sh-DNMT3B組0.56±0.03 0.58±0.01 0.57±0.02 1.11±0.14 1.62±0.14 1.20±0.14 1.71±0.10 2.31±0.17 1.46±0.13 2.22±0.17 2.87±0.27 2.38±0.22

    表6 共轉(zhuǎn)染miR-200c mimics和sh-DNMT3B對(duì)成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響 (±s)

    表6 共轉(zhuǎn)染miR-200c mimics和sh-DNMT3B對(duì)成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響 (±s)

    組別0 d 1 d 2 d 3 d miR-NC組miR-200c mimics組共轉(zhuǎn)染miR-200c mimics+sh-DNMT3B組0.57±0.03 0.56±0.01 0.57±0.02 1.16±0.07 0.65±0.10 0.64±0.13 1.71±0.10 1.15±0.13 0.89±0.09 2.22±0.17 1.64±0.14 1.23±0.14

    3 討論

    在瘢痕疙瘩的研究中,越來(lái)越多的研究開(kāi)始轉(zhuǎn)向LncRNAs 和miRNAs 對(duì)瘢痕疙瘩的調(diào)控作用[8]。目前采用基因芯片證實(shí)在瘢痕疙瘩存在大量異常表達(dá)的LncRNAs 和miRNAs,其中有研究顯示在瘢痕疙瘩中有1 731 種lncRNAs 表達(dá)上調(diào),782 種lncRNAs 表達(dá)下調(diào)[9]。LncRNAs 能夠通過(guò)多種途徑參與疾病的調(diào)控,其中最常見(jiàn)的是ceRNA 機(jī)制,即LncRNAs 靶向結(jié)合miRNAs,進(jìn)而調(diào)控下游分子的表達(dá)。miRNAs 是一類(lèi)非編碼的小RNA,長(zhǎng)度只有20~24 nt,在生物體基因組中普遍存在。目前研究證實(shí)miRNAs 只占所有RNA 的1.0%左右,但能夠調(diào)控機(jī)體30%~50%基因表達(dá)[10]。miRNAs 通過(guò)靶向調(diào)控靶mRNA,參與細(xì)胞增殖、分化、侵襲、遷移和凋亡等多種細(xì)胞生物學(xué)行為。隨著對(duì)miRNAs 研究的深入,越來(lái)越多的證據(jù)表明miRNAs參與瘢痕疙瘩的形成[11]。然而關(guān)于LncRNAs 調(diào)控miRNAs 在瘢痕疙瘩中的研究尚少。

    在本研究中采用qRT-PCR 檢測(cè)瘢痕疙瘩組織和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中ATB 相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果顯示ATB 在瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)水平明顯高于正常皮膚,同時(shí)在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞細(xì)胞中ATB的表達(dá)水平明顯高于正常成纖維細(xì)胞。這提示ATB在瘢痕疙瘩中存在明顯異常表達(dá)。在進(jìn)一步的研究中采用shRNA 干擾技術(shù)在成纖維細(xì)胞中低表達(dá)ATB,結(jié)果顯示低表達(dá)ATB 能夠明顯抑制細(xì)胞增殖,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,同時(shí)下調(diào)增殖相關(guān)分子CDK6,上調(diào)凋亡相關(guān)分子Caspase-3 的表達(dá)水平。這提示ATB 參與瘢痕疙瘩的形成。然而其作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

    有研究顯示miR-152-3p、miR-21、miR-200c和miR-203 在瘢痕疙瘩中均存在異常表達(dá),并參與瘢痕疙瘩的形成[12-14]。同時(shí)研究顯示LncRNA HOXA11-AS 能夠靶向結(jié)合miR-124-3p 而抑制Smad5 的表達(dá),參與瘢痕疙瘩細(xì)胞外基質(zhì)的形成[15]。最近有研究顯示,ATB 能夠通過(guò)調(diào)控miR-200c 參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展[16]。在本研究中,雙熒光素酶結(jié)果顯示ATB 能夠靶向結(jié)合miR-200c,同時(shí)在成纖維細(xì)胞細(xì)胞中轉(zhuǎn)染o/e-ATB 后能夠明顯抑制miR-200c 的表達(dá)水平,在轉(zhuǎn)染sh-ATB 后能夠明顯促進(jìn)miR-200c 的表達(dá)水平,這說(shuō)明在成纖維細(xì)胞中ATB 能夠靶向抑制miR-200c。在進(jìn)一步的人體瘢痕疙瘩組織中也正證實(shí)ATB 與miR-200c 的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。

    為證實(shí)miR-200c 在成纖維細(xì)胞中發(fā)揮的作用,采用miR-200c mimics 過(guò)表達(dá)miR-200c 后能夠明顯抑制細(xì)胞增殖,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,同時(shí)下調(diào)增殖相關(guān)分子CDK6 和上調(diào)凋亡相關(guān)分子Caspase-3 的表達(dá)水平。這一結(jié)果與低表達(dá)ATB 對(duì)成纖維細(xì)胞的作用相似,更進(jìn)一步提示ATB 能夠靶向結(jié)合miR-200c 而抑制miR-200c 的表達(dá)水平。

    DNA 甲基化是表觀遺傳學(xué)中一種重要的修飾方式,主要是通過(guò)DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase, DNMT)來(lái)催化和維持起作用[17]。DNMT家族成員在生命的各種活動(dòng)中均發(fā)揮重要作用,包括DNMT1、DNMT2、DNMT3A 和DNMT3B,后兩者主要在哺乳動(dòng)物中發(fā)揮作用[18]。DNMT3B 是從頭DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶,可以不需要甲基化的DNA 作模板,即可完成非甲基化的DNA 的甲基化修飾,研究顯示DNMT3B 參與了腫瘤、血管性疾病和免疫性疾病等[19]。同時(shí)也有研究顯示DNMT3B 在瘢痕組織中的表達(dá)水平明顯升高[20]。在本研究中雙熒光素酶結(jié)果顯示miR-200c 能夠靶向結(jié)合DNMT3B,同時(shí)在成纖維細(xì)胞細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-200c mimics 后能夠明顯抑制DNMT3B 蛋白的表達(dá)水平,在轉(zhuǎn)染miR-200c inhibitors 后能夠明顯促進(jìn)DNMT3B 蛋白的表達(dá)。 這進(jìn)一步提示miR-200c 能夠靶向結(jié)合DNMT3B,進(jìn)而抑制DNMT3B 的表達(dá)。同時(shí)miR-200c 與DNMT3B 在瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān),ATB 與DNMT3B 在瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)水平呈正相關(guān),這提示ATB 可能通過(guò)靶向抑制miR-200c,進(jìn)而促進(jìn)DNMT3B 的表達(dá),最后參與成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖和凋亡。

    在進(jìn)一步的回復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)中,已證實(shí)lncRNAATB/miR-200c/DNMT3B 軸在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的作用。結(jié)果顯示在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染sh-ATB 和miR-200c inhibitors 能夠逆轉(zhuǎn)單獨(dú)轉(zhuǎn)染sh-ATB 對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響,共轉(zhuǎn)染o/e-ATB和miR-200c inhibitors 能夠進(jìn)一步加強(qiáng)單獨(dú)轉(zhuǎn)染o/e-ATB 對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響;瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-200c inhibitors 和sh-DNMT3B 能夠逆轉(zhuǎn)單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-200c inhibitors 對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響,共轉(zhuǎn)染miR-200c mimics 和sh-DNMT3B能夠進(jìn)一步加強(qiáng)單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-200c mimics 對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響。這進(jìn)一步證實(shí)ATB 能夠通過(guò)調(diào)控miR-200c/ DNMT3B 通路參與成纖維細(xì)胞增殖和凋亡。

    綜上所述,ATB 在瘢痕疙瘩組織中高表達(dá),低表達(dá)ATB 能夠通過(guò)調(diào)控miR-200c/DNMT3B 通路,抑制成纖維細(xì)胞增殖,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。lncRNAATB/miR-200c/DNMT3B 軸在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡中發(fā)揮著重要作用。ATB 可能成為瘢痕疙瘩治療的新靶點(diǎn)。

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