腦白質(zhì)疏松癥患者Claudin基因的多態(tài)性調(diào)查與認(rèn)知功能的關(guān)系

陳艷 馬飛鳳 何瑩超，3 劉德山，3 鄭崢，3*

腦白質(zhì)疏松癥（1eukoaraiosis，LA）又被稱之為腦白質(zhì)損害或者是腦白質(zhì)高信號，為目前已知的腦小血管病的常見類型［1］。該病癥發(fā)病率與年齡的增長呈正相關(guān)性，絕大多數(shù)患者起病早期無任何癥狀表現(xiàn)，隨著病程時間的延長將會導(dǎo)致腦功能損傷，增加認(rèn)知與精神障礙、腦血管疾病、帕金森病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生風(fēng)險［2］。隨著人口老齡化問題的日趨顯著，LA 成為全球醫(yī)學(xué)界面臨的一個公共衛(wèi)生問題，故探討其發(fā)病機(jī)制并尋求行之有效的防控對策迫在眉睫［3］。血腦屏障破壞被認(rèn)為是LA 發(fā)生的早期環(huán)節(jié)，而Claudin基因在維持腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能及其間的緊密連接結(jié)構(gòu)中扮演著重要的角色［4］。國外研究表明，Claudin?1基因的rs9290927基因型與韓國人群腦白質(zhì)疏松癥有關(guān)［5］。然而，中國LA患者Claudin基因多態(tài)性以及與認(rèn)知功能的關(guān)系尚未有研究涉及，故本研究以此為目的展開分析。

1 臨床資料

1.1 一般資料選取我院2019 年1 月-2020 年1 月收治的100例LA患者為LA組，50名健康體檢者為對照組。LA組中男58 例、女42 例；年齡：62 歲-78 歲，平均年齡（66.89±1.41）歲；病程時間：6個月-2.5年，平均病程時間（1.35±0.20）年；改良Fazekas分級：2級35例、3級50例、4級15例；基礎(chǔ)疾?。焊哐獕?5例、糖尿病28例、高脂血癥25例、高同型半胱氨酸血癥12 例；吸煙史：有吸煙史63例、無吸煙史37例；飲酒史：有飲酒史55例、無飲酒史45例。對照組中男30名、女20名；年齡：60歲-76歲，平均年齡（66.82±1.53）歲；吸煙史：有吸煙史32 例、無吸煙史18 例；飲酒史：有飲酒史30 例、無飲酒史20例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥60 歲；（2）神經(jīng)系統(tǒng)檢查無明確神經(jīng)系統(tǒng)陽性體征；（3）受試者如實知曉本研究方案內(nèi)容并自愿參與。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并心腦血管疾病或者是心力衰竭/呼吸衰竭；（2）既往有神經(jīng)系統(tǒng)器質(zhì)性疾病病史；（3）其他疾病所致的腦部脫髓鞘改變；（4）研究開始前6 個月服用過影響認(rèn)知功能的藥物；（5）磁共振檢查提示皮質(zhì)萎縮。兩組受試者性別、年齡、吸煙史、飲酒史間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），有可比性。本研究已經(jīng)通過醫(yī)學(xué)倫理委員會審核。

1.2 方法采集所有受試者空腹靜脈血3 ml，以2500 轉(zhuǎn)/min 離心15min 后分離血漿。利用低滲法分離血漿中的白細(xì)胞，采用飽和酚?氯仿提取DNA。將提取的DNA 置于1.5 ml 的Eppendoff 管中并利用TE 溶液溶解，70%乙醇反復(fù)漂洗2 次后置于4℃冰箱中保存。利用DNAstart 軟件設(shè)計目標(biāo)基因CLDN 的SNP（CLDN1 的rs17501010、rs893051 和rs9290927）多態(tài)位點(diǎn)附近的DNA 片段擴(kuò)增引物，尋找合適的限制性內(nèi)切酶并利用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增目的DNA，具體如下：采用生工生物工程（上海）股份有限公司制備的Taq?man 探針對目標(biāo)基因進(jìn)行分型，將探針分別于3'，5'端標(biāo)記熒光基團(tuán)及淬滅熒光基團(tuán)，擴(kuò)增時探針退火并對探針上的熒光分子進(jìn)行切割，經(jīng)酶切后跑瓊脂糖凝膠電泳檢測限制性片段長度多態(tài)性以確定單體基因型，如個別基因多態(tài)位點(diǎn)無法尋找到合適的限制性內(nèi)切酶，則將PCR 產(chǎn)物純化直接進(jìn)行基因測序分析（由上海生工完成），應(yīng)用Chromas 軟件讀取基因測序圖譜以確定基因型。

1.3 觀察指標(biāo)選取認(rèn)知功能評分、Claudin?1 SNP 位點(diǎn)rs17501010、rs893051、rs9290927 基因型及等位基因頻率為觀察指標(biāo)。認(rèn)知功能評分包括MMSE 評分、MoCA 評分，其中MMSE 評分利用簡易精神狀態(tài)量表（mini?mental state ex?amination，MMSE）［6］評定，總分30 分，≥27 分為正常，MoCA評分利用蒙特利爾認(rèn)知評估量表（montreal cognitive assess?ment，MoCA）［7］評定，總分30 分，≥26 分為正常。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計量資料采用（）表示，計數(shù)資料采用率（%）表示，比較以χ2檢驗。采用多元非條件Logistic 回歸分析模型檢驗Claudin 基因多態(tài)性與認(rèn)知功能的關(guān)系，以O(shè)R 及其95%CI 表示，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組認(rèn)知功能評分比較見表1。

表1 兩組認(rèn)知功能評分比較（±s，分）

表1 兩組認(rèn)知功能評分比較（±s，分）

注：與對照組相比較，*P<0.05。

組別對照組LA 組n 50 100 MMSE 評分28.25±1.05 25.55±1.35*MoCA 評分27.33±1.01 25.10±1.35*

2.2 Claudin 基因多態(tài)性與LA 患者認(rèn)知功能障礙的相關(guān)性見表2。

表2 Claudin 基因多態(tài)性與LA 患者認(rèn)知功能障礙的相關(guān)性

3 討 論

LA 為神經(jīng)傳導(dǎo)纖維誘導(dǎo)的彌漫性腦缺血，X 線計算機(jī)斷層攝影表現(xiàn)為腦室周圍低密度影，磁共振成像則表現(xiàn)為T2 加權(quán)像高信號影［8］。研究表明，LA 會導(dǎo)致患者出現(xiàn)認(rèn)知功能減退，故被認(rèn)為是腦認(rèn)知功能損害的早期標(biāo)志之一［9］。隨著臨床研究的不斷深入，相當(dāng)數(shù)量的LA 患者存在認(rèn)知與行為障礙，如表情淡漠，記憶力、判斷力和反應(yīng)能力下降，語言功能障礙、視覺功能障礙等［10］。誘發(fā)LA 的機(jī)制多樣，包括慢性缺血/低灌注學(xué)說、血腦屏障破壞學(xué)說、內(nèi)皮功能障礙學(xué)說、炎癥反應(yīng)學(xué)說、遺傳學(xué)說、靜脈異常學(xué)說等［11］。基因遺傳學(xué)研究為國內(nèi)外研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，特別是LA 具有高度可遺傳性，發(fā)生幾率高達(dá)55%-80%，其遺傳機(jī)制可能與染色體基因組遺傳變異有關(guān)，包括單核苷酸多態(tài)性、拷貝數(shù)變異，非正常的基因表達(dá)等。Claudin 基因為構(gòu)成腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接的重要蛋白家族，在維持其結(jié)構(gòu)完整性及功能方面發(fā)揮了重要的作用［12］。有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Claudin?1缺失與腦卒中的發(fā)生密切相關(guān)［13］。由此使得Claudin基因成為LA基因遺傳學(xué)研究的候選基因之一。

本研究發(fā)現(xiàn)LA 組認(rèn)知功能評分（MMSE 評分、MoCA評分）均小于對照組，表明LA 患者普遍存在著認(rèn)知功能減退，此點(diǎn)與已有研究結(jié)論相吻合。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Clau?din?1 SNP 位點(diǎn)rs17501010、rs893051、rs9290927 與LA 認(rèn)知功能障礙在加性模型、顯性模型、隱性模型中均存在關(guān)聯(lián)性，提示LA 患者Claudin 具有基因多態(tài)性特點(diǎn)，但不同基因型發(fā)揮的作用不盡相同，其中各個位點(diǎn)的GG基因型容易發(fā)生認(rèn)知功能障礙，而GC、CC 基因型卻并不會對認(rèn)知功能造成影響。出現(xiàn)此種差異的原因可能與不同基因型所具有的“催化”或“喚醒”功能差異有關(guān)，GG 基因具有催化限制性內(nèi)切酶的作用，由此使得DNA 的復(fù)制容易突破個體的控制而出現(xiàn)異常表達(dá)，而GC、CC 或許扮演的角色與GG 基因相反，即抑制限制性內(nèi)切酶活性，維持特定基因的正常表達(dá)。但是，需要指出的是，本研究中LA 患者均存在基礎(chǔ)疾病，提示Claudin 基因可能只有在特定的環(huán)境中才會發(fā)揮出相應(yīng)的作用，如合并基礎(chǔ)性疾病、受到外界刺激等。因此，關(guān)于Claudin 基因多態(tài)性及與LA 的關(guān)系尚有待于今后更為深入的研究。綜上所述，LA患者Claudin基因具有基因多態(tài)性特點(diǎn)且參與到了認(rèn)知功能障礙的發(fā)生進(jìn)程之中。