溶瘤病毒抗腫瘤治療的臨床應用進展

王磊 霍彬 霍小東 綜述 王海濤 審校

溶瘤病毒（oncolytic virus，OVs）是一種新型腫瘤免疫療法，通過不同的調(diào)控機制在腫瘤細胞內(nèi)復制、裂解腫瘤細胞，而不影響正常細胞生長[1]。目前，OVs可分為腺病毒（adenovirus，AD）、痘病毒、皰疹病毒、呼腸孤病毒和柯薩奇病毒等[2]；給藥方法有瘤內(nèi)注射、靜脈輸送、胸腹腔和膀胱內(nèi)注射、細胞載體四種[3]。OVs技術(shù)代次：第一代，僅具有腫瘤特異性，如H101、Reolysin和Telomelysin；第二代，具有腫瘤特異性，含有1個功能性外源基因的表達，如T-VEC、JX-594和H102；第三代，具有腫瘤特異性、免疫調(diào)節(jié)與免疫治療功能，多于1個功能性外源基因的表達，外源基因功能相互協(xié)調(diào)，如GO701和GV802。

1 OVs抗腫瘤治療現(xiàn)狀

近年來，隨著醫(yī)療水平的提升及技術(shù)的成熟，OVs越來越頻繁地應用于抗腫瘤治療，為廣大惡性腫瘤患者帶來希望?？鼓[瘤療法中，目前最常用的2種OVs是重組人5型腺病毒（安柯瑞，H101）與T-V EC（talimogene laherparepvec）。H101是一種經(jīng)基因改造的溶瘤腺病毒，于2005年被中國 國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準用于聯(lián)合化療治療鼻咽癌，是世界上最早的一款OV。T-VEC是第二代單純皰疹病毒Ⅰ型，于2015年被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準用于治療不能手術(shù)的黑色素瘤，隨后于2016年在歐洲獲得批準[1]。OVs療法的腫瘤特異性通常依賴于在癌細胞中有缺陷的IFN反應；而過度刺激IFN，可使OVs被免疫系統(tǒng)更快地清除，限制了直接的溶瘤[4]。Meta分析[5]表明，與傳統(tǒng)療法相比，OVs聯(lián)合療法具有較高的客觀緩解率（objective response rate，ORR）。在2017年所有臨床試驗中，有78項是OVs用于多種惡性實體瘤中的干預試驗，這表明OVs具有較好的抗腫瘤研究前景[2]。

2 OVs抗腫瘤作用機制

OVs感染腫瘤細胞后，突破細胞防御機制，復制、繁殖、裂解腫瘤細胞，釋放大量子代病毒攻擊鄰近腫瘤細胞，再次復制、裂解細胞。若腫瘤細胞全部裂解，病毒因自身缺陷無法復制，被免疫系統(tǒng)清除。

OVs破壞腫瘤細胞的機制：1）直接裂解腫瘤細胞。OV在腫瘤細胞內(nèi)增殖，抑制腫瘤細胞。釋放的子代病毒感染鄰近的腫瘤細胞；2）病毒蛋白的直接細胞毒性作用，如AD E3區(qū)編碼的ADP；3）抗腫瘤免疫反應。在非特異免疫方面，病毒增強腫瘤細胞對多種細胞因子的敏感性。在特異性免疫方面，病毒感染腫瘤細胞后誘發(fā)的免疫，可防止腫瘤復發(fā)；4）增強腫瘤細胞對放療和化療的敏感性；5）轉(zhuǎn)基因表達。將外源性基因插入到病毒基因組中，將重組病毒感染腫瘤細胞并表達所插入的治療基因，發(fā)揮抗腫瘤作用。另外，將某些藥物前體轉(zhuǎn)化酶基因插入到AD基因組以殺傷腫瘤細胞。

2.1 OVs在腫瘤細胞內(nèi)的選擇性復制

OVs選擇性復制的機制[3,6]：1）利用腫瘤細胞表面特異性受體與病毒表面蛋白，通過受體-配體途徑特異性結(jié)合，實現(xiàn)病毒對細胞的靶向感染；2）將基因轉(zhuǎn)錄過程置于組織或腫瘤特異性啟動子的控制下，實現(xiàn)選擇性復制；3）免疫反應缺陷的腫瘤細胞易受到病毒感染；4）病毒抑制宿主細胞凋亡。

2.2 OVs抗腫瘤免疫反應

OVs感染腫瘤細胞后，引起局部抗病毒炎癥，使機體產(chǎn)生免疫[2]。由于多數(shù)腫瘤處于免疫抑制性腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中，抗原遞呈細胞（antigen presenting cells，APCs）功能被破壞，無法遞呈腫瘤相關(guān)抗原，腫瘤固有的β-catenin致癌信號通路抑制APCs在腫瘤部位的募集[7]。病毒感染后，IFN、Toll樣受體激動劑、危險相關(guān)分子模式（dangerassociated molecular patterns，DAMP）和病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）因子的局部釋放有助于逆轉(zhuǎn)抑制性TME，將腫瘤置于促進抗腫瘤免疫反應的環(huán)境。DAMP和PAMP通過結(jié)合識別受體（Toll-like receptors，TLR），促進先天性免疫反應。此外，OV感染APCs，促進其成熟，腫瘤細胞裂解后釋放腫瘤相關(guān)抗原，誘導抗腫瘤CD8+T細胞免疫反應。

基因修飾的OV更易改善抗原提呈，促進T淋巴細胞的激活。T-VEC是一種基因修飾的Ⅰ型HSV（her pes simplex virus 1，HSV-1），是第一種對黑色素瘤顯示臨床療效的OV。在HSV-1的連續(xù)傳代過程中，分離1個帶有易位US11基因的突變體，導致ICP47缺失[8]。ICP47結(jié)合抗原加工和呈遞相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白，限制抗原呈遞，防止抗原加載到MHC-1分子中。而在T-VEC中，刪除ICP47，增強抗原呈遞，維持感染的腫瘤細胞表面MHC-1抗原的表達[8-9]。為了提高TVEC的免疫原性，將人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）基因插入到缺失ICP34.5基因組位置[9]。GM-CSF是一種調(diào)節(jié)性細胞因子，促進炎癥部位樹突狀細胞（dendritic cell，DC）的蓄積，引發(fā)T細胞反應。在鼠類腫瘤研究中，含有ICP34.5和ICP47缺失的JS-1病毒使注射部位的腫瘤消退，但不能使對側(cè)腫瘤消退。將GM-CSF納入病毒設(shè)計后，總體存活率顯著提高[1,8-9]。ICP34.5的缺失、USL11的早期表達、ICP47的缺失以及局部GM-CSF的表達有助于改善宿主抗腫瘤免疫。

OVs感染的腫瘤細胞具有高度免疫原性。腫瘤細胞裂解后釋放腫瘤相關(guān)抗原、細胞因子和趨化因子，誘導全身腫瘤特異性免疫反應，消除局部及遠隔部位未感染的癌細胞。插入編碼細胞因子的基因，如GMCSF、Fms樣酪氨酸激酶3配體（FLT3L）或趨化因子（CCL3、CCL5）增強OV誘導的腫瘤特異性免疫反應。與GM-CSF相似，F(xiàn)LT3L是一種體內(nèi)募集和擴增DC的生長因子，表達FLT3L的OV觸發(fā)DC和T細胞向局部腫瘤浸潤，增強抗腫瘤和抗病毒免疫反應[10]。另一方面，基因改造后的OVs表達炎性趨化因子，如CCL5、CCL3和CCL19，增加腫瘤浸潤免疫細胞數(shù)量，改善體內(nèi)治療效果，增加腫瘤內(nèi)OVs作用的持久性。

部分OVs單獨治療時，雖然在注射性皮膚病變和非注射性皮膚病變中療效較好；但是，在遠處內(nèi)臟病變中的緩解情況仍然較差。因此，亟需尋找更優(yōu)的聯(lián)合療法。

3 OVs聯(lián)合治療策略

OVs是一種多功能抗癌藥，選擇性感染、復制并殺死腫瘤細胞，該過程取決于表面受體、腫瘤細胞對病毒復制的允許性。OVs在多個臨床試驗中顯示出不同的治療效果，但很少長期誘導體內(nèi)腫瘤的完全消退。而且，異質(zhì)性腫瘤的選擇性壓力導致對OV的抗性。為了克服這些不足，臨床上建立起許多新穎OV聯(lián)合療法，增強對腫瘤的殺傷力。

3.1 OVs聯(lián)合化療或靶向治療

化療直接殺死惡性細胞，增強腫瘤細胞免疫原性，增強OVs的細胞毒性；OVs聯(lián)合化療具有協(xié)同作用，促進抗腫瘤免疫反應[11]。OVs聯(lián)合化療的機制包括：1）逃避抗病毒免疫反應，增強病毒溶瘤作用，改善HSV、AD、麻疹病毒和呼腸孤病毒抗腫瘤功效；2）抵抗免疫抑制腫瘤微環(huán)境。TME主要組成部分是調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory cells，Treg）和骨髓來源抑制性細胞（my eloid-derived suppressor cells，MDSC），二者有效降低腫瘤免疫性。研究表明，TME內(nèi)MDSC積累，抑制抗腫瘤效應T細胞，促進腫瘤生長；吉西他濱、舒尼替尼、5-Fu等許多化學藥物清除MDSC，提高生存率[12-13]。3）調(diào)節(jié)腫瘤細胞免疫原性。阿霉素和Ara-C降低免疫檢查點分子的表達，阻斷其對浸潤T細胞的抑制?；熕幬镉绊懚鄠€生物過程，如雷帕霉素及其類似物改變mTOR信號傳導，增加OVs靶向性，誘導自噬。

OVs聯(lián)合化療或單藥治療腫瘤均優(yōu)于化療。評估37例頭頸部腫瘤患者中腺病毒ONYX-015與順鉑、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu）聯(lián)合抗腫瘤療效，結(jié)果表明患者ORR為53%，優(yōu)于任何一種藥物單獨治療[14]。Lu 等[15]研究表明，H101聯(lián)合化療治療多種實體瘤的總有效率為30.4%，而化療僅為13.0%（P＜0.05）。Lin等[16]研究發(fā)現(xiàn)，H101聯(lián)合肝動脈插管化療栓塞（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）治療肝癌患者，總有效率達到60.9%，總生存期（overall survival，OS）為12.8個月；TACE組有效率僅為36.4%，OS為11.6個月（均P＜0.05）。HSV-1聯(lián)合順鉑治療17例頭頸癌患者，ORR為82.3%，完全緩解率為93%，疾病特異性生存率為82.4%[17]。OV聯(lián)合化療用于頭頸癌、食管癌、肺癌、肝癌等實體瘤時，可提高總有效率，延長患者生存期，安全性良好，以發(fā)熱、嘔吐、感冒樣癥狀居多，無嚴重不良反應。另外，OVs單藥療效優(yōu)于化療。楊帆等[18]研究發(fā)現(xiàn)，H101治療晚期肺癌時，總有效率達到69.23%（化療53.84%；P＜0.05），不良反應無嚴重差異；Pexa-vec和化療分別用于肝癌時，平均OS為14.1個月vs. 6.7個月，患者耐受性良好[19]。

與聯(lián)合化療的原理相同，靶向治療抑制癌細胞內(nèi)異常的信號通路。聯(lián)合使用BRAF、MRK激酶抑制劑和3型呼腸孤病毒[reovirus type 3 （Dearing），RT3D]，通過細胞凋亡體外殺死細胞。RT3D聯(lián)合細胞毒性藥物的研究表明，RT3D安全、可耐受，將RT3D與常規(guī)抗癌藥物聯(lián)合使用，實現(xiàn)協(xié)同作用[20]。

3.2 OVs聯(lián)合放療

OVs和放療是腫瘤治療的兩個不同領(lǐng)域，具有不重疊的細胞毒性譜。輻射增強病毒的溶瘤作用，病毒提高細胞放療敏感性，二者具有協(xié)同作用[11,21]。OVs是一種極具潛力的腫瘤治療策略。最初認為OV的細胞毒性是增加病毒復制、增強腫瘤細胞感染和溶瘤作用，但目前許多OV研究數(shù)據(jù)均不支持這一假設(shè)；大多認為OV阻止DNA修復，使腫瘤細胞對輻射敏感，誘導細胞凋亡。

OVs與放療聯(lián)合抗腫瘤，療效顯著。高度減毒的牛痘病毒（VV，GL-ONC1）結(jié)合放療，可提高抗腫瘤療效[21]；高劑量放療增強腺病毒在前列腺癌細胞內(nèi)的復制，抑制癌細胞的增殖。與單獨治療相比，HSV-1聯(lián)合放療對疾病預后有明顯改善作用；NVl066聯(lián)合放療顯著縮小非小細胞肺癌和惡性間皮瘤的腫瘤體積[22]。RT3D聯(lián)合放療用于晚期實體瘤，根據(jù)不同放療劑量進行分組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在低劑量組中，2例部分緩解（partial response，PR），5例疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）；而在高劑量組，5例PR，2例SD[23]，這表明RT3D聯(lián)合放療的耐受性良好。G207聯(lián)合放療治療9例膠質(zhì)瘤患者，有6例達到PR或SD，注射G207至死亡的中位生存時間為7.5個月，表明單劑量HSV-1聯(lián)合放療療法具有安全性和臨床療效潛力[24]。

OVs可同時聯(lián)合放化療用于抗腫瘤。靜脈注射GL-ONC1聯(lián)合放化療治療19例頭頸癌患者，中位隨訪30個月，1、2年無進展生存率分別為74.4%和64.1%，生存率分別為84.6%和69.2%[25]。AdV-tk與放化療聯(lián)合治療8例腦瘤患者，未發(fā)現(xiàn)劑量限制性毒性，3例患者存活超過24個月；2例患者疾病無進展，分別生存37.3個月和47.7個月，證明AdV-tk聯(lián)合放化療有一定的安全性與療效[26]。一項正在進行的Ⅰ期OV試驗，將DNX-2 401注射到兒童膠質(zhì)瘤患者的小腦腳，2～6周后進行放療和化療，期待該療法能夠提高患者的生存質(zhì)量，延長患者生存期[27]。

3.3 OVs聯(lián)合免疫治療

OVs雖然能夠快速減少局部腫塊大小，但不易產(chǎn)生持續(xù)性抗腫瘤免疫應答。免疫應答是OV療法的關(guān)鍵組成部分，初始誘導很強，隨后效應細胞的抗腫瘤活性被多種免疫調(diào)節(jié)劑（如CTLA-4和PD-L1）抑制。在惡性黑色素瘤小鼠模型中，溶瘤麻疹病毒將抗CTLA-4和抗PD-L1抗體，靶向遞送至TME，誘導較強的特異性抗腫瘤免疫反應，未發(fā)現(xiàn)免疫相關(guān)毒性[28]。另一種黑色素瘤小鼠模型中，瘤內(nèi)注射NDV聯(lián)合抗CTLA-4抗體導致腫瘤消退，存活時間延長[29]。PDL1產(chǎn)生于腫瘤細胞和浸潤腫瘤細胞的過表達，與T細胞上的PD-1結(jié)合，誘導T細胞凋亡[28-29]，使腫瘤細胞逃逸；而阻斷PD-1改善T細胞功能。OV感染增強免疫調(diào)節(jié)劑的表達，增強腫瘤細胞對PD-1或PDL1阻斷的敏感性，引起抗腫瘤免疫反應。因此，OVs聯(lián)合免疫具有治療價值。

抗腫瘤免疫對全身腫瘤有效。聯(lián)合療法增加腫瘤內(nèi)CD8+T細胞浸潤，可能吸引腫瘤特異性T細胞，逆轉(zhuǎn)對PD-1阻斷療法的耐藥性[30]。OV瘤內(nèi)給藥后CD4+和CD8+T細胞全身性增加，CD8+T細胞表達PD-1、增加對腫瘤的浸潤；而腫瘤細胞表達PD-L1，可能限制了OV單藥的抗腫瘤活性，臨床活性優(yōu)于單獨使用任何一種療法的預期。Ribas 等[31]研究表明，TVEC用于21例晚期黑色素瘤患者的ORR為62%，完全緩解率為33%，表明OV療法通過改變TME來提高抗PD-1免疫的療效。T-VEC與伊匹單抗聯(lián)合治療黑色素瘤患者的ORR為39%，而伊匹單抗單藥組僅為18%，表明T-VEC增強伊匹單抗的療效[32]；18個月的無進展生存率為50%[33]。近期Shi等[34]研究表明，一種重組溶瘤5型腺病毒（刪除E1B與E3基因片段、插入hTERTp-人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子至E1a 基因上游以控制病毒復制、保留OV的E1A基因片段）聯(lián)合抗PD-1抗體、CSF抑制劑治療小鼠結(jié)腸癌，增加CD4+與CD8+T細胞的比例，增加腫瘤T細胞浸潤，促進腫瘤消退，延長生存期。由于這種重組溶瘤5型腺病毒的結(jié)構(gòu)與安柯瑞相似，這表明安柯瑞聯(lián)合PD-1免疫療法在抗腫瘤方面的潛能巨大。溶瘤腺病毒編碼趨化因子CCL5和IL-15，觸發(fā)腫瘤新抗原的釋放和抗原決定簇的擴散，提高對腫瘤的殺傷力。

個體化的抗腫瘤免疫療法。1項H101結(jié)合局部加熱治療5例腫瘤患者的研究表明，2例患者注射灶、非注射灶腫瘤完全消退而長期生存，3例患者非注射病灶有不同程度緩解后死亡，生存期分別為29、15、13個月（表1）[35]。腫瘤病灶局部注射H101，腫瘤細胞破壞時，釋放出個體特異性的多種腫瘤抗原；加溫注射病灶，誘導內(nèi)源性HSP（HSP70和gp96）表達，與多種腫瘤抗原結(jié)合，并通過DC上特異性受體遞呈給不成熟的DC[6]，提高了H101的局部療效。此法將OV與免疫治療有機結(jié)合起來，優(yōu)化抗腫瘤免疫反應，使機體形成針對自身腫瘤抗原的特異性細胞免疫反應，獲取最佳療效。

表1 OVs主要臨床研究匯總

4 結(jié)語

為尋求更好的OVs抗腫瘤方法，未來需要更加深入地研究OVs、腫瘤細胞及機體免疫系統(tǒng)之間復雜的相互作用關(guān)系。目前，仍存在較多問題需要解決，如患者免疫狀態(tài)、惡性腫瘤類型、腫瘤突變譜、OVs載體種類等因素與患者對病毒療法的應答之間的關(guān)系等。解決上述問題需要更為廣泛更加深入的基礎(chǔ)研究和臨床試驗，以尋求更為有效和更具個體化的腫瘤治療方法。綜上所述，最有效的抗腫瘤方案可能源于聯(lián)合不同的腫瘤破壞機制，這亟需進一步的研究證實。