乳酸菌的篩選及高產酸菌株的常壓室溫等離子體誘變選育

林楊，布麗根·加冷別克，孫建，譚慧林，周潔，劉少杰，王偉，顧美英*，張志東, *

1(新疆農業(yè)大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊，830052)2(新疆農業(yè)科學院微生物應用研究所，新疆特殊環(huán)境微生物實驗室， 新疆 烏魯木齊，830091)3(阿克蘇地區(qū)食品安全檢測中心，新疆 阿克蘇，843000)4(阿克蘇地區(qū)檢驗檢測中心，新疆 阿克蘇，843000)

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一類可利用碳水化合物發(fā)酵產生大量乳酸的細菌的通稱[1]，其大部分菌株在宿主腸道定植，并發(fā)揮維持腸道平衡、降低膽固醇含量、改善乳糖不耐癥及提高機體免疫力等功能[2]，被公認為食品安全級微生物(generally recognized as safe，GRAS)，常用于酸奶、奶酪等乳制品的生產加工中[3]。乳酸菌的蛋白酶活性及產酸性能作為影響乳酸菌益生作用的重要因素，是篩選性質優(yōu)良、穩(wěn)定性強的工業(yè)生產菌株的主要指標[4]。然而，傳統(tǒng)乳酸菌發(fā)酵所產生的蛋白酶及乳酸含量較低，無法滿足現代發(fā)酵食品工業(yè)的需求，因此，需要對菌株進行誘變育種，提高菌株的生產性能。

常規(guī)的育種方法有紫外線誘變、重離子束輻照、亞硝基胍誘變等，而常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma， ARTP)誘變是一種基于大氣環(huán)境溫度和射頻等離子體的新型微生物誘變育種技術[5]，與其他誘變方法相比，ARTP可在大氣壓和室溫(25～40 ℃)下高效誘導DNA鏈斷裂[6]，同時具有操作簡單、安全性高、環(huán)境友好、突變速度快、突變率高、突變多樣性大等特點。目前，它已成功應用于許多不同微生物以改善其基因組[7]。如GAO等[8]使用ARTP誘變技術使得乳酸菌HX-3-3在發(fā)酵過程中的γ-氨基丁酸產量提高了25.98%；陳瑞龍[9]以植物乳桿菌-A65為研究對象，通過ARTP誘變技術使其細菌素產量提高了45%以上，大大提高了菌株的抑菌活性。

本研究對新疆烏魯木齊周邊牧區(qū)的4種傳統(tǒng)酸奶中進行了乳酸菌的分離鑒定，優(yōu)選出1株蛋白酶高產菌株，并對其進行ARTP誘變，顯著提高了該菌的產酸能力，為后續(xù)進一步選育和開發(fā)相關優(yōu)質乳酸菌資源提供了堅實的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

4種傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶，均采集于新疆烏魯木齊南山牧區(qū)。

1.2 培養(yǎng)基

MRS肉湯、MRS瓊脂培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司。

酪蛋白固體培養(yǎng)基[10](g/L)：酪蛋白10，牛肉膏3，NaCl 5，Na2HPO42，MgSO4·7H2O 0.5，瓊脂18，pH 7.3±0.2，121 ℃、0.1 MPa滅菌15 min。

1.3 菌株的分離純化

取各酸奶樣品25 mL于225 mL無菌水中，振蕩搖勻，依次稀釋至10-6。分別取各濃度稀釋液100 μL，均勻涂布于含2%(質量分數) CaCO3的MRS培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h。挑取有溶鈣圈的單菌落，進行分離純化。菌株經重復純化3次后轉接至斜面，于4 ℃保藏備用。

1.4 菌株形態(tài)及代謝活性分析

菌株的形態(tài)特征鑒定參照東秀珠等[11]《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》。

過氧化氫酶試驗：滴加3%(體積分數) H2O2于細菌培養(yǎng)物的試管中，產生氣泡為陽性，否則為陰性。產蛋白酶試驗：將菌株接種于酪蛋白固體培養(yǎng)基上，觀察有無透明圈及透明圈的大小。

1.5 菌株的分子生物學鑒定

采用細菌基因組提取試劑盒提取乳酸菌的基因組DNA，具體操作按說明書進行。利用細菌16S rRNA基因通用引物27 F和1495 R進行PCR擴增[12]，條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR擴增產物經0.8%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送往北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司測序。

將測序結果在NCBI上進行Blast比對，同時調取同源性最高的模式菌株，利用MEGA 7.0建立菌株Neighbor-joining(N-J)系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 菌株產酸量的測定

采用滴定法測定菌株的產酸能力[13]。取活化后的菌株按2%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，取各菌株的發(fā)酵液10 mL于50 mL蒸餾水中，滴加2～3滴1 g/L的酚酞作指示劑，用0.1 mol/L的NaOH標準溶液進行滴定，以溶液出現粉紅色且30 s后不褪色為滴定終點，每個樣品3次平行[14]。以未接種的發(fā)酵培養(yǎng)基作空白對照，其計算如公式(1)所示：

(1)

式中：V1為樣品消耗NaOH溶液的體積，mL；V2為空白對照消耗NaOH溶液的體積，mL；V0為稀釋液的總體積，mL；c為標準NaOH的濃度，mol/L。

1.7 蛋白酶活力的測定

采用Folin-酚法[4]測定菌株的蛋白酶活力。蛋白酶活力的計算如公式(2)所示：

(2)

式中：V為酶液的總體積，mL；T為酶解反應時間，min；N為酶液的稀釋倍數；K為吸光常數。

通過對分離株產酸量及蛋白酶活力的測定，篩選出產酸量低，但蛋白酶活性高的菌株進行ARTP誘變，以獲得高產酸的蛋白酶高產菌株。

1.8 ARTP誘變

1.8.1 菌懸液的制備

將活化后的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，至對數生長中后期，3 000 r/min離心10 min，棄去上清液。菌體用生理鹽水洗滌2次后，重懸，并制成濃度為107～108的菌懸液，備用。

1.8.2 ARTP誘變

無菌條件下，取10 μL稀釋好的菌懸液，均勻涂于無菌金屬載片表面，以氦氣為工作氣體，設置電源功率120 W、射頻功率13 W、間距2 mm、氣流量10 L/min，處理時間分別為0、20、40、60、80、100 s。處理完的載片置于裝有MRS液體培養(yǎng)基的離心管中，進行振蕩洗脫，形成新的菌懸液。對新的菌懸液進行適當稀釋，取100 μL涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)2～3 d，每個處理3次平行，利用公式(3)計算致死率[15]：

(3)

1.8.3 誘變菌株的篩選和遺傳穩(wěn)定性試驗

從誘變菌中隨機挑選單菌落，點接到含2% CaCO3的MRS培養(yǎng)基上，并以原始菌作對照，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。通過測定并統(tǒng)計每個菌落的溶鈣圈直徑與菌落直徑的比值(HC值)及該菌株的產酸量，篩選高產酸的突變菌株。

將篩選出的突變乳酸菌株以2%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，以此作為1次傳代培養(yǎng)，并以每代的發(fā)酵液作為下一次傳代的種子液，連續(xù)傳代7次，測定其每一代的產酸能力，每代設置3個重復，從而驗證菌株的突變性能是否能夠穩(wěn)定遺傳。

1.9 統(tǒng)計分析

試驗數據采用Microsoft Excel 2010、MEGA 7.0、SPSS 19.0(SPSS Inc， USA)等數據處理系統(tǒng)進行整理及統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選結果

通過在含有2% CaCO3的MRS培養(yǎng)基上進行溶鈣圈和形態(tài)觀察，從4種樣品中共分離出潛在乳酸菌12株，經革蘭氏染色和過氧化氫酶檢測，所得菌株均為革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性，初步鑒定為疑似乳酸菌株。

2.2 菌株的分子生物學鑒定

通過測序獲得上述菌株16S rRNA基因序列，與NCBI中相關模式菌株序列進行比對，確定12株細菌分屬于乳植桿菌屬(Lactiplantibacillus)和鏈球菌屬(Streptococcus)的4個種，代表菌株系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。

圖1 基于16S rRNA序列的代表菌株N-J系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Neighbor-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of isolates and close relatives

2.3 不同分離株的產酸量

不同分離株的產酸量如圖2所示，12株乳酸菌的產酸量在13～30 g/L，其中菌株T1的產酸量最高，達29.19 g/L；菌株S1、S2、S3、Y1、T2、X1、X2等7株菌的產酸量在19～26 g/L；其余菌株產酸量則較低，在13.5 g/L左右。

圖2 菌株產酸能力Fig.2 Acid-producing ability of isolates

2.4 蛋白酶高產菌的篩選

通過酪蛋白培養(yǎng)基從12株乳酸菌中篩選出透明圈直徑較大的5株菌S1、S3、Y8、X2、T1，通過測定其蛋白酶活力可知，菌株Y8的蛋白酶活力最高，達39.14 U/mL；其次為X2，為33.12 U/mL；而S1蛋白酶活力最低，僅為5.82 U/mL。因此，試驗選取高產蛋白酶且產酸能力較弱的菌株Y8，進行誘變選育。

圖3 菌株蛋白酶活力Fig.3 Protease activities of isolates

2.5 ARTP誘變選育乳酸菌

2.5.1 誘變時間的確定

誘變時間對致死率的影響如圖4所示，隨著處理時間遞增，誘變20 s后致死率大幅度上升，至處理60 s 時致死率已經達91.09%，處理80 s時，菌株存活率幾乎為零。一般而言，當致死率在90%以上時，菌株產生高產突變的概率較高，且在此突變率下回復性更小。因此，考慮到突變穩(wěn)定性，最終選擇ARTP誘變處理的時間為60 s。

圖4 菌株Y8 ARTP誘變致死率Fig.4 Lethality rate of the isolate Y8 by ARTP

2.5.2 高產酸菌株的篩選結果

試驗以菌株Y8作對照，其菌落的平均HC值為3.391，根據MRS-CaCO3培養(yǎng)基的溶鈣圈大小初步挑選出較對照株明顯變大及變小的菌株58株，同時將菌株重新點接于MRS-CaCO3培養(yǎng)基上測定其溶鈣圈直徑，進一步得到溶鈣圈直徑較對照株有差異的突變株，并重新編號，結果見表1。試驗將超出對照HC值40%的菌株定義為正突變菌株，否則為負突變菌株，最終得到1株HC值為5.023的高產酸菌株Y8-6。

表1 代表菌株的平板初篩結果Table 1 Screening of acid production ability of mutant isolates on plate

將誘變株分別通過液體發(fā)酵培養(yǎng)，測定其平均產酸量，如圖5所示，菌株Y8-6的產酸量最高，為 23.41 g/L，與初篩結果一致。

圖5 誘變株產酸復篩結果Fig.5 Acid production ability of mutant isolates

2.5.3 遺傳穩(wěn)定性試驗

將突變乳酸菌株連續(xù)傳代7次，測定其每一代的產酸能力，結果如圖6所示，正向突變株Y8-6經7次傳代培養(yǎng)后，其平均產酸量依次為22.76、23.12、24.00、23.08、23.32、23.00、22.87 g/L，平均值為23.16 g/L。由此可見，突變株的酸產量穩(wěn)定。

圖6 菌株Y8-6連續(xù)7代產酸穩(wěn)定性情況Fig.6 Genetic stability test of acid production by the isolate Y8-6 for 7 successive generations

3 討論與結論

乳酸菌是目前世界公認的食品安全級微生物，對人體健康具有積極作用。乳酸菌在發(fā)酵過程中代謝產生的乳酸，能夠降低體系pH，縮短發(fā)酵時間[16]，提高生產效率，節(jié)約成本，同時乳酸還能抑制其他雜菌的生長，有利于發(fā)酵環(huán)境的保持，且發(fā)酵產生的乳酸是重要的呈味物質，能夠賦予食物特殊的風味。因此，篩選和保存高產酸性能的乳酸菌，將其利用于生產發(fā)酵，能實現更高的利用價值[17]。同時，乳酸菌在發(fā)酵過程中產生的蛋白酶能夠水解食物中的蛋白質使其生成更小的肽類或氨基酸[18-19]，而蛋白質經酶解后生成的多肽，比原蛋白質的營養(yǎng)特性更好，且經消化道酶作用后分解為人體更易吸收的預消化狀態(tài)，有益于人體對蛋白質、鈣、鐵離子及維生素的吸收，同時分解產生的多肽具有促進微生物增長、抗氧化、增強免疫力等功能[20]。此外，乳酸菌具有較強的黏附力，更易定植在腸道黏膜上形成屏障保護動物腸道健康，尤其是產蛋白酶乳酸菌在腸道中定植后，不僅能夠發(fā)揮益生作用，而且能夠通過在機體消化道內釋放蛋白酶而提高機體對蛋白類食物的利用率[21]。因此，高產蛋白酶、高產酸的菌株在發(fā)酵食品的質量控制、風味形成和營養(yǎng)提升中發(fā)揮了重要的作用[22]。

新疆有著豐富的傳統(tǒng)發(fā)酵食品資源，如酸馬奶、奶疙瘩、駝乳、干酪等具有獨特民族特色的傳統(tǒng)發(fā)酵制品，其中蘊含豐富的乳酸菌資源[23]。本研究從4種新疆傳統(tǒng)酸奶中分離出12株疑似乳酸菌，經16S rRNA基因序列分析鑒定歸屬為德氏乳植桿菌保加利亞亞種(Lactiplantibacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)、嗜酸乳植桿菌(Lactiplantibacillusacidophilus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)和瑞士乳植桿菌(Lactiplantibacillushelveticus)。試驗通過透明圈法和Folin-酚法進一步篩選到5株產蛋白酶菌株，同時對其中1株蛋白酶活力最高而產酸能力較弱的德氏乳植桿菌保加利亞亞種Y8菌株進行ARTP誘變育種。

ARTP誘變技術是近年來發(fā)展起來的一種新穎且高效的物理誘變技術[24]，其能夠在常壓室溫下高效誘導DNA和寡核苷酸發(fā)生高強度斷裂，極大地改變細胞壁和細胞膜的理化性質[25]，進而引起組織損傷，迫使細胞以較高的容錯水平啟動SOS修復機制，從而產生多種不匹配位點，并得到大量高突變體樣本[26]。與傳統(tǒng)誘變方法相比，其具有突變率高、操作簡便、成本低廉、環(huán)境友好等特點[27]，因此，在微生物突變育種及生物醫(yī)學領域中顯示出廣闊的應用前景。目前，有關利用ARTP技術誘變乳酸菌，進行高產酸菌株篩選研究較少。本研究初步確立了ARTP誘變乳酸菌的方法，以氦氣為工作氣體，設置電源功率120 W、射頻功率13 W、間距2 mm、氣流量10 L/min、處理時間60 s，此時致死率為91.09%，在該條件下，最終篩選獲得1株高產酸菌株Y8-6，其產酸能力較原始菌株提高了64.5%，且蛋白酶活性穩(wěn)定。

相關研究表明，ARTP誘變高效率突變的同時，其均勻覆蓋率及高突變率也可在一定程度上改變菌株的生理特性。進一步驗證選育菌種的突變穩(wěn)定性，開展誘變菌株代謝通路變化分析，仍有待深入研究。