小熱休克蛋白對牛肉嫩度影響機制的研究進展

趙妍，羅欣，毛衍偉，楊嘯吟，朱立賢，梁榮蓉，成海建，張一敏*

1(山東農業(yè)大學 食品科學與工程學院，山東 泰安，271018)2(國家肉牛牦牛產業(yè)技術體系濟南站，山東 濟南，250000)

熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)又稱為熱應激蛋白，最早發(fā)現(xiàn)于1962年，它是指機體在環(huán)境溫度高于生物體正常生長溫度或生物體受到其他應激時產生的一類具有高度保守性的蛋白質，其中多數(shù)為伴侶蛋白[1]。這類蛋白質有助于蛋白質折疊、裝配、轉運，具有防止蛋白質在細胞中的聚集和降解，使細胞應對熱和其他環(huán)境的損傷[2-3]等功能。有研究表明HSPs的部分生理功能會對肉的食用品質[4-5],尤其是嫩度產生重要影響[6]。

在肉類科學領域，首次提出sHSPs(small heat shock proteins，sHSPs)在肉嫩度中的作用是由于其抗細胞凋亡功能的假設，sHSPs可以通過干擾調節(jié)細胞凋亡的信號轉導途徑來增強細胞存活。近年來，隨著sHSPs對肉嫩度的影響研究越來越多，sHSPs的其他生理功能對肉嫩度的影響得到了廣泛關注。眾多研究表明，sHSPs因其分子伴侶功能促進蛋白質的正確組裝和折疊，適當重組異常折疊和變性的蛋白質，維持蛋白質結構穩(wěn)定性；除此之外，sHSPs可與肌原纖維結合成為μ-鈣蛋白酶的替代底物，減少肌原纖維蛋白的水解，與肉嫩度密切相關。上述sHSPs的生理功能是影響肉嫩度形成的關鍵因素，本文將系統(tǒng)闡述主要HSPs的結構及功能，以及其作為肉嫩度生物標記物的可能性，并從sHSPs對蛋白質聚合物形成、細胞骨架蛋白降解、細胞凋亡進程的調控3個方面分析其對肉嫩度的影響機制，以期為肉類科學領域研究提供方向，并為肉牛優(yōu)質化生產提供理論參考。

1 HSPs概述

1.1 HSPs的分類、典型HSPs的結構及功能

HSPs有多種分類方法，按其單體分子大小可分為5類，分別為12 kDa～43 kDa、60 kDa、70 kDa、90 kDa和100 kDa左右，分別稱為sHSPs、HSP60、HSP70、HSP90和HSP100。不同種類的HSPs其化學結構及功能有所差異，對肉品質的影響也有所不同，下面將對幾種主要HSPs的結構和功能進行闡述。

HSP20、HSP27和αβ-晶體蛋白都屬于sHSPs家族，作為分布最廣泛但保守性最差的分子伴侶蛋白家族，其大多數(shù)蛋白質都具有以下共同特征，包括(1)位于C末端由約90個殘基組成的保守α-晶體蛋白結構域，該結構域通常后跟一個短的變量序列WDPF結構域；(2)12 kDa～43 kDa的分子質量；(3)形成大的低聚物；(4)動態(tài)四元結構；(5)應激條件誘導和伴侶活性抑制蛋白質聚集。sHSPs分子質量的差異可以用WDPF結構域和α-晶體蛋白結構域中可變位點長度的差異以及可變C端的長度來解釋(圖1)。有研究表明，sHSPs可以通過在應激細胞中發(fā)揮分子伴侶作用、負調控應激誘導的細胞凋亡來維持蛋白質穩(wěn)定進而影響肉的嫩度[6]。

圖1 HSP20、HSP27和αβ-晶體蛋白結構示意圖[6]Fig.1 Schematic structures of HSP20, HSP27 and αβ-crystallin[6]

HSP40家族成員分為I型、II型和III型。所有的HSP40蛋白都含有一個約由70個氨基酸殘基構成的J結構域。在I型和II型HSP40蛋白中，J結構域位于N端，而在III型HSP40蛋白中，它可以位于蛋白序列的任何位置[7]。HSP40的J結構域可以與HSP70的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)酶結構域接觸，進而刺激HSP70的ATP酶活性。除了J結構域，I型和II型HSP40在蛋白的C端都有一個肽結合片段。與其他兩種類型HSP40結構不同的是，I型HSP40在J結構域和C末端肽結合片段之間含有鋅結合結構域(圖2)。HSP40作為HSP70的分子伴侶，是近年來備受關注的一種特殊的伴侶蛋白，可以促進蛋白質折疊和轉運[7]，并且也可作為肉嫩度的潛在分子標記物。

圖2 HSP40家族結構示意圖[7]Fig.2 Schematic structures of HSP40 family[7]

HSP70氨基酸的一級結構可分為2個功能域，分子質量為45 kDa的N端域是ATP結合的結構域，控制ATP的結合過程，比羧基端具有更高的保守性；C端域是分子質量為25 kDa的底物結合結構域(包括15 kDa底物肽結合槽和10 kDa C端蓋結構域)，是多肽結合所必需的(圖3)，除此之外，C末端還包含一個保守的EEVD基序，該基序錨定了HSP40的C-末端肽結合片段[7]。基于HSP70的生物學功能，其在細胞內參與蛋白質的合成和運輸、蛋白質的折疊、降解及調節(jié)過程，以維持細胞蛋白的穩(wěn)定性，提高細胞對應激原的耐受性，使細胞維持正常的生理功能，具有分子伴侶、抑制活性氧的形成、抗細胞凋亡、免疫等作用[1,8]。

圖3 HSP70結構示意圖[7]Fig.3 Schematic structures of HSP70[7]

HSP90由3個高度保守的結構域構成，N末端結構域包含ATP結合“口袋”，具有ATP酶活性；中間域含有大量疏水表面，與底物蛋白質的結合及其折疊相關；C端域含有特殊基序MEEVD，主要負責同源二聚體的形成[9-10](圖4)。HSP90對于許多涉及細胞周期調控、信號轉導以及細胞生長調控蛋白質的折疊、成熟及穩(wěn)定是必需的，其功能主要依賴于ATP與HSP90結合后造成的HSP90構象重排以及ATP水解現(xiàn)象[11]。

圖4 HSP90結構示意圖[10]Fig.4 Schematic structures of HSP90[10]

綜上所述，不同類型HSPs由于其由不同的結構域組成，其生理學功能有著顯著差異，但均可對蛋白質的折疊、運輸?shù)冗^程產生重要影響。

1.2 HSPs是肉嫩度的生物分子標記物

在宰后初期預測特定品質的最終結果對于肉類工業(yè)是有利的，其中嫩度一直是消費者追求的首要品質指標，因此尋找肉類嫩度的生物標記物具有重要意義[11]。

KIM等[12]通過二維凝膠電泳和質譜分析韓國本土牛背最長肌的蛋白質組學時發(fā)現(xiàn)，HSP27的表達水平與剪切力呈正相關(r=0.658，P<0.05)，HSP27的下調可能增加肌動蛋白和肌球蛋白等肌肉蛋白的降解，從而改善肉的嫩度；孫金龍等[13]以經HSP27抑制劑處理的藏羊肉為研究對象時發(fā)現(xiàn)，HSP27能夠顯著抑制細胞凋亡酶3、細胞凋亡酶9的活性，進而抑制肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T的降解，抑制肌原纖維小片化的發(fā)生，抑制肌肉宰后成熟過程中的嫩化；JIA等[14]在鑒定嫩度不同的牛背最長肌樣品中差異表達蛋白時發(fā)現(xiàn)，HSP70在2組樣品中表達量存在差異。綜上，HSPs因其維持蛋白質完整性、維持骨骼肌的結構和功能特性、抗細胞凋亡等功能，不利于肌動蛋白、肌球蛋白、肌間線蛋白等的降解，可作為肉嫩度的分子標記物[15]，其表達量與肉嫩度呈不同程度的相關關系。

PICARD等[16]對來自不同品種、不同部位的牛肉蛋白相對豐度進行定量時發(fā)現(xiàn)HSPs與嫩度相關，但因肌肉和品種不同，相關關系存在一定差異。推測HSPs在不同程度上可以阻止細胞凋亡的發(fā)生以防止細胞損傷，從而在宰后肌肉變化中發(fā)揮重要作用，可在嫩度預測中得到應用；GUILLEMIN等[17]比較了夏洛萊公牛和閹牛的胸最長肌(longissimus thoracis，LT)和半腱肌(semitendinosus，ST)中24種牛肉嫩度標記物豐度的差異，發(fā)現(xiàn)公牛的αβ-晶體蛋白和HSP27含量顯著高于閹牛，而閹牛中的HSP70含量顯著高于公牛，LT肌肉中αβ-crystallin、HSP40和HSP70-1A的含量顯著高于ST??；CRAMER等[18-19]在確定sHSPs與雙肌臀基因型和正常基因型羔羊的腰肉嫩度的關系時發(fā)現(xiàn)，與正常基因型相比，具有雙肌臀基因的羔羊腰肉中肌間線蛋白、肌鈣蛋白-T、μ-鈣蛋白酶、HSP27降解產物顯著減少，非活性半胱天冬酶含量高，細胞凋亡進程受到抑制，HSP27降解產物與剪切力呈負相關，因而其具有更高的剪切力，即更差的嫩度。基于以上研究可知，雖然所研究動物的品種和基因型存在一定差異，但均可發(fā)現(xiàn)HSPs與肉嫩度有顯著相關性，并且在不同動物品種、基因型以及不同肌肉部位間中表現(xiàn)出不同的相關性[11,20]，這也進一步說明HSPs可以作為肉嫩度的生物分子標記物。

2 sHSPs對肉嫩度的影響機制

肉的嫩度是指肉的柔軟性，指肉在食用時口感的老嫩程度，是影響消費者購買欲望的最重要的食用品質之一。但是這種品質的特征具有不受控制的可變性，肌肉結構(結締組織含量、組成和結構，肌原纖維類型，肌節(jié)長度)和生化特性(肌原纖維和細胞骨架蛋白的蛋白水解)被認為是影響牛肉嫩度變異性的主要因素[2,21-23]。sHSPs因其在蛋白質組裝、蛋白質折疊和展開以及受損蛋白質的復性過程中發(fā)揮分子伴侶功能，從而維持細胞內穩(wěn)態(tài)，抑制肌原纖維蛋白降解，進而影響肌肉宰后成熟過程中的嫩化[6,24]。已有研究從sHSPs對蛋白質聚合物形成、細胞骨架蛋白降解、抗細胞凋亡等方面探討了sHSPs對肉嫩度的影響機制。

2.1 sHSPs可能通過對蛋白質聚合物形成的調控影響嫩度

基于sHSPs的分子伴侶特性，很多學者研究了sHSPs對蛋白質聚合物形成的影響。MORZEL等[25]發(fā)現(xiàn)HSP27的表達與宰后牛肉嫩度之間存在正相關關系，盡管其表觀上對肌肉中的肌動蛋白分解具有保護作用，但其還與成熟過程中肌動蛋白的高度斷裂有關，這種情況的發(fā)生可能是因為HSP27的存在抑制了肌肉在貯藏過程中肌動蛋白復合物的形成，使骨骼肌肌原纖維蛋白的化學物理的識別位點發(fā)生了改變，進而使蛋白酶活性增強。MALHEIROS等[26]利用蛋白質組學研究時也發(fā)現(xiàn)3種sHSPs在嫩度較好的肉中的表達量較高，研究認為這一結果與sHSPs的功能有關，高含量的sHSPs能夠防止蛋白質的集聚，有利于肌原纖維蛋白的降解，而產生嫩度較好的肉。

以上研究說明，由于蛋白質聚集體的形成被認為是限制動物宰后蛋白質分解的一個因素，因此與限制蛋白質聚集體形成相關的高水平sHSPs可使肌原纖維蛋白原本的物理化學識別位點發(fā)生變化，增加酶作用的表面積，促進蛋白水解酶在肉類成熟過程中的作用，從而促進肌原纖維蛋白的水解，進而改善肉的嫩度，即sHSPs表達量與嫩度呈正相關。但sHSPs對肉嫩度影響機制的研究仍需從多個角度進行探究。

2.2 sHSPs可能通過對細胞骨架蛋白降解的調控影響嫩度

細胞骨架蛋白主要包括肌聯(lián)蛋白、伴肌動蛋白、肌間線蛋白、肌鈣蛋白-T等，這些蛋白可以確保肌原纖維間和肌原纖維內的連接，目前研究較多的與細胞骨架蛋白降解有關的酶類包括鈣蛋白酶、組織蛋白酶、細胞凋亡酶與蛋白酶體，其對細胞骨架蛋白的水解作用與宰后肌肉嫩度改善密切相關[27-30]。

丁振江[2]使用外源性HSP27對宰后牛肉進行處理，借助十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳和Western-blotting檢測肌原纖維蛋白降解變化時發(fā)現(xiàn)，外源HSP27在宰后的前3 d可以抑制肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T的降解，穩(wěn)定肌原纖維蛋白，與嫩度呈負相關；LOMIWES等[31]通過免疫沉淀法研究安格斯犢牛背最長肌中αβ-晶體蛋白、HSP20、HSP27與肌間線蛋白、肌聯(lián)蛋白與μ-鈣蛋白酶之間的關系時發(fā)現(xiàn)，外源的αβ-晶體蛋白降低了μ-鈣蛋白酶活性，同時發(fā)現(xiàn)在與過量的αβ-晶狀蛋白共同孵育的肌原纖維中，外源性μ-鈣蛋白酶對肌間線蛋白和肌聯(lián)蛋白的降解速率減慢，這表明αβ-晶體蛋白可能通過降低酶活性或作為酶的替代底物競爭性地抑制μ-鈣蛋白酶誘導的肌聯(lián)蛋白和肌間線蛋白降解。此外，HSP27也可能通過與μ-鈣蛋白酶結合，降低μ-鈣蛋白酶的活性[2]。

以上研究表明，sHSPs可以通過與肌原纖維蛋白結合成為μ-鈣蛋白酶的替代底物，競爭性地抑制μ-鈣蛋白酶誘導的肌原纖維蛋白降解，減少肌原纖維蛋白的酶促水解，對宰后細胞結構完整性有保護作用，與肉嫩度呈負相關。此外，部分sHSPs還可能通過與μ-鈣蛋白酶結合，降低μ-鈣蛋白酶的活性，同樣減少由μ-鈣蛋白酶誘導的肌原纖維蛋白降解(圖5)。綜上，從sHSPs對細胞骨架蛋白降解影響的角度來看，sHSPs與肉的嫩度呈負相關。但肉類嫩化是一個復雜的生化過程，涉及多種肌原纖維蛋白降解以及內源酶酶解作用，因此明確sHSPs對肌原纖維蛋白的保護作用以及其與多種內源酶的相互作用機理，還需要通過進一步的探索研究來確定。

2.3 sHSPs可能通過對細胞凋亡進程的調控影響嫩度

細胞凋亡酶屬于半胱氨酸蛋白酶，主要參與細胞的凋亡過程。動物被宰殺后，機體出現(xiàn)缺血、缺氧環(huán)境，營養(yǎng)物質供應終止，肌肉不可避免地發(fā)生細胞凋亡，作為細胞程序性死亡的一個組成過程，細胞凋亡發(fā)揮著與有絲分裂相反但互補的作用[6]。近期有研究表明，HSPs作為具有抗凋亡作用的伴侶蛋白可以通過調節(jié)細胞凋亡進程進而影響肉的嫩度[32-33]。

當細胞暴露在高溫、局部缺血、營養(yǎng)物質供應終止等應激環(huán)境時sHSPs表達尤為顯著，能夠發(fā)揮抗凋亡作用來影響嫩度。丁振江[2]使用外源性HSP27對牛肉進行處理，檢測細胞凋亡酶3降解情況時發(fā)現(xiàn)HSP27可與細胞凋亡酶3結合并明顯降低細胞凋亡酶3降解和活性。有學者提出假設，中間型極限pH組(5.8

綜上，由于細胞凋亡在肌肉轉化為肉的過程中發(fā)揮著重要的作用，因此細胞凋亡過程的進行與肉嫩度存在密切關系。基于sHSPs的抗凋亡功能，sHSPs能在細胞凋亡的多個途徑中抵抗凋亡的發(fā)生，并對肉嫩度改善過程造成影響[35-36]。sHSPs可以與細胞凋亡酶3的底物結合，阻止底物蛋白質的降解，同時sHSPs還可直接與細胞凋亡酶3結合降低其生物活性，影響細胞凋亡進程。除此之外，sHSPs還可以直接與細胞色素C結合或封阻其釋放[37]，在凋亡開始時阻止凋亡小體的產生，同樣，sHSPs還可以與影響凋亡的各種成分(Apaf-1,Bax,Bcl-2)相互作用，阻止細胞凋亡酶的激活，抑制肌間線蛋白的降解，阻止細胞凋亡(圖5)。但肌肉轉化過程中sHSPs對細胞凋亡進程的影響尚需深入研究以了解其對肉嫩度的詳細影響機制。

圖5 小熱休克蛋白對宰后肉嫩度影響機制示意圖[17,32]Fig.5 Schematic diagram of the effect of small heat shock protein on postmortem tenderness[17,32]

3 其他因素對HSPs表達的影響

HSPs的表達與肉的極限pH值、應激方式、動物基因型、品種以及肌肉部位等有關，這些相關性進一步對肉的嫩度產生影響。LOMIWES等[6]研究時發(fā)現(xiàn)，宰后成熟期間sHSPs表達量變化與肌肉極限pH值有關，中間型極限pH組牛肉sHSPs含量較高，且可結合μ-鈣蛋白酶，并作為分子伴侶穩(wěn)定肌原纖維結構，使得該組肉的嫩度較差。但李婕等[38]在對青海大通牦牛背最長肌成熟過程中剪切力與HSP27含量測定時發(fā)現(xiàn)在成熟過程中，HSP27表達量與牦牛肉剪切力值成負相關(與嫩度成正相關)，盡管相關性差異并不顯著，但卻表明sHSPs對肉嫩度的影響可能與其他因素有一定關系。除了肌肉極限pH值外，應激方式、動物基因型、品種以及所用肌肉部位也能夠顯著影響HSPs在肌肉中的表達量，并進一步影響肉的嫩度。

3.1 pH值

牛屠宰放血后肌肉內氧氣供應終止，ATP的分解、乳酸的產生會導致肌肉pH值的下降[39]，當糖酵解酶活性鈍化或糖原消耗殆盡時，糖酵解進程停止，pH值不再繼續(xù)下降，此時的pH值即為宰后肌肉的極限pH值(ultimate pH，pHu)[40]。

LOMIWES等[41]在對高pHu(pH≥6.2)、中間pHu(5.8

在不同pHu肉中，sHSPs含量及降解情況不同，同時由于鈣激活酶及組織蛋白酶等內源酶的最適pH不同，其活性在不同pHu肉中存在差異，因此內源酶水解活性及sHSPs含量等因素共同作用使得不同pHu肉中細胞骨架蛋白降解程度有所不同，肉嫩度也有一定差異。

3.2 宰前應激與宰后嫩化處理

動物的宰前應激一部分來源于情緒，比如人類的存在和環(huán)境的不熟悉引起的恐懼以及由于飼養(yǎng)群體的破壞引起的混亂；還有一部分與生理因素有關，如食物和水的缺乏、運輸時間長或期間與設備、其他動物的碰撞造成的疼痛。宰前應激會降低肌肉糖原含量，導致新陳代謝加快，研究表明，宰前應激與肉的嫩度和多汁性有關[43]。其中運輸應激和熱應激是兩種主要的應激方式。熱應激是指機體在受到超過自身體溫調節(jié)能力的環(huán)境刺激下所產生的非特異性應答反應，在熱應激期間，HSPs的表達量上升提高熱應激期間耐熱性。

動物在運輸過程中會受到多種應激，包括卡車運動、噪音、震動、離心力、光照條件的快速變化、冷熱環(huán)境、空氣質量以及水和飼料的短缺。袁建彬等[44]對經過運輸應激后的肉牛的運輸狀態(tài)進行評估時發(fā)現(xiàn)，運輸6 h后肉牛應激相關蛋白HSP70的濃度顯著上調。

除了宰前應激會對HSPs表達量造成影響外，一些宰后嫩化處理方式也會影響sHSPs的表達。CONTRERAS-CASTILLO等[45]研究了電刺激對宰后貯藏過程中sHSPs濃度的影響，與未電刺激(not stimulated，NS)的肌肉相比，電刺激(electrical stimulation，ES)后1～2 d肌肉中αβ-晶體蛋白的豐度更高；宰后早期和后期成熟時，ES肌肉中的初始HSP20濃度明顯高于NS肌肉；在成熟過程中，NS肌肉的肌原纖維中HSP27濃度逐漸升高，相比之下，ES細胞中HSP27的濃度僅在死后早期增加，在宰后約12 h達到高峰，在隨后的時間點下降。

通過以上研究可以得出，運輸應激、熱應激等宰前應激和電刺激等宰殺過程中的處理方式能夠顯著影響HSPs在肌肉中的表達量。由于HSPs表達量的變化能夠顯著影響嫩度，因此，在牛肉生產過程中制定牛肉嫩度關鍵控制點時，應該注意宰前應激方式或電刺激強度對HSPs表達量的調控及進而對牛肉嫩度的影響。

3.3 動物品種、基因型、肌肉部位

HSPs在不同動物、不同肌肉部位中的表達量也有所不同。GUILLEMIN等[17]在比較夏洛萊公牛和閹牛的LT和ST中牛肉嫩度標記物豐度差異時，發(fā)現(xiàn)公牛的αβ-晶體蛋白和HSP27含量顯著高于閹牛，而閹牛中的HSP70含量顯著高于公牛；在比較兩不同肌肉部位HSPs豐度時，發(fā)現(xiàn)LT肌肉中與嫩度相關的蛋白質具有更高的豐度；CRAMER等[19-20]等在確定sHSPs與雙肌臀基因型和正常基因型羔羊的腰肉嫩度的關系時發(fā)現(xiàn)，與正常基因型相比，具有雙肌臀基因的羔羊腰肉中HSP27降解產物顯著減少，肌原纖維結構蛋白的蛋白水解較少，非活性半胱天冬酶含量高，其具有更高的剪切力，即更差的嫩度。MA等[46]研究牛不同肌肉部位成熟過程中肌原纖維蛋白水解變化時發(fā)現(xiàn)，在成熟過程中肌肉部位之間sHSPs降解速率和程度不同，進而呈現(xiàn)出不同的嫩化效果。

基于以上研究可知，HSPs在不同動物品種和基因型中表現(xiàn)出與嫩度不同的相關性，由此也進一步確定HSPs對肉的嫩度具有潛在影響。

4 結論與展望

sHSPs作為一種應激蛋白，其在肌肉向食用肉轉化過程中的作用仍然是肉科學領域未探明的一個科學問題。sHSPs可以通過阻止蛋白質在細胞中的聚集，促進肌原纖維蛋白的降解，而有利于肉的嫩化。但是同時發(fā)現(xiàn)，sHSPs可與肌原纖維蛋白結合，競爭性抑制μ-鈣蛋白酶誘導的肌原纖維蛋白降解；也可與μ-鈣蛋白酶結合，降低其酶解活性而不利于肉嫩度的改善；除此之外，sHSPs因其抗細胞凋亡功能，可與細胞凋亡酶-3或其底物相結合，降低其生物活性，也可封阻細胞色素C的釋放，影響細胞凋亡進程，抑制肌原纖維蛋白的降解，也不利于肉的嫩化。目前的研究結果表明，sHSPs與肉嫩度之間的確存在密切關系，但是這一關系是正面還是負面，仍存在很大爭議，需要進一步的系統(tǒng)研究來確定。

此外，由于sHSPs是非ATP依賴型的伴侶蛋白，目前sHSPs對牛肉品質的影響機制較多的是以蛋白質組學進行的，因此是否可以利用代謝組學等技術尋找代謝通路中某些代謝產物的變化，研究高分子量的HSPs與牛肉品質之間的關系，進而從代謝通路的角度進一步解釋HSPs對牛肉品質的影響機制，是該領域的一個新的研究思路。除此之外，由于肌肉pHu，運輸應激、熱應激等宰前應激和電刺激等宰殺過程中的處理方式、動物基因型、品種以及肌肉部位等均會對HSPs的表達量產生影響，因此如何在今后肉牛生產屠宰加工過程中控制pHu，減少應激產生，進而調控HSPs的表達量，或者以HSPs作為嫩度標記物而實現(xiàn)肉用動物良好基因型的篩選，將是肉類行業(yè)未來發(fā)展方向之一。