槲皮素對(duì)短星翅蝗生長發(fā)育及解毒酶活性的影響

黃訓(xùn)兵，王馨超，李輝

（臨沂大學(xué)農(nóng)林科學(xué)學(xué)院，山東臨沂276000）

植物源化合物的開發(fā)和利用能夠?yàn)楹οx的綠色可持續(xù)防控提供有效策略，是植物保護(hù)研究的重要內(nèi)容。自然界中的植物為抵御病蟲害等逆境脅迫，進(jìn)化形成了相對(duì)完備的防御系統(tǒng)[1-3]。最為關(guān)鍵的是能夠產(chǎn)生大量的植物源化合物，大約有50萬種[2，4-5]。這些植物源化合物作為植物重要的“化學(xué)武器”，可以對(duì)害蟲產(chǎn)生直接抑制作用；也可以通過引誘天敵，實(shí)現(xiàn)害蟲間接控制[6-8]。與傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥相比，植物源化合物的利用可以避免化學(xué)農(nóng)藥帶來的“3R”問題，減少對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的破壞[9-11]。因此，針對(duì)植物源化合物的研究能夠?yàn)楹οx的綠色防控提供新思路和新策略。

為抵御有毒化合物的危害，害蟲進(jìn)化形成了較為全面的防御策略[5]。解毒代謝作為重要的防御策略之一，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的解毒酶和保護(hù)酶，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、細(xì)胞色素P450（CYP450）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST），來抵御植物源化合物的毒害作用[12-14]。這些酶系的變化對(duì)于評(píng)價(jià)植物源化合物的毒害效果及害蟲抗性具有重要作用[5，11]。因此，掌握害蟲對(duì)植物源化合物的酶學(xué)響應(yīng)能夠?yàn)閷ふ液οx防治的新策略和新型生物農(nóng)藥的開發(fā)提供理論依據(jù)。

槲皮素作為一種廣泛存在于植物中的多羥黃酮化合物（C15H10O7·2H2O），是人類能夠開發(fā)的重要植物源化合物，可以抑制美洲棉鈴蟲（Helicoverpa zea）、棉紅鈴蟲（Pectinophora gossypiella）、家蠶（Bombyx mori）等的正常發(fā)育，具有開發(fā)成為生物農(nóng)藥的巨大潛力[15-17]。短星翅蝗（Calliptamus abbreviatus），是發(fā)生于我國北方草地的重要害蟲之一，取食為害紫花苜蓿（Medicago sativa）、冷蒿（Artemisia frigida）、羊草（Leymus chinensis）等飼用牧草，易造成農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)損失[18-19]。目前，對(duì)短星翅蝗的防控主要是應(yīng)用有機(jī)磷類、菊酯類和煙堿·苦參堿等傳統(tǒng)農(nóng)藥，亟待新型生物農(nóng)藥的研發(fā)和創(chuàng)制[20-21]。然而，槲皮素作為重要的植物源化合物，對(duì)短星翅蝗的作用機(jī)理目前尚不清楚，限制了生物農(nóng)藥的開發(fā)。為此，本研究進(jìn)行了短星翅蝗室內(nèi)槲皮素飼喂試驗(yàn)，測(cè)定了短星翅蝗3齡蝗蝻7 d存活率、干重、生長速率、活性氧簇水平以及關(guān)鍵解毒酶活性，旨在初步明確槲皮素對(duì)短星翅蝗生長發(fā)育和主要解毒酶活性的影響，從而為防蝗生物農(nóng)藥的開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲源試驗(yàn)用短星翅蝗采集于內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林浩特市（44°29′41″N，116°50′37″E，海拔1 016 m），網(wǎng)捕法野外采集健康3齡蝗蝻并放入養(yǎng)蟲盒。養(yǎng)蟲盒內(nèi)放入新鮮紫花苜蓿供蝗蝻取食，保證蝗蝻存活，以備進(jìn)一步試驗(yàn)。

1.1.2 主要化學(xué)試劑試驗(yàn)用槲皮素（純度≥98%）購于成都曼思特生物科技有限公司；7-乙氧基香豆素（7-ethoxycoumarin）、核黃素、牛血清蛋白、1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB）、1，2-二氯-4-硝基苯（DCNB）、還原型谷胱甘肽（GSH）及其他常用試劑均購于德國Sigma公司。

1.1.3 主要儀器自制昆蟲掃網(wǎng)（直徑40 cm）、塑料養(yǎng)蟲盒（長30 cm×寬20 cm×高10 cm）、剪刀、LI280A人工氣候箱（冠森生物科技有限公司）、3K15高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司）、恒溫金屬?。劢疸y杏生物科技（北京）有限公司］、Thermo S1368超低溫冰箱（賽默飛世爾蘇州儀器有限公司）、VERSA max酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）、昆蟲活性氧簇（ROS）ELISA檢測(cè)試劑盒（天根生化科技有限公司）等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 短星翅蝗生長發(fā)育測(cè)定隨機(jī)選取野外采集的短星翅蝗3齡蝗蝻（雌蟲）500頭，饑餓處理12 h后隨機(jī)放入25個(gè)養(yǎng)蟲盒，每盒20頭。將放有短星翅蝗的養(yǎng)蟲盒置入人工氣候箱［溫度：（30±1）℃，相對(duì)濕度：（70±5）%，光周期：14 h∶10 h］培養(yǎng)。試驗(yàn)開展前，隨機(jī)選取30頭3齡蝗蝻（雌蟲），于90℃、38 h烘干，電子天平稱取干重（mg），獲得3齡蝗蝻起始干重（mg），以便后期計(jì)算蝗蝻生長速率。以二甲基亞砜（DMSO）為溶劑分別配制0、0.001%、0.01%、0.1%和1%的槲皮素溶液，以短星翅蝗喜食的紫花苜蓿[20]作為食物進(jìn)行飼喂。試驗(yàn)設(shè)置0（CK）、0.001%、0.01%、0.1%和1%槲皮素溶液5個(gè)處理，每個(gè)處理取100 mL配制好的槲皮素溶液，均勻噴灑于45 g新鮮的紫花苜蓿上，然后將處理后的紫花苜蓿放入養(yǎng)蟲盒供蝗蝻取食，每處理重復(fù)5次。每天8：00觀察短星翅蝗存活情況，及時(shí)取出死亡蟲體，并更換新處理的紫花苜蓿。試驗(yàn)持續(xù)7 d后，從每個(gè)養(yǎng)蟲盒中隨機(jī)取出存活蝗蝻2頭并放入凍樣管，標(biāo)記后置入液氮快速冷凍，然后轉(zhuǎn)移到-80℃超低溫冰箱保存，用于后續(xù)酶活性測(cè)定分析。剩余的存活蝗蝻，放入信封，于90℃、38 h烘干，電子天平稱取干重（mg）。計(jì)算蝗蟲發(fā)育指標(biāo)公式

1.2.2 短星翅蝗活性氧簇（ROS）水平測(cè)定從超低溫冰箱中分別取出短星翅蝗樣品，于1 mL磷酸緩沖液（PBS）中勻漿，離心后分裝上清液，用于短星翅蝗活性氧簇（ROS）水平測(cè)定。ROS水平測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試驗(yàn)（雙抗體一步夾心法），操作嚴(yán)格按照ELISA檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。首先向預(yù)先包被酶抗體的微孔中依次加入樣品和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體，溫育后洗滌。然后用底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色。最后用VERSA max酶標(biāo)儀在450 nm波長下測(cè)定OD值，計(jì)算樣品濃度。每處理包含生物學(xué)重復(fù)5次、技術(shù)重復(fù)3次。

1.2.3 短星翅蝗解毒酶活性、保護(hù)酶活性測(cè)定細(xì)胞色素P450（CYP450）活性測(cè)定參照ANDERSON等[22]的方法；谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）活性測(cè)定參照ZHU等[23]的方法；超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定參照BEAUCHAMP等[24]的方法；過氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定參照MAEHLY等[25]的方法。上述酶活性測(cè)定每處理包含生物學(xué)重復(fù)5次、技術(shù)重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SAS 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示：不同濃度槲皮素處理?xiàng)l件下的短星翅蝗3齡蝗蝻7 d存活率、干重、生長速率、ROS水平、CYP450活性、GST活性、SOD活性和CAT活性進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后，差異比較采用Turkey′s HSD方差分析；各指標(biāo)與槲皮素濃度關(guān)系分析采用一元線性回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素處理對(duì)短星翅蝗生長發(fā)育的影響

短星翅蝗生長發(fā)育指標(biāo)分析表明（圖1），0.01%、0.1%和1%槲皮素處理的蝗蝻7 d存活率分別為（74.65±8.12）%、（56.93±8.96）%和（42.32±7.33）%，干重分別為（116.19±9.96）、（109.32±10.38）和（106.27±12.06）mg，生長速率分別為（3.74±1.02）、（2.76±1.29）和（2.32±1.19）mg/d，均顯著（P＜0.05）低于對(duì)照組的（91.36±5.21）%、（152.36±11.6）mg和（8.91±1.86）mg/d，其中，蝗蝻7 d存活率分別下降18.29%、37.69%和53.68%，干重分別下降23.74%、28.25%和30.25%，生長速率分別下降58.02%、69.02%和73.96%；短星翅蝗蝗蝻7 d存活率（y=-12.738x+108.510 R2=0.967 1）、干重（y=-12.205x+161.280 R2=0.917 4）和生長速率（y=-1.744x+10.183 R2=0.902 1）與槲皮素濃度顯著（P＜0.05）線性負(fù)相關(guān)。

圖1 不同槲皮素濃度處理對(duì)短星翅蝗蝗蝻7 d存活率、干重和生長速率的影響

2.2 槲皮素處理對(duì)短星翅蝗活性氧簇（ROS）水平的影響

ROS水平分析表明（圖2），0.01%、0.1%和1%槲皮素處理的蝗蝻體內(nèi)ROS水平分別為（168.97±32.13）、（236.25±41.32）和（221.98±32.96）pg/g，顯著（P＜0.05）高于對(duì)照組的（86.36±22.32）pg/g，分別上升95.66%、173.56%和157.04%；短星翅蝗體內(nèi)ROS水平（y=38.484x+51.790 R2=0.909 1）與槲皮素濃度顯著（P＜0.05）線性正相關(guān)。

圖2 不同槲皮素濃度處理對(duì)短星翅蝗ROS水平的影響

2.3 槲皮素處理對(duì)短星翅蝗解毒酶活性的影響

解毒酶活性分析表明（圖3），0.001%、0.01%、0.1%和1%槲皮素處理的蝗蝻體內(nèi)CYP450活性分別為（179.35±29.38）、（253.62±32.96）、（282.13±41.36）和（319.65±45.92）U/g，GST活性分別為（99.52±24.32）、（112.87±23.69）、（136.28±26.98）和（155.36±31.09）U/g，均顯著（P＜0.05）高于對(duì)照組的（116.29±22.98）和（46.29±17.18）U/g，其中，CYP450活性分別上升54.23%、118.09%、142.61%和174.87%，GST活性分別上升114.99%、143.83%、194.41%和235.62%；CYP450活性（y=50.950x+77.358 R2=0.968 3）、GST活性（y=25.490x+33.594 R2=0.938 2）與槲皮素濃度顯著（P＜0.05）線性正相關(guān)。

圖3 不同槲皮素濃度處理對(duì)短星翅蝗解毒酶活性的影響

2.4 槲皮素處理對(duì)短星翅蝗保護(hù)酶活性的影響

保護(hù)酶活性分析表明（圖4），0.001%、0.01%、0.1%和1%槲皮素處理的蝗蝻體內(nèi)SOD活性分別為（208.13±32.29）、（221.65±42.39）、（249.32±36.19）和（262.68±43.62）U/g，CAT活性分別為（119.23±26.98）、（156.28±29.31）、（149.53±26.36）和（169.68±32.19）U/g，均顯著（P＜0.05）高于對(duì)照組的（126.32±28.36）和（39.12±12.23）U/g，其中，SOD活性分別上升64.76%、75.47%、97.37%和107.95%，CAT活性分別上升204.78%、299.49%、282.23%和333.74%；SOD活性和CAT活性與槲皮素濃度呈線性正相關(guān)關(guān)系，但相關(guān)性不顯著（P＞0.05）。

圖4 不同槲皮素濃度處理對(duì)短星翅蝗保護(hù)酶活性的影響

3 討論與結(jié)論

自然界中，許多植物源化合物能夠干擾害蟲的正常生長發(fā)育和生殖，對(duì)害蟲產(chǎn)生毒害作用[26-27]，具有生物農(nóng)藥開發(fā)的潛力。例如，基于植物源化合物煙堿、苦參堿、印楝素開發(fā)的生物農(nóng)藥，被大量用于防治鱗翅目、直翅目和半翅目害蟲[17，28-29]。與以上研究結(jié)果一致，本研究表明，槲皮素處理的短星翅蝗生長速率和蝗蝻7 d存活率顯著降低，且與槲皮素濃度顯著負(fù)相關(guān)。由此可見，槲皮素對(duì)短星翅蝗表現(xiàn)出了一定的抑制生長作用，且槲皮素濃度越高抑制作用越強(qiáng)。從蝗蟲生長抑制和存活率降低的角度來看，槲皮素具有防蝗生物農(nóng)藥開發(fā)和利用的潛在價(jià)值。

有毒植物源化合物的攝入能夠?qū)е律矬w內(nèi)活性氧簇（ROS）水平的升高，進(jìn)而誘發(fā)程序性細(xì)胞死亡，引起組織氧化損傷，不利于生命體的正常生長發(fā)育[30]。ROS水平能夠在一定程度上反映生命體所受的毒害脅迫程度。例如，攝入印楝素等有毒植物源化合物的害蟲體內(nèi)ROS水平顯著升高，害蟲發(fā)育受到顯著抑制[31-33]。同樣，本研究表明，槲皮素處理的短星翅蝗蝗蝻體內(nèi)ROS水平顯著升高（R2=0.909 1），且與槲皮素濃度顯著正相關(guān)。在一定范圍內(nèi)，ROS水平的提高說明槲皮素能夠引發(fā)短星翅蝗氧化損傷，且槲皮素濃度越高對(duì)蝗蟲的氧化損傷作用越強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致短星翅蝗生長速率和存活率的降低。

為應(yīng)對(duì)有毒植物源化合物造成的損傷破壞，害蟲可以產(chǎn)生大量解毒酶來轉(zhuǎn)化或降解有毒物質(zhì)以減輕組織傷害[5，13-14]；也可以通過產(chǎn)生保護(hù)酶來減輕組織氧化損傷，以保證個(gè)體發(fā)育和生存，維持種群繁衍[32，34]。本研究表明，與對(duì)照組相比，攝入槲皮素的短星翅蝗解毒酶（CYP450、GST）和保護(hù)酶（SOD、CAT）活性均顯著升高。由此可見，短星翅蝗可以通過CYP450、GST發(fā)揮解毒代謝作用來轉(zhuǎn)化或降解槲皮素，以減輕槲皮素的破壞作用；也可以通過SOD、CAT的抗氧化作用來減輕ROS引起的氧化損傷。害蟲的解毒和抗氧化過程需要能量成本，是一個(gè)高耗能過程[5，35]。研究表明，眾多的解毒酶和保護(hù)酶發(fā)揮作用需要消耗大量能量，從而減少害蟲生長發(fā)育方面的能量投入[36]。短星翅蝗解毒酶和保護(hù)酶活性的升高，預(yù)示著需要消耗大量能量來抵御槲皮素的毒害作用，而生長發(fā)育方面的能量投入減少（表型消耗），這也是其生長速率降低的原因之一。

本研究僅通過室內(nèi)飼喂試驗(yàn)初步探究了不同濃度槲皮素處理對(duì)短星翅蝗生長發(fā)育、ROS水平、解毒酶活性和保護(hù)酶活性的影響，但缺少胃毒數(shù)據(jù)。為了更好地掌握槲皮素對(duì)短星翅蝗的作用機(jī)理，下一步將精確定量地分析短星翅蝗槲皮素?cái)z入量與其生長發(fā)育的關(guān)系，并提供充分的胃毒數(shù)據(jù)。同時(shí)，還會(huì)進(jìn)行槲皮素對(duì)短星翅蝗致死中濃度（LC50）、致死中量（LD50）和致死中時(shí)間（LT50）影響的研究。另外，槲皮素應(yīng)用到短星翅蝗的綠色防控仍有許多問題需要解決，如劑型的開發(fā)、防治效率的提高、合理的使用方法以及在自然環(huán)境下的防治效果等。

研究表明，槲皮素處理能夠?qū)е露绦浅峄?齡蝗蝻7 d存活率、生長速率降低，蝗蝻體內(nèi)活性氧簇（ROS）水平上升，解毒酶、保護(hù)酶活性升高；槲皮素對(duì)短星翅蝗具有一定抑制生長作用，在短星翅蝗綠色防控和生物農(nóng)藥開發(fā)方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。