含銅L605鈷基合金材料對血管內(nèi)皮化的影響

戚 勛，王 鵬，張書源，徐 克*

(1.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院放射科 遼寧省影像診斷與介入治療重點實驗室，遼寧 沈陽 110002；2.中國科學院金屬研究所，遼寧 沈陽 110016)

下肢動脈硬化閉塞癥指下肢動脈因動脈粥樣硬化病變致管腔進行性狹窄或閉塞[1]，發(fā)病率逐年升高。以血管支架植入術(shù)為主的介入手段現(xiàn)已成為動脈粥樣硬化所致下肢動脈狹窄/閉塞性病變、尤其是長段閉塞性病變的首選治療方法[2-3]，展現(xiàn)出諸多優(yōu)勢，但術(shù)后支架內(nèi)再狹窄(in-stent restenosis, ISR)風險嚴重影響中、遠期療效，并限制其廣泛應用[4]。與第一代支架體材料不銹鋼相比，第二代藥物洗脫支架體材料L605鈷基合金具有更高的抗拉強度，在保持支架原有徑向張力的同時小梁更細，有利于降低ISR發(fā)生率[5]，臨床應用廣泛。但是，目前已用于臨床的藥物洗脫支架存在晚期ISR風險，其主要發(fā)生機制在于藥物洗脫涂層完全降解后，藥物已完全釋放而不能發(fā)揮生物學功能，但此時內(nèi)皮化不完全，平滑肌細胞過度增殖，促進ISR發(fā)生[6]。銅離子是人體內(nèi)必需的微量金屬元素，人體每天需攝入足夠量銅離子，以維持正常生理功能[7]。研究[8-10]表明，在金屬支架體材料中加入適量銅元素，經(jīng)過特殊熱處理，可在維持原有力學支撐力的同時均勻彌散分布富銅相；銅在人體體液中易發(fā)生腐蝕，可微量和持續(xù)釋放銅離子，以發(fā)揮微量銅的生物學功能。既往研究[11]發(fā)現(xiàn)，316L-Cu不銹鋼具有良好的促進內(nèi)皮化作用。本研究觀察不同含銅量L605鈷基合金材料對血管內(nèi)皮化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilicus endothelial cell， HUVEC)購于南京凱基生物，將其接種于含10%胎牛血清(fetal bovine serum， FBS)、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，待細胞生長融合至80%～90%用于實驗。細胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8， CCK-8)購于日本Dojindo公司，Transwell小室購于美國Millipore，基質(zhì)膠購于美國BD公司，青霉素、鏈霉素、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)、RPMI 1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶均購于南京凱基生物。

1.2 制備浸提液 根據(jù)ISO 10993-5規(guī)定，分別取尺寸為Φ10 mm×1 mm的L605-2.0 Cu(含銅量2.0wt%)、L605-2.5 Cu(含銅量2.5wt%)、L605-3.5 Cu(含銅量3.5wt%)及L605鈷基合金，以121℃高溫高壓蒸汽滅菌30 min后，于無菌條件下制備浸提液，以1.25 cm2/ml浸泡于RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72 h后取出浸提液進行后續(xù)實驗。

1.3 檢測細胞增殖能力 采用CCK-8檢測共培養(yǎng)條件下L605鈷基合金對細胞增殖的影響。將80%～90%融合細胞隨機分為4組，即L605-2.0 Cu組、L605-2.5 Cu組、L605-3.5 Cu組及L605組，分別于96孔板中加入尺寸為Φ5 mm×1 mm的相應L605鈷基合金，每組設(shè)5個復孔。將HUVEC制成濃度為3×104/ml的細胞懸液，分別取100 μl加至各組96孔板中，培養(yǎng)48 h后吸出原有培養(yǎng)基，加入含0.5% FBS培養(yǎng)液預處理24 h，使細胞同步化；再培養(yǎng)24 h后，吸出培養(yǎng)液，加入培養(yǎng)液及CCK-8預混液110 μl(體積比10∶1)。于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育2.5 h后，取出樣品，放入酶標儀(Multiskan GO，Thermo Scientific)，于450 nm波長處檢測光密度(optical density, OD)值。

1.4 檢測細胞遷移能力 采用Transwell小室法檢測L605鈷基合金材料對細胞遷移能力的影響。取80%～90%融合細胞，吸出原培養(yǎng)基，加入含0.5% FBS的培養(yǎng)液預處理24 h后，使用無血清培養(yǎng)基將細胞制成濃度為3×104/ml的細胞懸液，取100 μl細胞懸液加入至Transwell上室，下室分別加入L605、L605-2.0 Cu、L605-2.5 Cu和L605-3.5 Cu浸提液600 μl，每組設(shè)3個復孔。在37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出小室，棄去培養(yǎng)液，用無鈣PBS漂洗2遍后，以95%乙醇固定30 min；將小室適當風干，用0.1%結(jié)晶紫染色20 min后，以棉簽輕拭，去除上層未遷移細胞，以PBS漂洗3遍。于顯微鏡下隨機挑選5個視野觀察細胞并記數(shù)。

圖2 各組內(nèi)皮細胞與不同浸提液作用后小管形態(tài)、長度及分支數(shù)(×400) A.L605組； B.L605-2.0 Cu組； C.L605-2.5 Cu組； D.L605-3.5 Cu組

1.5 檢測血管生成能力 采用內(nèi)皮細胞小管形成實驗觀察L605鈷基合金對血管生成能力的影響。取80%～90%融合細胞，吸出原培養(yǎng)基，加入含0.5% FBS的培養(yǎng)液預處理24 h備用。向96孔板中的每孔加入50 μl Matrigel基質(zhì)膠，置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育30 min，待基質(zhì)膠凝固后備用。預處理細胞消化后，每孔加入100 μl濃度為5×105/ml的細胞懸液，并分別加入100 μl含10% FBS的L605鈷基合金浸提液，置于37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育3 h，在倒置顯微鏡下觀察，使用ImageJ軟件量化小管長度及節(jié)點數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用PRISM 6.0統(tǒng)計分析軟件。計量資料以±s表示，以單因素方差分析行多樣本間比較，組間兩兩比較采用Bonferroni校正t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

以不同含銅量L605鈷基合金干預細胞48 h后，L605-3.5 Cu組OD值高于L605組(P<0.05)，L605-2.5 Cu組、L605-2.0 Cu組與L605組OD值差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。將不同含銅量L605鈷基合金浸提液與細胞共培養(yǎng)24 h后，各組細胞形態(tài)均良好，L605-3.5 Cu組穿膜細胞數(shù)高于L605組、L605-2.0 Cu組(P均<0.01)，L605-2.0 Cu組與L605組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；L605-3.5 Cu組小管生成總長度及節(jié)點數(shù)均高于其他3組(P均<0.01)，L605-2.5 Cu組、L605-2.0 Cu組與L605組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見圖1、2及表1。

圖1 各組Transwell實驗中細胞遷移情況(結(jié)晶紫染色，×200) A.L605組； B.L605-2.0 Cu組； C.L605-2.5 Cu組； D.L605-3.5 Cu組

表1 不同含銅量L605鈷基合金組間OD值、穿膜細胞數(shù)、小管生成總長度及節(jié)點數(shù)比較(±s)

表1 不同含銅量L605鈷基合金組間OD值、穿膜細胞數(shù)、小管生成總長度及節(jié)點數(shù)比較(±s)

組別OD值穿膜細胞數(shù)(個)小管生成總長度(mm)節(jié)點數(shù)(個)L605組0.60±0.0483.00±21.4411.71±1.6027.00±3.16L605-2.0 Cu組0.61±0.0381.00±8.92**11.24±1.3928.60±6.35L605-2.5 Cu組0.64±0.0198.20±13.4112.38±2.0230.60±7.13L605-3.5 Cu組0.68±0.05*126.00±17.64**19.70±1.63**#&47.40±8.85**#&F值4.4008.37728.3709.953P值0.0190.001<0.001<0.001

注：*：與L605組比較，P<0.05；**：與L605組比較，P<0.01；#：與L605-2.0 Cu組比較，P<0.01；&：與L605-2.5 Cu組比較，P<0.01

3 討論

近年來，藥物洗脫支架研究進展迅速。目前臨床用于治療下肢動脈病變的自膨式記憶合金藥物洗脫支架主要以紫杉醇作為洗脫涂層藥物。既往研究[4,12]表明，紫杉醇在抑制平滑肌細胞增殖的同時阻礙內(nèi)皮細胞增殖，導致血管內(nèi)皮化不完全，血管自然愈合延遲，使晚期血栓形成發(fā)生率較高。一項多中心臨床試驗[13]對比觀察雷帕霉素藥物洗脫支架與裸支架治療股淺動脈病變效果，發(fā)現(xiàn)術(shù)后隨訪6個月時藥物洗脫支架通暢率稍高于裸支架，但隨訪24個月時二者通暢率無明顯差異，原因在于藥物洗脫涂層隨時間延長而逐漸降解，藥物完全釋放后不具有生物學功能，此時內(nèi)皮化尚不完全，平滑肌細胞過度增殖而促進ISR發(fā)生[6]。

銅為重金屬元素，銅離子不僅抑制血栓形成，還能有效促進內(nèi)皮細胞增殖并抑制平滑肌細胞過度增殖[14]。根據(jù)既往研究[11,15]結(jié)果，同時考慮到銅對力學性能的影響，本研究分別制備含銅量為2.0wt%、2.5wt%和3.5wt%的L605鈷基合金，使其既能提高支架材料自身的生物性能，又可保證生物安全性，以期解決支架植入后中、遠期再狹窄問題。

內(nèi)皮細胞增殖、遷移及小管生成是評價血管內(nèi)皮化的重要指標[16]。內(nèi)皮細胞增殖、遷移能力增強促進管腔結(jié)構(gòu)形成。本研究以CCK-8檢測各組材料對細胞增殖能力的影響，采用Transwell小室實驗檢測細胞遷移能力，以小管生成實驗觀察血管形成能力。本研究結(jié)果顯示，L605-3.5 Cu促進HUVEC增殖效應最顯著，酶標儀檢測L605-3.5 Cu的OD450為L605的1.13倍，表明L605-3.5 Cu可顯著促進內(nèi)皮細胞增殖；與L605、L605-2.0 Cu和L605-2.5 Cu浸提液相比，L605-3.5 Cu浸提液可顯著增加內(nèi)皮細胞小管生成的小管生成總長度和節(jié)點數(shù)。上述體外實驗研究結(jié)果證實L605-3.5 Cu合金具有明顯促內(nèi)皮化作用，有望解決預防ISR難題，為L605-3.5 Cu合金體內(nèi)試驗和臨床應用提供了實驗依據(jù)。

綜上，含銅L605鈷基合金材料可促進血管內(nèi)皮化，體外實驗結(jié)果顯示以含銅量為3.5wt%的L605-3.5 Cu效果最顯著，值得后續(xù)研究并進行深入觀察。