雙酵母混合液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)楊梅果酒

李曉娟

株洲千金藥業(yè)股份有限公司（株洲 412000）

楊梅（Myrica rubra（Lour.）Sieb.et Zucc.）是我國傳統(tǒng)特色水果，野生楊梅已有7 000年的歷史，種植也有2 000年的歷史[1]。中醫(yī)認為，楊梅味甘酸，具有生津止渴和健胃消食等功效[2]，是釀造果酒的優(yōu)良原料。周艷華等[3]采用楊梅和火龍果皮釀造高花色苷的保健楊梅果酒；Chang等[4]采用糯米水解糖液和紅曲等固態(tài)發(fā)酵釀制富含氨基酸、礦質(zhì)元素和香氣的楊梅果酒。酯影響果酒品質(zhì)，釀造時不僅要保證酒精度而且要提高酯的生成，助于酒香[4-5]，而發(fā)酵溫度和酒精度影響酯生成[6]。雜醇油是酒精發(fā)酵過程中的副產(chǎn)物，不利果酒質(zhì)量[7-8]。郝瑞穎等[9]研究了葡萄酒釀制的香氣，其雜醇油高于300 mg/L降低葡萄酒質(zhì)量。酵母菌包括釀酒和非釀酒酵母[10]，釀酒酵母活性高，生成酒體中的酒精度[11]，非釀酒酵母促進酒體的風味物質(zhì)形成[12]，包括畢赤酵母[13]、假絲酵母[14]和梅奇酵母[15]等。兩種酵母混釀可提升果酒品質(zhì)和豐富風味口感[16]。安琪干酵母在較低營養(yǎng)能發(fā)酵，耐受性強、酒香豐富。產(chǎn)朊假絲酵母被美國食品藥品監(jiān)督局認定為一種安全和可作為食品添加劑[17]，我國原衛(wèi)生部也將其允許用于保健食品。Chavan等[18]研究天然酵母和非釀酒酵母菌群在葡萄酒發(fā)酵過程中的影響，以便提高葡萄酒質(zhì)量。

液態(tài)發(fā)酵法釀造果酒發(fā)酵速度快、易于控制[19]。因此，此次試驗研究雙酵母混合液態(tài)釀造楊梅果酒綜合技術(shù)，在實現(xiàn)快速發(fā)酵，滿足酒精度和酯香好的雙重目標，并使雜醇油得到合理控制，為快速生產(chǎn)品質(zhì)優(yōu)良的楊梅果酒提供理論和方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

東槐楊梅，產(chǎn)于福建省長汀縣；安琪葡萄酒干酵母 BV818、RV171，Angel酵母股份有限公司；產(chǎn)朊假絲酵母CU-6，中國工業(yè)微生物菌種保藏中心（CICC）；大豆多肽，菏澤中食肽好生物制品廠；酵母提取粉（BR），廣東凱微生物科技有限公司；胰蛋白胨（BR）、瓊脂粉（BR）、偏重亞硫酸鉀（AR）、碳酸氫鈉（AR），國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖（AR），上海實驗試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

LZ-0.5型小型螺旋榨汁機，江蘇科威機械有限公司；TDL-5-A型低速離心機，上海安亭科學儀器廠；DHG-9000型恒溫干燥箱，上海精宏試驗設(shè)備有限公司；UV-1100型分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；TC8400001型自動測氮儀，F(xiàn)OSS；RE-2200A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；Sartorius普及型pH計，合肥橋斯儀器設(shè)備有限公司；YXQ-LS-18SII型全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；NSKY-200B型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海蘇坤實業(yè)有限公司；YXQ-LS-18SII型全自動立式電熱蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司；Blue Pard型隔水式培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；YXQ-LS-18SII型全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；A199型GC，Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 測定指標及分析方法

還原糖：直接滴定法，按GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測定》執(zhí)行；總糖：直接滴定法[20]；總氮：凱氏定氮法[21]；氨基酸態(tài)氮：雙指示劑甲醛滴定法；pH：pH計法[22]；可滴定酸：電位滴定法[23]；可溶性固形物：折光儀法；總果膠：重量法[24]；酵母數(shù)：按GB/T 4789.15—2010《食品微生物檢驗霉菌和酵母計數(shù)》執(zhí)行；酒精度：按GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》酒精計法執(zhí)行；甲醇和雜醇油：氣相色譜法，按GB/T 5009.48—2003《蒸餾酒與配制酒衛(wèi)生標準的分析方法》執(zhí)行。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析方法

應(yīng)用Design Expert（Version 8.0.6）軟件進行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊梅果汁的理化指標

從表1可看出，楊梅汁的含糖質(zhì)量分數(shù)適中，酸度較高，總氮質(zhì)量分數(shù)低，需適度降酸、提高糖度和添加氮源以滿足酵母生長和風味成分。

表1 楊梅果汁的理化指標

2.2 酵母的選擇

2.2.1 酵母菌種的確定

接種量為0.4%，初始還原糖為24 g/100 g，發(fā)酵溫度為24 ℃。由圖1、圖2和表2可知，安琪酵母發(fā)酵時還原糖2 d內(nèi)快速下降；CU-6發(fā)酵4 d內(nèi)還原糖緩慢降低，發(fā)酵周期較長。兩種安琪發(fā)酵前期酵母數(shù)增長快而CU-6較慢，到第3天后生長明顯加快，安琪BV818、RV171發(fā)酵時酒體酒精度相對比較高、殘?zhí)橇枯^低，BV818發(fā)酵的酒精度達12.6%vol，總酯為1.47 mg/L。CU-6發(fā)酵時總酯最高，達到1.76 mg/L，口感較協(xié)調(diào)，因產(chǎn)朊假絲酵母能改善果酒風味，使果香濃郁[27-28]，所以選擇發(fā)酵速率最快的BV818和產(chǎn)酯能力最強的CU-6混合發(fā)酵，以達到產(chǎn)酒和產(chǎn)酯能力好的雙目標。

表2 三種酵母的酒精發(fā)酵效果對比

圖1 不同酵母對楊梅果酒還原糖的影響

圖2 不同酵母對楊梅果酒酵母數(shù)的變化

2.2.2 酵母比例的確定

初始還原糖為24 g/100 g，發(fā)酵溫度為24 ℃，接種量為0.4%。由圖3和圖4可看出，采用BV818和CU-6體積比1∶1，1∶1.5和1∶2發(fā)酵時還原糖下降相對緩慢，酵母生長較慢；1.5∶1和2∶1時，還原糖下降較快，酵母生長也較好。體積比為1∶1發(fā)酵時速度慢。經(jīng)檢測，發(fā)酵至7 d時，殘?zhí)橇繛?.54 g/100 g，總酯質(zhì)量濃度為2.81 mg/L，經(jīng)品嘗酒質(zhì)柔爽，果香、酒香濃郁。因此，BV818和CU-6的體積比以1∶1為宜。

圖3 酵母體積比對楊梅果酒還原糖的影響

圖4 酵母體積比對楊梅果酒酵母數(shù)的影響

2.2.3 多肽添加量的確定

混合酵母接種量為0.4%，初始還原糖為24 g/100 g，于24 ℃進行發(fā)酵。從圖5和圖6可看出，多肽0～2 g/L時，還原糖下降和酵母數(shù)增加緩慢，說明氮源不足以維持酵母生長，酒質(zhì)混濁。多肽4～6 g/L時，還原糖下降和酵母數(shù)增加相對較快，酒質(zhì)較柔爽，說明多肽能滿足發(fā)酵過程中所需氮源；多肽4 g/L，發(fā)酵至7 d時酒精度為8.9%vol，總酯質(zhì)量濃度為2.68 mg/L，發(fā)酵情況最好，酒香、果香濃郁；高于8 g/L時，還原糖下降較快，酵母生長過剩，酵母衰老。因此，多肽選擇4 g/L左右為宜。

圖5 多肽添加量對楊梅果酒還原糖的影響

圖6 多肽添加量對楊梅果酒酵母數(shù)的影響

2.3 酒精發(fā)酵的單因素試驗與分析

調(diào)整楊梅汁初始還原糖24 g/100 g、多肽4 g/L、雙酵母體積比1∶1，從圖7可看出，酵母0.4%發(fā)酵至第7天時，酒精度為13.1%vol，總酯為2.68 mg/L，均最高，酒質(zhì)柔爽；酵母過高酒精度反而降低，使楊梅果酒酒香不足，說明發(fā)酵過于旺盛。18～22 ℃時，發(fā)酵緩慢，酒精度不高；24 ℃時，酒精度增長最快；28 ℃第3天后，酒精度隨之降低，因溫度過高，酵母衰老快。pH 3.8發(fā)酵速度較快，至第7天時酒精度為12.9%vol，之后發(fā)酵速度稍下降。當SO2低于20 mg/L時，隨SO2的增加，發(fā)酵速度加快，酒精度增加；SO2為40 mg/L時發(fā)酵狀況最好，SO2再增加反而酒精度降低。單因素試驗結(jié)果表明，楊梅果酒酒精發(fā)酵以酵母接種量0.4%，溫度24 ℃，SO240 mg/L，pH 3.8為宜。

圖7 單因素對楊梅果酒酒精度的影響

2.4 響應(yīng)面分析法優(yōu)化酒精發(fā)酵工藝條件

在酒精發(fā)酵的單因素試驗與分析的基礎(chǔ)上，選取對酒精發(fā)酵過程影響較大的接種量（X1，BV818和產(chǎn)朊CU-6的體積比為1∶1）、溫度（X2）、SO2添加量（X3）三個因子作為考察因素，選擇酒精度和總酯含量作為響應(yīng)值，優(yōu)化酒精發(fā)酵工藝。試驗條件為初始還原糖24 g/100 g、多肽添加量4 g/L、初始pH 3.8，發(fā)酵時間7 d。因素水平見表3，試驗結(jié)果見表4。

表3 楊梅果酒因素水平表

表4 楊梅果酒試驗設(shè)計方案及結(jié)果

采用Design Expert（Version 8.0.6）對表3中的數(shù)據(jù)進行回歸分析，計算出回歸方程各系數(shù)，得到各個因素與楊梅果酒的酒精度Y1和總酯Y2多元二次回歸方程式：

由表5可知，楊梅果酒中酒精度和總酯檢驗極顯著（p＜0.01），失擬項不顯著（p＞0.05），說明數(shù)據(jù)的相關(guān)度高，擬合性好。

表5 回歸檢驗方差分析

接種量對楊梅果酒酒精度和總酯影響極顯著（p＜0.01），溫度影響為顯著（p＜0.05），SO2添加量的影響不顯著。影響因素主次順序為接種量＞溫度＞SO2添加量。二次項的接種量、溫度、SO2添加量均極顯著（p＜0.01）。接種量與溫度的交互作用極顯著（p＜0.01），接種量與SO2添加量的交互作用顯著。

綜上所述，響應(yīng)面分析法優(yōu)化楊梅果酒酒精發(fā)酵的最優(yōu)工藝參數(shù)為接種量0.3%、溫度24 ℃、SO2添加量55 mg/L、初始還原糖24 g/100 g、pH 3.8、多肽添加量4 g/L、發(fā)酵時間7 d。在此條件下，楊梅果酒的酒精度為12.7%vol，總酯含量為3.22 mg/L。

2.5 陳釀前后楊梅果酒中的甲醇及雜醇油對比

甲醇由果膠水解、甘氨酸脫羧反應(yīng)生成，有較強的毒性，經(jīng)消化道迅速吸收代謝產(chǎn)生甲酸和甲醛，損傷視覺和腦神經(jīng)細胞，嚴重可致失明[29]。雜醇油由發(fā)酵中氨基酸和蛋白質(zhì)降解代謝產(chǎn)生，以戊醇、丙醇、丁醇、苯乙醇、苯甲醇為主[30]。若雜醇油質(zhì)量濃度過高，則出現(xiàn)苦澀味，可引起頭痛等癥狀。目前我國相關(guān)標準尚未對果酒中的甲醇及雜醇油限定。葡萄酒中雜醇油質(zhì)量濃度一般在250～350 mg/L之間[31]。因此，可以此為參照對楊梅果酒進行判定。通常果酒的陳釀期為90～180 d。

從表6可以看出，陳釀前酒體中均未檢出甲醇，雜醇油質(zhì)量濃度為290.37 mg/L，總量處于標準要求的水平，說明酵母和酒精發(fā)酵工藝合理，發(fā)酵溫度高是產(chǎn)生甲醇和雜醇偏高的主要原因[32]。陳釀前異戊醇質(zhì)量濃度最高，為148.00 mg/L；異丁醇質(zhì)量濃度亦較高，為45 mg/L。異戊醇、異丁醇是由發(fā)酵的中間產(chǎn)物丙酮酸或乙醛生成的。酵母將酒中多的氨基酸轉(zhuǎn)化為高級醇，部分直接轉(zhuǎn)化為酯類和有機酸，后期與高級醇反應(yīng)生成酯[30]。因此，通過陳釀，酒體中的雜醇油的質(zhì)量濃度進一步降低，并可提高酒的柔爽性。陳釀60 d時，雜醇油由陳釀前的290.38 mg/L降至168.22 mg/L，降低42.07%，異戊醇由148 mg/L降低至84.02 mg/L，減少43.23%；其他醇相應(yīng)減??；陳釀至90 d時，雜醇油含量較陳釀至60 d時的相差很小，陳釀60 d和90 d的楊梅果酒酒質(zhì)柔爽、酒香濃郁，口感相差不大，明顯好于未陳釀的果酒。

3 結(jié)論

安琪酵母BV818的酒精發(fā)酵能力強，產(chǎn)朊假絲酵母CU-6的產(chǎn)酯能力好。當BV818和CU-6體積比為1∶1時，酒體的酒精度和總酯質(zhì)量濃度均較高。楊梅汁中含氮量比較低，不足以提供酵母生長的需要。利用大豆多肽補氮源，多肽為4 g/L適宜。通過單因素試驗和響應(yīng)面分析法確定楊梅果酒的酒精發(fā)酵工藝，當初始還原糖24 g/100 g、初始pH 3.8、多肽4 g/L、接種量0.3%、溫度24 ℃、SO255 mg/L時，發(fā)酵7 d后楊梅果酒的酒精度可達12.5%vol、總酯質(zhì)量濃度為3.16 mg/L。采用氣相色譜法對陳釀前后的楊梅果酒中甲醇和雜醇油進行測定分析，未檢出甲醇；陳釀60 d后果酒中雜醇油質(zhì)量濃度即可降至適當?shù)乃剑铱诟?、風味皆好。