甘薯可食用部位綠原酸合成及相關(guān)基因表達(dá)特征分析

禹 陽，林 歡，王云鵬，馬佩勇，賈趙東，謝一芝，邊小峰

(1. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，南京 210014；2. 淮陰工學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇淮安 223003)

在中國，甘薯作為僅次于水稻、小麥和玉米的主要糧食作物，不僅富含人們?nèi)粘Ｋ璧母鞣N營養(yǎng)成分，還含有大量功能性成分，如綠原酸(Chlorogenic acid，CGA)、黃酮類、脫氫表雄酮等[1]。

綠原酸是植物苯丙素類次生代謝產(chǎn)物之一，具有多種生物活性，如抗氧化、抗病毒、抑菌、調(diào)節(jié)糖脂代謝等[2-4]。狹義上，綠原酸指由咖啡酸(Caffeic acid)與奎寧酸(Quinic acid)組成的咖啡單寧酸(5-O-Caffeoylquinic acid)[5]。綠原酸在植物中通常以多種異構(gòu)體形式共存，因此廣義上的綠原酸系指由奎寧酸與反式肉桂酸(trans-Cinnamic acids)縮合而成的酯類化合物家族，常見的反式肉桂酸有咖啡酸、p-香豆酸(p-Coumaric acid)和阿魏酸(Ferulic acid)[6-7]。甘薯可食用部位中均含有綠原酸，包括葉、莖、葉柄及儲藏根，其中葉中含量較高[8-9]。

目前，已報(bào)道的綠原酸合成途徑在不同植物間存在一定差異，但基本包括苯丙氨酸解氨酶(L-phenylalanin ammonia-lyase，PAL)、肉桂酰-4-羥化酶(Cinnidine-4-hydroxylase，C4H)、4-羥基桂皮酰輔酶A連接酶(4-coumaroyl-CoA-ligase，4CL)、羥基桂皮酰輔酶A莽草酸/奎尼酸羥基桂皮酰轉(zhuǎn)移酶(Hydroxycinnamoyl-CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyl transferase，HCT)、香豆酸羥基化酶(p-Coumarate3-hydroxylase，C3H)、羥基桂皮酰輔酶A奎尼酸羥基轉(zhuǎn)移酶(Hydroxycinnamoyl-CoA quinate hydroxycinnamoyl transferase，HQT)和UDP葡萄糖肉桂酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP glucose: cinnamate glucosyl transferase，UGCT)等關(guān)鍵酶基因[10]。

有關(guān)甘薯綠原酸的研究多集中于其提取和生物活性，對其合成調(diào)控尚未見報(bào)道，其合成過程中參與的重要酶、關(guān)鍵基因和調(diào)控因子都急需分析研究?；谵D(zhuǎn)錄組分析及同源克隆，Yu等[11]已從甘薯栽培種(‘蘇薯16號’，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育)中分離克隆了部分甘薯綠原酸合成途徑相關(guān)酶基因?；诖耍狙芯恳?種不同類型甘薯品種為材料，通過分析不同甘薯品種可食用部位中綠原酸含量和合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)差異，探討甘薯可食用部位中綠原酸合成與相關(guān)基因組織表達(dá)的關(guān)系，為培育高綠原酸含量甘薯品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與樣品準(zhǔn)備

供試品種包括3個葉菜用型甘薯品種‘福薯7-6’(Fushu 7-6，F(xiàn)7-6)‘福菜薯18號’(Fucaishu No.18，F(xiàn)C18)及‘寧菜薯1號’(Ningcaishu No.1，NC1)和3個鮮食型甘薯品種‘蘇薯16號’(Sushu No.16，S16)‘寧紫薯1號’(Ningzishu No.1，NZ1)及‘寧紫薯4號’(Ningzishu No.4，NZ4)(表1)。

表1 6個供試品種概況Table 1 Six tested-cultivars

試驗(yàn)材料于2018年5月28日在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)地栽插，種植和田間管理按常規(guī)方法進(jìn)行。每品種3行，每行10株，行株距為 80 cm×25 cm。綠原酸含量測定樣品采集：于8月1日地上莖葉封壟后采收莖尖(第5片完全葉以上部位)，10月25日收獲儲藏根。選取長勢一致、無病蟲害的莖尖和儲藏根為試驗(yàn)材料，105 ℃殺青30 min，65 ℃烘干后粉碎，過40目篩后密封低溫保存?zhèn)溆谩；虮磉_(dá)分析樣品采集：于8月1日每品種隨機(jī)選取5株長勢一致、無病蟲害的植株，分別采取莖尖(第5片完全葉以上部位，Stem-apex)和儲藏根(Storage root)，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱，備用。

1.2 甘薯綠原酸提取及測定

1.2.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品購于Sigma公司，準(zhǔn)確稱取5.00 mg，加50%甲醇超聲溶解定容于50 mL容量瓶。制成的標(biāo)準(zhǔn)液經(jīng)紫外分光光度計(jì)200～400 nm波長掃描，得到綠原酸的最大吸收峰327 nm。將0.1 mg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別稀釋成1,2,5,10,20 μg/mL，在吸收光波長327 nm處測定其吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)液濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)x，吸光值為縱坐標(biāo)y，作出綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：y= 59.411x+ 0.023(R2=0.995 6)。

1.2.2 樣品綠原酸含量的測定 參照前人報(bào)道的甘薯綠原酸提取方法[12-13]，并進(jìn)行部分改善，具體操作如下：稱取0.2 g樣品干粉置于具塞錐形瓶中，加50%甲醇20 mL，浸提24 h后50 ℃超聲30 min，0.45 μm有機(jī)濾膜抽濾，濾液另存于50 mL具塞容量瓶中，濾渣加50%甲醇20 mL，重復(fù)超聲30 min并抽濾。合并兩次濾液，用50%甲醇定容后放于冰箱內(nèi)待用。取待測液3 mL并稀釋10倍，平行制備3 次，在327 nm處測定提取液吸光值，平行進(jìn)樣3次。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品提取液濃度，按下式計(jì)算綠原酸含量：

綠原酸含量=(x×10×V×10-3)/m×100%

x代表樣品提取液濃度(mg/mL)；10為稀釋倍數(shù)；V代表樣品提取液定容體積(50 mL)；m代表樣品質(zhì)量(g)。

1.3 樣品總RNA提取及cDNA第一鏈合成

使用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒(北京天根)提取總RNA后，用NanoDrop 2000紫外-可見分光光度計(jì)(Thermo Fisher USA)檢測RNA濃度及質(zhì)量，1%瓊脂糖電泳檢測RNA完整性。所有樣品提取的總RNA OD260nm/OD230nm值為1.9～2.1，OD260nm/OD280nm為1.9～2.0，質(zhì)量濃度為360～650 ng/μL，且28S、18S帶型整齊，無拖尾。取1 μg RNA作為模板，使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara)反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA， -20 ℃保存。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)已提交的甘薯綠原酸合成相關(guān)酶基因的cDNA序列，IbPAL1(GenBank：MN823653)、IbPAL2(GenBank：D78640.1)、IbC4H(GenBank：GQ373157.2)、Ib4CL(GenBank：AB469557.1)、IbHCT(GenBank：AB035183.1)、IbC3H(GenBank：MT792533)、IbHQT(GenBank：AB576769.1)和IbUGCT(GenBank：AB909370.1)，利用GenScript網(wǎng)站(https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool)在線設(shè)計(jì)qRT-PCR引物[11]。引物片段長度80～150 bp，Tm值52～ 60 ℃，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見表2。

表2 qRT-PCR引物序列Table 2 Gene-specific primers used for gene expression analysis

1.5 甘薯綠原酸合成途徑相關(guān)基因qRT-PCR分析

將反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA稀釋5倍后作為模板，利用SYBR premix Ex TaqTM(TaKaRa)試劑盒，在ABI StepOnePlus上擴(kuò)增進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。擴(kuò)增程序?yàn)? 95 ℃ 60 s 預(yù)變性；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min。qRT-PCR反應(yīng)所得的擴(kuò)增曲線均呈“S”形，循環(huán)閾值處于擴(kuò)增曲線的對數(shù)期，溶解曲線均表現(xiàn)為單峰。以IbTublin基因的表達(dá)量作為內(nèi)參，計(jì)算出目的基因的相對表達(dá)量。樣本和內(nèi)參分別設(shè)3次重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

甘薯綠原酸合成酶基因的相對表達(dá)量計(jì)算采用2-△△CT法[14]。采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(P<0.05為顯著水平)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型甘薯品種可食用部位綠原酸含量變化

結(jié)果表明(圖1)，6個品種的莖尖綠原酸含量均高于其儲藏根中的，莖尖中綠原酸含量平均為1.248%，儲藏根中平均為0.281%，差異極顯著。同一類型甘薯品種之間，莖尖中綠原酸含量高的品種其儲藏根中含量相對較低：如在葉菜用型甘薯品種中，‘寧菜薯1號’的莖尖綠原酸含量最高，但其儲藏根中的最低；鮮食型甘薯品種中結(jié)果與此類似。

相同部位綠原酸含量在不同品種之間差異顯著，‘寧紫薯4號’的儲藏根中綠原酸含量最高，而‘蘇薯16號’的莖尖富含更多綠原酸。此外，無論在莖尖還是儲藏根，3個鮮食型甘薯的平均綠原酸含量均高于3個葉菜用型的：前者莖尖和儲藏根平均綠原酸含量分別為1.437%和0.413%；而后者的則分別為1.118%和0.150%。

2.2 甘薯綠原酸合成途徑基因在不同甘薯品種中的組織表達(dá)模式分析

在3個葉菜用型甘薯品種中，綠原酸合成相關(guān)基因均富集于莖尖表達(dá)，尤其是‘福菜薯18號’和‘福薯7-6’(圖2-A～C)。鮮食型品種中部分酶基因的表達(dá)模式出現(xiàn)差異：‘蘇薯16號’中Ib4CL相對在其儲藏根中高表達(dá)，IbC4H、IbHQT和IbUGCT雖在莖尖相對表達(dá)略高，但與儲藏根并無明顯差異(圖2-D)；‘寧紫薯1號’中IbUGCT在儲藏根中的表達(dá)量顯著高于莖尖，除Ib4CL、IbHCT和IbC3H高表達(dá)于莖尖外，其他酶基因在莖尖和儲藏根中的表達(dá)差異不顯著(圖2-E)；‘寧紫薯4號’中IbPAL2不同于其他酶基因，在儲藏根中的表達(dá)水平明顯高于莖尖(圖2-F)。此結(jié)果說明，不同品種可食用部位中綠原酸含量的差異可能與其合成相關(guān)酶基因的組織特異性表達(dá)有關(guān)。

3 討論與結(jié)論

本研究通過對國內(nèi)6個甘薯品種可食用部位的綠原酸含量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，甘薯莖尖綠原酸含量比儲藏根中更高，此結(jié)果與之前相關(guān)報(bào)道一致[15-16]。綠原酸含量在不同甘薯品種之間存在顯著差異，值得注意是，與國內(nèi)葉菜用甘薯主推品種之一的‘福菜薯18號’相比，葉菜用型品種‘寧菜薯1號’和鮮食型品種‘蘇薯16號’‘寧紫薯1號’的莖尖綠原酸含量水平均較高。此外，作為兼含花青素和胡蘿卜素的新型紫甘薯品種[17]，‘寧紫薯4號’儲藏根中的綠原酸含量在參試品種中居最高。

目前關(guān)于植物綠原酸的生物合成已有許多報(bào)道[18-21]，從不同植物中克隆鑒定出了一些相關(guān)酶基因。研究表明，綠原酸合成途徑相關(guān)酶基因的表達(dá)水平會影響綠原酸合成[11,22-25]。本研究對8個甘薯綠原酸合成途徑相關(guān)酶基因在6個不同甘薯品種中的組織表達(dá)模式分別進(jìn)行了分析，結(jié)果表明甘薯中綠原酸合成相關(guān)酶基因大多集中于莖尖表達(dá)，該結(jié)果與綠原酸在甘薯莖尖中含量較高相一致。同時，區(qū)別于3個葉菜用型品種，部分酶基因在3個鮮食型品種的組織表達(dá)差異較小，甚至集中于儲藏根表達(dá)。尤其在‘寧紫薯4號’中，IbPAL2在其儲藏根中的相對表達(dá)量顯著高于莖尖，可能與‘寧紫薯4號’儲藏根中綠原酸含量較高有關(guān)。這些結(jié)果說明，綠原酸合成途徑相關(guān)酶基因的組織表達(dá)特征很大程度上決定綠原酸在甘薯可食用部位中的積累，但具體的酶基因功能及其機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。