紫色紅曲霉磁受體IscA1的基因克隆及功能分析

黃勝男，劉應(yīng)保，張佳蘭，高夢祥

(長江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434025)

磁場在保護地球免遭高能宇宙射線的損傷方面至關(guān)重要[1]，同時，還能顯著調(diào)節(jié)地球生物的生長和代謝[1-3]，即磁致生物學(xué)效應(yīng)。過去的幾十年，大量的研究報道了動物、微生物等生物中存在磁場生物學(xué)效應(yīng)[3-7]。然而，關(guān)于生物的磁感應(yīng)機制的研究相對較少。

目前，主流的生物磁感應(yīng)機制主要包括磁顆粒介導(dǎo)磁感應(yīng)假說和隱花色素(cryptochrome，CRY)的化學(xué)自由基對磁感應(yīng)假說[1-2]。前者認(rèn)為生物磁感應(yīng)主要由特定細(xì)胞中微小磁顆粒簇(Fe3O4等)介導(dǎo)實現(xiàn)的，比如趨磁細(xì)菌的磁小體，而且該裝置在基因組上有特定的基因編碼區(qū)，比如磁小體島。在高等生物中，雖然發(fā)現(xiàn)了相關(guān)的磁顆粒，但是一直未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的編碼基因。隨后，隱花色素CRY的化學(xué)自由基對磁感應(yīng)的假說被提出。該假說基于藍(lán)光受體CRY蛋白與輔因子FAD通過光誘導(dǎo)的自由基響應(yīng)磁感應(yīng)。大量的研究結(jié)果支持該假說。近10多年來，本課題組以絲狀真菌為研究對象，發(fā)現(xiàn)了磁場的各種生物學(xué)效應(yīng)[8-15 ]。同時，通過分子生物學(xué)手段結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)，重點研究了藥食兩用的絲狀真菌紫色紅曲霉的磁感應(yīng)機制。然而在大量差異表達(dá)蛋白中，未發(fā)現(xiàn)上述磁感應(yīng)假說中的磁顆粒和CRY及其相關(guān)蛋白[16]，而是發(fā)現(xiàn)其他蛋白，比如最關(guān)鍵的是鐵硫簇(iron sulfur cluster，ISC/Fe-S cluster)生物合成系統(tǒng)中的成員蛋白Isu1、IscS、IscA1、 Grx5等。其中，IscA1是最近在果蠅(Drosophilamelanogaster)中發(fā)現(xiàn)的新的磁受體MagR[17]。IscA1在不同生物中高度保守，除了作為磁受體，該蛋白還在能量代謝、輔因子、鐵硫儲備、基因表達(dá)調(diào)控等過程發(fā)揮重要作用[1]。最近，Zhou等[18]在紅色紅曲霉(MonascusruberM7)中克隆了IscA1基因，被認(rèn)為是該菌的候選磁受體基因。由此推測， IscA1可能是紫色紅曲霉中的磁受體蛋白，該蛋白也是介導(dǎo)該菌磁感應(yīng)過程中的關(guān)鍵蛋白?；诖?，本研究采用同源克隆方法，經(jīng)PCR擴增和DNA測序獲得紫色紅曲霉的磁受體基因IscA1的編碼序列，并借助生物信息學(xué)工具初步揭示其生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 菌種和引物

所用菌種為紫色紅曲霉(MonascuspurpureusSKY219)，為長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)實驗室保藏菌種。所用引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成，具體序列見表1。

表1 所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2 主要試劑和儀器

DL5000 DNA Marker(MD102-02)，DL2000 DNA Marker(MD101-02)，2 × Phanta Master Mix(P511-01)，DNA純化試劑盒(DC301-1)，總RNA提取試劑(RNA isolater Total RNA Extraction Reagent，R401-01)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR，R223-1)購自南京諾唯贊生物科技有限公司；十六烷基三甲基溴化銨(Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide，CTAB)，氯仿，無水乙醇，異丙醇，苯酚購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

ZF-208凝膠成像系統(tǒng)為上海嘉鵬科技有限公司產(chǎn)品；C1000 TouchTM型PCR儀，PowerPac Basic型電泳儀，GelDocTM XR型凝膠成像儀為美國Bio-rad公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 紫色紅曲霉(M.purpureusSKY219)磁受體IscA1基因擴增引物設(shè)計 根據(jù)近緣種紫色紅曲霉(M.purpureusNRRL 1596)的IscA1基因序列(Monpu1_501839)[18]設(shè)計引物(表1)，擴增本研究所用紫色紅曲霉(M.purpureusSKY219)中IscA1的DNA和編碼區(qū)序列，預(yù)期擴增的長度分別為1 331和735 bp。

1.3.2IscA1的DNA擴增 基因組提取參照文獻[14]方法。以M.purpureusSKY219基因組為模板，擴增IscA1的DNA序列。PCR反應(yīng)體系為：基因組模板為1 μg，引物(IscA1F1/IscA1R1)各2 μL，2 × Phanta Master Mix 25 μL，用去離子水補足50 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s、50 ℃ 15 s、72 ℃ 45 s，30個循環(huán)； 72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對目的DNA片段純化，然后送至武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進行DNA 測序。

1.3.3IscA1的cDNA擴增 首先提取M.purpureusSKY219的總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進行擴增IscA1的編碼區(qū)序列。總RNA提取方法如下：收集培養(yǎng)6 d的菌體，在液氮預(yù)冷的研缽中速凍并充分研磨后，取適量的粉末放于含1 mL RNA提取試劑的1.5 mL無酶離心管中，充分混勻后，加入1/5體積的氯仿，混勻，靜置5 min，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清加入等體積預(yù)冷的異丙醇沉淀30 min，離心 10 min，棄上清，沉淀用75%乙醇洗滌兩次，離心 10 min，棄上清，沉淀晾干，用DEPC水溶解，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。得到總RNA之后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA。接著以cDNA為模板擴增IscA1的編碼區(qū)，反應(yīng)體系為：cDNA 1 μg，引物各2 μL，2 × Phanta Master Mix 25 μL，用去離子水補足50 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s、58 ℃ 15 s、72 ℃ 30 s，30個循環(huán)， 72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，純化目的DNA，并進行DNA測序。

1.3.4IscA1的生物信息學(xué)分析 將IscA1的編碼序列進行多序列對位排列分析搜索其保守結(jié)構(gòu)域，并構(gòu)建進化樹；預(yù)測其蛋白一級、二級、三級結(jié)構(gòu)及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)等，具體工具和使用方法見表2。

表2 所用到的分析工具和方法Table 2 Analysis tools and methods used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 IscA1的DNA擴增

根據(jù)紫色紅曲霉近緣種的IscA1基因設(shè)計引物，以M.purpureusSKY219基因組(圖1-a)為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果(圖1-b)顯示，在電泳膠的第2泳道的1 500 bp附近有1條特異性條帶，與IscA1的預(yù)期的DNA序列大小(1 331 bp)相符，即目的DNA擴增成功。DNA測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M.purpureusSKY219的IscA1基因的DNA序列與M.purpureusNRRL 1596的IscA1的基因序列的相似度為100%(覆蓋度為100%)，即兩者IscA1的DNA序列完全相同。

2.2 IscA1的cDNA擴增

以M.purpureusSKY219的總RNA(圖2-a)反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進行擴增，結(jié)果顯示(圖2-b)，在第2泳道上，750 bp附近有1條特異性條帶，與預(yù)期大小(735 bp)相符。IscA1編碼區(qū)測序與M.purpureusNRRL 1596的IscA1的編碼區(qū)完全相同，該序列經(jīng)NCBI ORFfinder分析發(fā)現(xiàn)，IscA1共編碼244氨基酸(圖3)。

2.3 IscA1保守結(jié)構(gòu)域和蛋白家族歸屬分析

將M.purpureusSKY219的 IscA1與腹黑果蠅(D.melanogaster)、紅色紅曲霉(M.ruber)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、人(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)、原鴿(Columbalivia)、斑馬魚(Daniorerio)、秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)、擬南芥(Arabidopsiathaliana)、大豆(Glycinemax)等物種的 IscA1進行多序列對位排列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M.purpureusSKY219的 IscA1與其他物種的磁受體蛋白在序列上高度相似，尤其是第172、236和238位的半胱氨酸Cys(C，星號“*”標(biāo)識)最為保守，為鐵硫簇結(jié)合位點(圖4)。

在線工具Batch CD-Search搜索保守結(jié)構(gòu)域的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M.purpureusSKY219的 IscA1與其他物種的磁受體蛋白都具有典型的Fe-S簇生物合成超家族(TIGR00049)結(jié)構(gòu)域(圖5)。

上述蛋白構(gòu)建的進化樹圖顯示，M.purpureusSKY219的 IscA1與M.ruber、S.cerevisiae真菌的磁受體 IscA1聚在一個進化枝上，同時與細(xì)菌和植物聚在另一個大的進化枝上(圖6)。

2.4 IscA1的理化性質(zhì)分析

ProParam分析的結(jié)果表明， IscA1為堿性蛋白(pI為10.05)，分子質(zhì)量為27 106 u，不穩(wěn)定系數(shù)為59.99(>40)，為不穩(wěn)定蛋白。其中絲氨酸(Ser)、精氨酸(Arg)和丙氨酸(Ala)含量最為豐富，分別占比為12.3%、9.0%和8.2%。親水性指數(shù)為負(fù)值(-0.575)，即為親水蛋白。

2.5 IscA1的親疏水性預(yù)測

Protscale的親疏水性分析發(fā)現(xiàn)，IscA1蛋白的絕大部分氨基酸的親水性數(shù)值均為負(fù)值(圖7)，與上述理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果一致，即為親水 蛋白。

2.6 IscA1的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IscA1的二級結(jié)構(gòu)元件α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈的比例分別為22.13%、2.05%、62.70%、13.11%，以無規(guī)則卷曲為主(圖8)。

2.7 IscA1的磷酸化修飾預(yù)測

Netphos 3.1預(yù)測的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IscA1在Ser、Thr和Tyr3個位點被磷酸化修飾的個數(shù)分別為26、21、13個(圖9)。表明紫色紅曲霉中的IscA1可能被其他激酶磷酸化修飾。

2.8 IscA1的三級結(jié)構(gòu)模擬

軟件SWISS-MODEL模擬的IscA1的三級結(jié)構(gòu)如圖10所示。IscA1以細(xì)長嗜熱聚球藻(ThermosynechococcuselongatusBP-1)為模板，二者的相似度為37%，覆蓋度為43%。模擬結(jié)果顯示，三維結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲和β-折疊為主，還有比較典型的α-螺旋(圖10)。

2.9 IscA1的亞細(xì)胞定位分析

Predict Protein預(yù)測的結(jié)果顯示，IscA1主要定位于線粒體(圖11)。同時WoLF PSORT預(yù)測的亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，IscA1也是定位于線粒體，二者預(yù)測結(jié)果一致。

2.10 IscA1的互作蛋白預(yù)測

String預(yù)測的互作蛋白的結(jié)果顯示(圖12)，IscA1可以與Fe-S簇裝配輔助蛋白IscA2(ANIA_05953)和谷氧還蛋白Grx 5(AN4304.2)發(fā)生非特異性結(jié)合。而且，IscA1和Grx可以被分子伴侶DnaJ蛋白激活(AN4304.2)。Grx 5、DnaJ和IscA1共同參與Fe-S簇的生物合成和傳遞過程，因此，在Fe-S簇組裝和傳遞過程中會發(fā)生不同的互作[18]。PPA-Pred預(yù)測的蛋白間親和力的結(jié)果顯示，IscA1與D.melanogaster的藍(lán)光受體蛋白CRY之間的親和力較強(自由能△G=-45.99 kJ/mol，解離常數(shù)Kd=1.03e-8mol)，而與絲狀真菌構(gòu)巢曲霉的藍(lán)光受體LreA、LreB均有更強的親和力(IscA1/LreA:△G= -55.52 kJ/mol，Kd=1.9e-10mol；IscA1/LreB:△G=-42.91 kJ/mol，Kd=3.04e-8mol)，這些結(jié)果說明磁受體IscA1與不同的藍(lán)光受體蛋白(CRY、LreA、LreB)均可以互作，與新近報道的磁受體IscA1-藍(lán)光受體CRY復(fù)合物共同感應(yīng)磁場的理論相符[16]。

3 結(jié)論與討論

IscA1是Fe-S簇生物合成系統(tǒng)中的必需蛋白，在各個物種中高度保守[1]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白是紫色紅曲霉磁感應(yīng)中的關(guān)鍵蛋白。最新的研究揭示，IscA1是新的磁受體[16]。因此，本研究基于同源克隆原理，通過PCR擴增和DNA測序，獲得M.purpureusSKY219的IscA1編碼區(qū)序列，該基因編碼的蛋白共有244個氨基酸。進一步的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，IscA1與真菌的同源蛋白親緣關(guān)系較近。該蛋白具有3個最保守的Cys(172、236和238位)，并具有典型的Fe-S簇生物合成超家族的保守結(jié)構(gòu)域，這些都是已報道的磁受體IscA1的典型特征[1]。IscA1為堿性蛋白和親水蛋白，二級結(jié)構(gòu)組成與已報道的M.ruberM7的IscA1蛋白的二級結(jié)構(gòu)高度相似[18]，均以不規(guī)則卷曲為主，其次是α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角。模擬的IscA1三級結(jié)構(gòu)則與解析的T.elongatus的IscA1的晶體結(jié)構(gòu)具有較高的相似度，具有典型的α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角[19]。IscA1具有60個可能的磷酸化修飾位點，主要定位于線粒體。蛋白互作的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IscA1可被DnaJ激活，并和IscA2、Grx5存在互作關(guān)系。在線粒體Fe-S簇生物合成過程中，F(xiàn)e2+和S原子在支架蛋白IscU上組裝成初生的[2Fe-2S]簇，然后在DnaJ、HSP等蛋白的協(xié)助下，將簇傳遞給載體Grx5，然后在IscA1、IscA、IBA57等蛋白復(fù)合物的幫助下，將Fe-S “交付”給脫輔基蛋白[19-20]。因此，在Fe-S的組裝和傳遞過程中，IscA1會和上述蛋白發(fā)生相互作用。最新的研究提出，磁受體IscA1和藍(lán)光受體CRY形成蛋白復(fù)合物賦予果蠅等生物磁感應(yīng)能力[17]，本研究也發(fā)現(xiàn)，IscA1與不同藍(lán)光受體(CRY、LreA、LreB)之間均存在較強的親和力，表明IscA1在紫色紅曲霉中可能與未知的藍(lán)光受體蛋白形成復(fù)合物賦予該菌磁感應(yīng)能力。研究結(jié)果為全面揭示磁受體IscA1在紫色紅曲霉磁感應(yīng)機制中的功能奠定基礎(chǔ)。